RICERCA ITALIANA     

Nuove frontiere nella stratificazione delle leucemie acute linfoidi (LAL): integrazione tra citogenetica non-convenzionale, genomica e post-genomica

Università degli Studi di Roma "La Sapienza"

Abstract

La leucemia acuta linfoide (LAL) rappresenta una delle neoplasie più frequenti in età pediatrica, mentre è più rara nell'adulto. La prognosi differisce notevolmente tra le due casistiche di pazienti: nei bambini, la sopravvivenza libera da ricaduta a 5 anni dalla diagnosi è maggiore del 75%, mentre i risultati sono assai più insoddisfacenti negli adulti. La migliore percentuale di sopravvivenza nei bambini ha spinto molti ricercatori a tentare di comprendere quali, tra i piccoli pazienti, potrebbero giovare di trattamenti chemioterapeutici meno intensivi; un parametro fondamentale che è stato introdotto è la valutazione della Malattia Residua Minima (MRM). Questo marcatore "surrogato" oltre a misurare l'efficacia di trattamenti offre l'opportunità unica di formulare domande scientifiche con potenziale applicazione clinica. In particolare, la MRM permette di identificare sottogruppi con bassa risposta precoce alla terapia in assenza di altri fattori prognostici sfavorevoli, oppure sottogruppi con una risposta precoce molto rapida ed efficace, con buona sopravvivenza dei pazienti, anche in sottogruppi caratterizzati da lesioni genetiche a prognosi sfavorevole.
In entrambi i gruppi di pazienti vi è ancora il bisogno di comprendere appieno quali siano i meccanismi che portano alla trasformazione leucemica. Tanto nei bambini che negli adulti con LAL a derivazione del linfocita B (LAL-B) è stato possibile identificare aberrazioni molecolari ricorrenti che si associano alla trasformazione neoplastica. Tuttavia, fatta eccezione per il riarrangiamento BCR/ABL, che è di per sè causa di malattia, in tutti i rimanenti scenari non è ancora chiaro quali siano le alterazioni aggiuntive che concorrono allo sviluppo della malattia.
Nelle LAL a cellule T (LAL-T), fino a pochi anni or sono la comprensione dei meccanismi di trasformazione era assai esigua con poche segnalazioni relative alla presenza di aberrazioni molecolari ricorrenti. Negli ultimi 5 anni, anche in questo sottogruppo di pazienti,vi è stato un fiorire di nuove acquisizioni biologiche che stanno portando a rivedere completamente i dogmi relativi a questa patologia; contemporaneamente, l’analisi del profilo genico sta consentendo di identificare sottogruppi precedentemente non identificati. E’ quindi chiaro come l'integrazione di tutte le informazioni di genomica, proteomica e dell’analisi dei miR faciliterà l'identificazione di profili e meccanismi alternativi che permetteranno una classificazione più specifica della LAL ed il riconoscimento di geni soppressori di tumore o oncogeni che contribuiscono alla patogenesi ed alla prognosi della LAL.
Le 4 unità di ricerca afferenti a questo ambizioso progetto presentano caratteristiche ottimali per cercare di risolvere questi quesiti per 3 ragioni principali: 1) tutti i gruppi coordinano e/o fanno parte di protocolli multicentrici che operano su scala nazionale per l’arruolamento di bambini (AIEOP, Associazione Italiana di Ematologia e Oncologia Pediatrica) e adulti affetti da LAL (GIMEMA, Gruppo Italiano Malattie EMatologiche dell’Adulto); 2) complessivamente, dispongono d tecnologie all’avanguardia, che dovrebbero consentire l’identificazione di nuovi meccanismi patogenetici; 3) da anni collaborano attivamente.
Più nel dettaglio, due gruppi sono ampiamente coinvolti nello studio del profilo di espressione genica e dei miR, un gruppo è impegnato attivamente nello studio della MRM e nello studio degli SNPs, e un altro gruppo è proficuamente impegnato nello studio della citogenetica non convenzionale: FISH, CGH, array-CGH e analisi mutazionale in DHPLC.
In questo progetto, nell’ambito della casistica pediatrica, ci proponiamo di:
A) Migliorare la classificazione dei pazienti con LAL mediante la caratterizzazione di piccole aberrazioni cromosomiche e concomitanti alterazioni di espressione genica.
