RICERCA ITALIANA     

Danno ossidativo e nitrosativo di proteine mitocondriali in modelli di senescenza cellulare ed in soggetti con demenza di Alzheimer: studio preclinico di forme naturali e nuovi analoghi di sintesi della vitamina E.

Università degli Studi di Perugia

Abstract

Il mitocondrio è un bersaglio sensibile al danno da specie reattive dell’ossigeno (ROS) e dell’azoto (RNS) con possibile rilevanza nei processi di senescenza cellulare (teoria mitocondriale dell’invecchiamento) e nella patogenesi di patologie età-relate, quali malattia di Alzheimer (AD) ed il Mild Cognitive Impairment (MCI). L’attenzione della ricerca è attualmente puntata sullo studio di modificazioni post-trascrizionali (PTM) di proteine che svolgono funzioni essenziali nel mitocondrio.
Scopo di questo progetto è lo studio di PTMs di proteine mitocondriali sia “in vitro” , in modelli di invecchiamento cellulare, sia “in vivo”, nelle cellule periferiche di soggetti MCI e AD. Verrà allo stesso tempo valutato il ruolo protettivo di isoforme naturali ed analoghi di sintesi della vitamina E.
In particolare tre fasi del progetto affronteranno i seguenti aspetti:
1.caratterizzazione di biomarcatori del danno di proteine mitocondriali “in vitro”, in modelli cellulari di senescenza replicativa e da stress. Verranno utilizzati modelli di invecchiamento cellulare IMR-90 (fibroblasti umani) e NIH 3T3 (fibroblasti di topo). Saranno anche disponibili linee di cellule endoteliali HCAEC e HUVEC, neuroblastomi,gliomi,e fibroblasti NHLF. Verranno studiate l’espressione e l’attività di proteine sensibili al danno da ROS/RNS, quali l’aconitasi mitocondriale (mAcn, enzima del ciclo di Krebs), la citocromo-c-ossidasi (Cyt-c-ossidasi, enzima della catena respiratoria mitocondriale) e la frataxina, una proteina coinvolta nel metabolismo del ferro e del signaling apoptotico, funzioni queste che potrebbero essere associate al danno ossidativo ed alla funzione dell'aconitasi. L’espressione e l’attività della mAcn, Cyt-c-ossidasi e della frataxina verranno studiate mediante metodi spettrofotometrici e Western Blot. L’analisi redoxomica valuterà la presenza in queste ed altre proteine mitocondriali di PTMs, quali 3’-nitrotirosina, Cl-tirosina, carbonili proteici e 4-idrossinonenale (4-HNE), nonché la presenza di nuovi addotti, individuati mediante le tecniche di Western blot, 2D-PAGE e LC-MS/MS che potranno essere implementate da step di arricchimento e purificazione mediante immunoaffinità od equivalenti.
2.La rilevanza biologica dei biomarcatori di danno di proteine mitocondriali da ROS/RNS sarà determinate dall’analisi di associazione con:
a.Alterazioni del rapporto struttura funzione in proteine di riferimento che sono note essere bersagli del danno da ROS/RNS (aconitasi, CytC-ox e frataxina),
b.Parametri di funzione e danno mitocondriale,
c.Risposte delle vie di segnale e geni associati a stress, replicazione e morte cellulare.
In dettaglio i parametri da studiare sarranno:
•la produzione di ROS/RNS a lo stato redox cellulare,
•le proprietà fisico-chimiche della membrana e l’attività della catena respiratoria mitocondriale,
•segnali e meccanismi di morte cellulare apoptotica associati con pathway dipendenti ed indipendenti dal mitocondrio, con particolare interesse per quelli associati alla frataxina.
•Profili di espressione/attivazione di elementi del signaling cellulare e geni coinvolti nel controllo della funzione mitocondriale, risposte da stress, infiammazione, proliferazione, apoptosi e nel signaling della vitamina E in quanto quest’ultima sarà supplementati nei modelli cellulari di senescenza in accordo con quanto riportato nel punto successivo.
3.in questa fase verrà valutato nei modelli cellulari sopra descritti l’effetto biologico delle diverse isoforme naturali e di analoghi di sintesi (esteri, eteri, amidi e nitro-derivati) della vitamina E. Per la prima volta queste molecole verranno testate in modelli di senescenza replicativa e da stress, per poter stabilire up-take cellulare, metabolismo,meccanismi d’azione, efficacia e tossicità. A tal fine gli esperimenti descritti in fase 1 ed in fase 2 saranno replicati dopo aver esposto le cellule alle differenti isoforme della vitamina E.
Le alterazioni di proteine mitocondriali individuate sia in fase 1 che in fase 2 saranno successivamente studiate come possibili biomarcatori precoci di malattia nelle cellule periferiche (linfomonociti) di soggetti con MCI e AD. Tali analisi verranno messe in relazione con i livelli plasmatici di vitamina E. Questa parte dello studio darà l’opportunità di A) trasferire in studi “in vivo” le informazioni delle alterazioni mitocondriali legate all’invecchiamento, alle risposte da stress, ed al loro possibile ruolo nella patogenesi di malattie età-relate, quali l’AD; B) analizzare l'effetto che le differenti forme di vitamina E hanno sulle alterazioni molecolari oggetto di studio; C) proporre, sulla base dei risultati della fase 3, studi sull’efficacia delle diverse forme della vitamina E nel rallentare i meccanismi della senescenza e contrastare patologie età-relate. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Patrizia Mecocci Università degli Studi di PERUGIA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il presente progetto si propone i seguenti obiettivi principali:

1) investigare in modelli in vitro di senescenza cellulare il danno di proteine mitocondriali dovuto a specie reattive dell'ossigeno e dell'azoto (ROS/RNS) ed il ruolo che tale danno gioca nel favorire processi di danno mitocondriale associati all’invecchiamento ed all’apoptosi ad esso correlata;
2) valutare l’azione protettiva di forme naturali ed analoghi di sintesi della vitamina E in condizioni normali di invecchiamento (senescenza replicativa) ed in condizioni di stress da ROS/RNS negli stessi modelli cellulari;
3) verificare e trasferire le conoscenze ottenute in questa ricerca condotta in vitro su modelli in vivo di rilevanti patologie età-relate. Tale aspetto verrà valutato in uno studio pilota in soggetti con Mild Cognitive Impairment (MCI) e malattia di Alzheimer (AD),
utilizzando cellule (linfo-monociti) e fluidi biologici (plasma).

Gli obiettivi pratici relativi alle fasi di attuazione della ricerca sono riportati di seguito in modo dettagliato.
Presupposto scientifico al progetto nelle sue varie articolazioni, è l’osservazione che con la senescenza si determina una riduzione delle funzionalità mitocondriale, in parte giustificata da alterazioni strutturali e funzionali di proteine del ciclo di Krebs (KC) e della fosforilazione ossidativa.(OXPHOS).
In particolare la ricerca si focalizzerà sullo studio, in modelli cellulari murini ed umani di invecchiamento, di due proteine enzimatiche che si sono mostrate particolarmente sensibili a condizioni di stress ossidativo e nitrosativo: l’aconitasi, quale componente del KC, e la citocromo c-ossidasi che è una componente chiave di OXPHOS, e sulla proteina mitocondriale frataxina quale elemento necessario ad assemblare il gruppo Fe-S dell’aconitasi (e di altre proteine) e possibile protagonista in processi di regolazione dello stress ossidativo e dell’apoptosi.
La prima fase della ricerca