B) Valutare se la diversa clearance della MRM è sostenuta da specifici profili genici e/o aberrazioni cromosomiche identificate con gli SNPs.
C) Utilizzare l'analisi dei profili di espressione genica per identificare i processi biologici che vengono influenzati dalle aberrazioni secondarie.
Nell’ambito dei pazienti adulti, ci proponiamo di:
D) Valutare in dettaglio il profilo di espressione genica di pazienti adulti affetti da LAL-T e, in parte, da LAL-B all'esordio di malattia.
E) Correlare i risultati del profilo genico con i dati di citogenetica non-convenzionale; verranno inoltre effettuati studi dello stato mutazionale di un set di geni.
F) Definire l'impatto clinico di queste nuove acquisizioni.
G) E' prevista, inoltre, nelle LAL-B e nelle LAL-T la caratterizzazione del profilo dei miR, piccole molecole di RNA non-codificanti, che degradano e/o reprimono l'espressione di geni targets.
Infine, ci proponiamo di:
H) Paragonare i profili dei bambini, degli adolescenti e degli adulti per la comprensione delle apparenti discrepanze nella risposta al trattamento tra le coorti di pazienti. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Roberto Foà Università degli Studi di ROMA "La Sapienza"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Lo studio della leucemia linfoide acuta (LAL) ha fornito negli ultimi venti anni risultati estremamente proficui. Infatti, gli studi effettuati su tale patologia hanno consentito di identificare lesioni molecolari associate a questa neoplasia in maniera ricorrente, i.e. BCR/ABL, i riarrangiamenti del gene ALL1, E2A/PBX e TEL/AML1. Come premessa generale, vanno tenuti in considerazione tre punti fondamentali: 1) l’incidenza di queste aberrazioni varia notevolmente nel bambino e nell’adulto; 2) l’identificazione delle suddette lesioni é stata di più frequente riscontro nelle LAL-B, mentre nelle LAL-T, fino a pochi anni or sono, i meccanismi sottostanti la trasformazione maligna non erano noti: basti pensare che, fino al 2004, in circa l’80% dei pazienti affetti da LAL-T non era possibile definire una lesione genetico-molecolare specifica; 3) l’impatto di queste lesioni sull’andamento clinico é ben stabilito, con alcune lesioni, come ad esempio BCR/ABL, strettamente associate ad un andamento clinico particolarmente infausto (minore percentuale di risposta alla terapia di induzione ed alto rischio di recidiva), ed altre, come TEL/AML1, che viene riscontrata, con rarissime eccezioni, solo nelle casistiche pediatriche, che sono associate ad un andamento clinico particolarmente favorevole. Queste acquisizioni hanno rappresentato un substrato ideale per definire dei criteri di stratificazione dei pazienti e, in ultimo, per definire protocolli chemioterapeutici più o meno aggressivi, che in alcuni casi prevedono l’impiego di procedure trapiantologiche, mentre in altre circostanze consentono di ridurre l’intensità del trattamento. Inoltre, negli ultimi dieci anni, é diventato di fondamentale importanza lo studio della malattia residua minima (MRM), che permette di stratificare ulterioremente i pazienti: va tuttavia ricordatola valutazione di questo parametro etro é impiegato routinariamente nelle casistiche pediatriche, mentre negli adulti introduzione é di più recente, ed il ruolo effettivo di questo criterio va ancora definito con certezza.
Sebbene lo stato dell’arte ed il background biologico della LAL - e in più generale dell’oncoematolgia - siano molto più avanzati che nella maggior parte dei tumori solidi, molti sono i quesiti ancora aperti. Infatti 1) in circa il 50% delle LAL-B e nella maggior parte delle LAL-T, il meccanismo di trasformazione non é stato ad oggi identificato; 2) anche nei casi in cui vi siano delle aberrazioni molecolari definite, l’evento - o gli eventi - che porta/no allo sviluppo della leucemia non é/sono noto/i; 3) non é conosciuto il contributo delle potenziali lesioni aggiuntive; 4) non sempre é stato possibile definire quali lesioni molecolari siano mutualmente esclusive o, al contrario, siano complementari; 5) non é altresì nota la ragione per cui i pazienti con la stessa lesione molecolare possano talvolta presentare andamenti clinici diversi; 6) non si sa se altre entità genetiche, come ad esempio i miR, possano svolgere un ruolo nella leucemogenesi e, laddove essi contribuiscano, i meccanismi di deregolazione non sono conosciuti.
Pertanto, gli obiettivi che ci prefiggiamo nel contesto di questo progetto che vede quattro unità operare in sinergia sono, per le casistiche pediatriche, mirati a:
A) Identificare, tramite l’impiego degli SNP arrays, microlesioni e/o microamplificazioni cromosomiche non precedentemente riconosciute; questa parte del progetto verrà svolta tanto in campioni che presentano alterazioni molecolari note che nei casi in cui non sono state riconosciute lesioni citogenetico-molecolari maggiori.
In contemporanea, avvalendosi anche della presenza di un database di profilo di espressione genica già esistente e che comprende circa 400 casi di LAL pediatriche (studio MILE, Microarray Innovations in LEukemia), si cercherà di comprendere se le lesioni identificate inducono un'alterazione del profilo, sia in termni di “gene dosage effect” che di deregolazione di funzioni cellulari, come l’apoptosi, il ciclo cellulare, il differenziamento, ecc.
B) Valutare, mediante il profilo di espressione genica, possibili cambiamenti del profilo di espressione genica nei processi cellulari più importanti(vedi sopra), a prescindere dalle alterazioni cromosomiche sovramenzionate.
C) Migliorare le proposte di classificazione e stratificazione correntemente utilizzate, mediante correlazione con le acquisizioni fornite dallo studio degli SNP e dai cambiamenti dei profili genici.
D) Valutare se i livelli di clearance della MRM (risposta precoce o tardiva) siano sostenuti dalla presenza di microaberrazioni cromosomiche e/o profili genici specifici.

Nell’ambito dei pazienti adulti, ci prefiggiamo di:
E) Valutare in dettaglio il profilo di espressione genica nelle LAL-B e nelle LAL-T. Lo sforzo verrà concentrato sull’analisi delle LAL-T, proprio perchè in questo gruppo di pazienti la conoscenza di base é più esigua ed anche perchè risultati preliminari evidenziano la presenza di numerosi sottogruppi, non identificati precedentemente, che potrebbero rivestire notevole importanza nella comprensione dei processi di leucemogenesi. Successivamente, l’analisi verrà focalizzata sui pazienti affetti da LAL-B che non presentano alterazioni molecolari note. Anche in questo contesto, ci avvaleremo della presenza del database del MILE, che comprende circa 300 casi di LAL dell’adulto.
F) Valutare le LAL-T e le LAL-B, mediante la combinazione di una metodica di FISH comprendente numerose sonde (“multiplex FISH”), l’array-CGH e lo stato mutazionale di alcuni geni, al fine di stabilire l’incidenza, l’importanza patogenetica e l’eventuale esclusività delle lesioni identificate.
G) Correlare i risultati del profilo genico con quelli ottenuti dalla citogenetica non convenzionale (punti E + F).
H) Definire l’impatto clinico delle lesioni identificate: ciò sarà possibile soprattutto in virtù del fatto che i pazienti analizzati sono arruolati in protocolli clinici operanti su scala nazionale ed é presente un database che raccoglie le informazioni di tutti i casi. Verrà valutata sia la correlazione delle caratteristiche cliniche all’esordio di malattia (conta dei globuli bianchi, coinvolgimento del SNC, presenza di masse, ecc) che la risposta alla terapia di induzione ed il follow-up clinico a lungo termine.
I) Caratterizzare, sia nelle LAL-B che nelle LAL-T, il profilo dei miR, piccole molecole non-codificanti coinvolte in numerose funzioni cellulari, che svolgono la propria azione reprimendo e/o degradando i propri geni targets. Laddove possibile, non ci limiteremo ad identificare i miR differenzialmente espressi nei vari sottogruppi di LAL, ma cercheremo anche di identificare i geni bersaglio di queste piccole molecole e di convalidare i risultati in modelli sperimentali.
Infine, ci prefiggiamo di:
L) Paragonare i profili genici, nell’ambito dei vari sottogruppi, dei bambini, degli adolescenti, dei giovani adulti, degli adulti e degli anziani con il fine di identificare set di geni che possano contribuire al diverso andamento clinico nelle due coorti. Come menzionato, questo punto é reso possibile dal fatto che due unità afferenti a questo progetto di ricerca partecipano allo studio internazionale MILE. <<<

Risultati parziali attesi

Questo progetto risulta essere altamente fattibile perchè tutte le unità afferenti impiegano routinariamente, e con ottimi risultati, tecnologie all’avanguardia, come ad esempio gli arrays per il profilo di espressione genica, l’array-CGH, gli SNP array ed un gran numero di metodiche per lo studio della citogenetica non convenzionale.
Nell’ambito della casistica pediatrica, i risultati attesi sono:
1) Identificazione, mediante l’impiego di tecnologie ad alta risoluzione come gli SNP ed array-CGH, di aberrazioni genomiche secondarie finora non identificate, che potrebbero rivestire importanza prognostica e patogenica per la stratificazione delle LAL.
2) Revisione e nuova analisi, in virtù della presenza e/o assenza delle lesioni identificate con gli SNP ed array-CGH, dei risultati del profilo di espressione genica, al fine di comprendere la/e ragione/i della presenza di sottogruppi che sono identificati con l’analisi unsupervised e supervised, che attualmente non sono correlabili con nessuno dei parametri biologici di nostra conoscenza.
3) Correlazione dei risultati di MRM con quelli ottenuti dal profilo di espressione genica, con gli SNP e l’array-CGH.
4) Analisi del profilo dei miR per: 1) rilevare direttamente la variazione dei livelli di trascritti/microRNA in regioni delete o amplificate, e 2) identificare variazioni nell’espressione genica di geni indirettamente colpiti da alterazioni genomiche ricorrenti o dall’espressione differenziale di microRNA.
5) Valutare le alterazioni delle vie di segnale delle cellule a seguito dell’esposizione a farmaci terapeutici potrebbero indicare quali molecole sono colpite dal farmaco. Queste potrebbero rappresentare una nuova categoria di biomarcatori nelle LAL e tali informazioni potrebbero contribuire alla comprensione dei meccanismi di resistenza ai farmaci, aprendo potenzialmente nuove prospettive verso terapie più mirate per le leucemie.
6) Infine, come scopo riassuntivo del corrente progetto, ci aspettiamo di identificare nuovi marcatori genetici per meglio stratificare i pazienti in gruppi di rischio più definiti, così da poter potenzialmente identificare nuovi sottogruppi con specifico rischio di ricaduta clinica e nuovi geni candidati per specifiche nuove terapie.

Nell’ambito dei pazienti adulti affetti da LAL, ci proponiamo di:
7) Effettuare un'analisi completa del genoma per identificare gli eventi molecolari che concorrono, in ogni singolo caso, a determinare il fenotipo leucemico.
8) Creazione di "FISH multiplex" per l'analisi simultanea di un panel di 30 sonde, da impiegare in ogni singolo caso.
9) Utilizzo della DHPLC per l'analisi mutazionale di geni noti ed eventuale analisi di nuovi geni candidati che emergeranno dal progetto.
10) Identificazione di sbilanciamenti genomici criptici (usando micro-array CGH e SNPs) e loro associazione con gli altri eventi molecolari.
11) Elaborazione di algoritmi diagnostici che integrino le diverse tecnologie e dedicati alla diagnosi di sottogruppi molecolari di LAL-T e LAL-B.
12) Identificazione di caratteristiche clinico-prognostiche specifiche associate con i sottogruppi genomici così identificati.
13) Identificazione di nuovi sottogruppi di LAL-T, tramite l’impiego del profilo di espressione genica, come evidenziato da risultati preliminari che indicano chiaramente che sono presenti numerosi sottogruppi precedentemente non riconosciuti. In maniera simile, identificare sottogruppi , anche nelle LAL-B.
14) Tentare di identificare le lesioni molecolari che sottendono al profilo di espressione genica osservato, mediante l’integrazione con i risultati di citogenetica non convenzionale.
15) Comprendere se questa classificazione “gene-expression based” potrebbe essere prognosticamente rilevante.
16) Come già detto per i bambini affetti da LAL, lo scopo finale è quello di identificare nuovi marcatori genetico-molecolari per una migliore stratificazione dei pazienti, e di identificare nuovi sottogruppi di pazienti con un diverso rischio di resistenza al trattamento,recidiva di malattia, e diverso follow-up a lungo termine.
17) Identificare nuovi geni che potrebbero essere impiegati nel disegno di approcci terapeutici mirati.
18) Definire, come per i bambini, il ruolo dei miR, la loro espressione differenziale ed i loro potenziali geni bersaglio.
Infine, per coronare lo sforzo congiunto di tutte le Unità proponenti, ci aspettiamo di:
19) Identificare geni, che, nell’ambito di sottogruppi ben definiti (come ad esempio pazienti che presentano alterazioni molecolari note, e/o quelli che hanno caratteristiche immunofenotipiche ben definite) risultano differenzialmente espressi tra le LAL del bambino, dell'adolescente, del giovane adulto, dell'adulto e dell'anziano. Questi geni potrebbero essere importanti per comprendere il differente andamento clinico nella diverse fasce di età.
20) Identificare anomalie cromosomiche, ed in particolar modo microanomalie cromosomiche fino ad oggi non riconosciute, che presentano una diversa incidenza tra adulti e bambini e potrebbero rivestire significato prognostico.
21) Infine, paragoneremo il profilo di espressione dei miR dei bambini e degli adulti, per tentare di comprendere se queste piccole molecole possano contribuire in maniera differente all’insorgenza della malattia nelle due fasce di età.
22) Pubblicazioni di lavori scientifici su riviste nazionali ed internazionali e presentazione dei risultati ottenuti a congressi internazionali. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La leucemia acuta linfoide (LAL) è una malattia eterogenea da un punto di vista biologico e clinico; inoltre, l’incidenza di questa patologia è assai diversa tra bambini e adulti. L'eterogeneità clinica è correlata con la presenza di alterazioni genetiche ricorrenti nelle cellule leucemiche e queste sono utilizzate per la sottoclassificazione delle leucemie acute e per la stratificazione dei pazienti. I test diagnostici per riconoscere le sottoclassi di leucemia si sono evoluti seguendo diverse linee, tra cui la citometria a flusso, il DNA-index, l'analisi del cariotipo e della FISH con sonde per le traslocazioni ricorrenti, e la biologia molecolare – con l’impiego di metodiche di RT-PCR e PCR quantitativa (Q-PCR) per l'identificazione e la quantificazione di riarrangiamenti molecolari. Questi metodi hanno permesso fino ad oggi di distinguere le seguenti sottoclassi nelle LAL a derivazione B (LAL-B): B-LAL matura con t(8;14), pro-B-LAL con t(11q23)/MLL, c-LAL/pre-B-LAL con t(9;22), LAL con t(12;21), LAL con t(1;19), LAL con cariotipo iperdiploide, c-LAL/pre-B-LAL senza aberrazioni. L’incidenza di queste aberrazioni varia notevolmente tra bambino e adulto, e questa è forse una delle concause che contribuiscono ad un diverso andamento clinico: infatti la LAL-B con t(9;22) è molto più frequente nell’adulto (ed ancor più nell'anziano), così come la LAL-B con riarrangiamenti del gene ALL1 (MLL) – ad eccezion fatta dei neonati -; al contrario, la t(12;21) si riscontra pressochè esclusivamente in casistiche pediatriche ed i casi con cariotipo iperdiploide sono più spesso identificati nei piccoli pazienti. Le LAL-T rappresentano nelle casistiche pediatriche e dell'adulto circa il 25% di tutte le LAL. In questo gruppo di leucemie, la conoscenza biologica era precedentemente piuttosto esigua ed il/i meccanismo/i sottostante/i la trasformazione non era/no noto/i; basti, infatti, pensare che nel 2004 venivano riportati dati genetici nelle LAL-T in non più del 20% dei casi, sia negli adulti che nei bambini.
Attraverso lo sviluppo e l'utilizzo di tecnologie più avanzate - in particolare i microarrays (espressione genica, SNP e array-CGH) - lo scenario sta modificandosi, permettendo, oggi, la possibilità di identificare anche microaberrazioni presenti nei tumori.
Nelle LAL-B, oltre alle alterazioni cromosomiche note, si ritiene che altre aberrazioni secondarie abbiano un'importanza clinica nelle leucemie acute. Per esempio il gene di fusione ETV6/RUNX1 non è sufficiente da solo per indurre la trasformazione leucemica ed altre alterazioni genetiche sono state evidenziate in più dell'80% delle LAL con t(12;21), tra cui la più comune è la delezione del gene normale ETV6 presente nel 70% dei casi studiati. Altre aberrazioni frequenti includono le duplicazioni del cromosoma 21 normale (20%) o derivativo (10%), le delezioni del 6q (18%) e le delezioni del 9p (7%). La maggior parte delle anomalie secondarie sono state rilevate attraverso l'analisi del bandeggio dei cromosomi o, in alcuni casi, con FISH multicolore. Inoltre, un'analisi su larga scala di tutto il genoma di 242 pazienti pediatrici LAL, usando arrays per il polimorfismo ad alta definizione di singoli-nucleotidi (SNP) ed il sequenziamento del DNA genomico, ha rivelato nel 40% dei casi LAL-B la presenza di delezioni, amplificazioni, mutazioni puntiformi e riarrangiamenti strutturali in geni che codificano per i principali regolatori dello sviluppo e della differenziazione del linfocita B. Il gene PAX5 è risultato essere il bersaglio più frequente di tali mutazioni, essendo alterato nel 31.7% dei casi. Risultati preliminari di uno dei gruppi proponenti, ottenuti mediante l’analisi degli SNP arrays su 29 pazienti pediatrici con LAL senza alterazioni molecolari note, ha evidenziato che l'83% dei pazienti ha mostrato la presenza di anomalie genomiche tra cui la delezione CDKN2A/9p21 (24%), la delezione TEL/12p13 (10%) e l'amplificazione del cromosoma 21 (iAMP21) (10%). Con un nuovo approccio metodologico abbiamo integrato il numero delle copie dei geni amplificati con i dati di espressione genica ed identificato la variazione nell'espressione dei geni direttamente o indirettamente coinvolti. SMAD1 è emerso come gene down-regolato nei casi di delezione p16; JAG1, codificante per il ligando Jagged1 del recettore Notch, era up-regolato nei casi con delezione di TEL. Altre anomalie identificate recentemente includono, nelle LAL-B a cariotipo iperdiploide la trisomia dei cromosomi 4, 10 e 17, che determinano una prognosi favorevole, il coinvolgimento dei geni della famiglia CEBP, incluso CEBPA, come partners delle IgH in traslocazioni delle LAL-B e, per analogia con i meccanismi descritti nei linfomi non-Hodgkin, anche nelle LAL-B l'oncogene MYC può essere attivato da geni diversi dalle IgH; infine, sono state recentemente descritte amplificazioni del cromosoma 21.
A causa dei limitati livelli di risoluzione delle metodiche impiegate in precedenza, le piccole anomalie a livello genotipico, con possibile importanza prognostica e patogenetica, erano rimaste finora non identificate.
Anche nelle LAL-T lo scenario sta drasticamente cambiando e nuove lesioni genetico-molecolari stanno emergendo; le nuove tecnologie oggi a disposizione sono in grado di fornire un'informazione genetica in oltre l'80% dei casi.
Tra le lesioni genetiche identificate, è importante menzionare il riarrangiamento CALM/AF10, le mutazioni a carico di NOTCH1 ed i riarrangiamenti di ABL1. E' importante sottolineare che queste aberrazioni sono di più difficile riscontro con metodiche di citogenetica convenzionale e, proprio per questo motivo, il riconoscimento delle stesse è risultato più difficoltoso. Contestualmente, il profilo di espressione genica ha fornito risultati complementari: il primo studio che ha analizzato la genomica delle LAL-T ha evidenziato che l'iperespressione genica di alcuni oncogeni noti, i.e. LYL, HOX11 (o TLX1) e TAL1, determina cambiamenti nel profilo di espressione genica assolutamente specifici, che peraltro correlano anche con i diversi stadi maturativi del linfocita T; interessante notare, inoltre, che in questo primo studio era stato possibile identificare un nuovo sottogruppo - con caratteristiche simili ma non identiche a quello comprendenti i pazienti HOX11 - che è caratterizzato dall'iperespressione del gene HOX11L2 (o TLX3). Successivamente, l'analisi del profilo genico, effettuato su cellule primarie, ha consentito di evidenziare un pattern di espressione genica nei casi che presentano il riarrangiamento CALM/AF10: questi casi sono caratterizzati dall'iperespressione di geni della famiglia degli Homeobox, ed in particolar modo della famiglia degli HOXA. Questo risultato riveste importanza, poiché un profilo simile è di costante riscontro nei pazienti con riarrangiamento di ALL1, ad indicare quindi che diverse alterazioni vanno ad attivare gli stessi pathways, che quindi potrebbero svolgere un ruolo fondamentale nella trasformazione leucemica. La genomica è stata impiegata anche per evidenziare pazienti con riarrangiamenti del gene ABL1 che esprimono livelli estremamente elevati di ABL e di conseguenza sono facilmente identificabili. Anche in questo caso, va sottolineata l'importanza dell'integrazione con le altre metodiche che servono a confermare la presenza dei riarrangiamenti responsabili dell'overespressione. Infine, mediante il profilo di espressione genica è stato definito, in linee cellulari, il meccanismo di azione del gene NOTCH1, che deregola l'espressione di MYC e HES1, i quali down-modulano PTEN, che a sua volta attiva AKT, il quale, in ultimo, induce un vantaggio proliferativo e di conseguenza la trasformazione leucemica. Infine, risultati preliminari, ottenuti con lo studio del profilo genico da parte di un gruppo afferente a questo progetto di ricerca, evidenziano che mediante un’analisi unsupervised effettuata su un numero relativamente ampio di pazienti adulti affetti da LAL-T è possibile evidenziare numerosi sottogruppi nell’ambito di questa leucemia, confermando quindi che vi è l’esigenza di comprendere i meccanismi sottostanti alla patologia stessa.
Riassumendo le nozioni di recente identificazione, dal punto di vista genetico due importanti peculiarità delle LAL-T sono: 1) l'alta prevalenza di alterazione dell'espressione di uno dei partner come conseguenza di traslocazioni reciproche; 2) la concomitanza, in ogni singolo caso, di due o più riarrangiamenti a carico di geni appartenenti a gruppi funzionalmente diversi. Una completa caratterizzazione delle microdelezioni e duplicazioni emergenti dall'analisi degli sbilanciamenti dell'intero genoma, che si stimano dell'ordine di almeno 2-3 sbilanciamenti per ogni LAL-T, non è ancora disponibile e costituisce una delle sfide per la genomica a cui il presente progetto intende contribuire. L'identificazione dei diversi riarrangiamenti molecolari presenti simultaneamente nel blasto leucemico consente di delineare la via patogenetica specifica di ogni LAL-T, presupposto indispensabile per disegnare nuovi trattamenti mirati, oltre che per identificare nuovi marcatori di malattia residua minima (MRM) rappresentata dalla persistenza della lesione molecolare. Esemplificativo in tal senso è l'impiego clinico, già in sviluppo, di inibitori delle gamma-secretasi nelle LAL-T positive per NOTCH1.
Un altro campo che si è notevolemente sviluppato è la valutazione della MRM, che viene routinariamente impiegata nelle casistiche pediatriche, dove permette di identificare sottogruppi con bassa risposta precoce alla terapia in assenza di altri fattori prognostici sfavorevoli, oppure sottogruppi con una risposta precoce molto rapida ed efficace, con buona sopravvivenza dei pazienti, anche in sottogruppi caratterizzati da lesioni genetiche a prognosi apparentemente sfavorevole. Tale metodica sta attualmente sviluppandosi anche nelle casistiche adulte.
Verosimilmente, l’identificazione di nuove lesioni porterà al riconoscimento e quindi all’impiego di nuovi marcatori che verranno integrati nell’analisi della MRM, e consentirà altresì di correlare la clearance precoce e/o tardiva del clone neoplastico con le nuove acquisizioni genomiche.
Un altro campo che sta estendendosi e che porterà senza dubbio all’acquisizione di ulteriori informazioni potenzialmente utili nella classificazione delle LAL e possibilmente nella stratificazione prognostica di queste patologie, è l'analisi dei miR, piccole molecole di RNA non-codificanti, conservate nelle diverse specie, il cui ruolo è la repressione e/o la degradazione dei geni bersaglio. Sebbene sia ormai noto che i miR svolgono diverse funzioni nell'emopoiesi e nel differenziamento delle filiere mieloidi e linfoidi, e sia altresì chiaro come questi piccoli trascritti siano fondamentali nello sviluppo delle leucemie acute mieloidi (LAM) e della leucemia linfatica cronica (LLC), il ruolo dei miR nella LAL, sia B che T, non è ancora stato chiaramente elucidato. Ad oggi, solo uno studio ha evidenziato differenti livelli di espressione di miR nelle LAL, ma non è chiaro né quali siano le funzioni né i targets degli stessi. E' d'uopo ricordare che due delle unità prponanti sono già coinvolte nello studio del profilo dei miR.

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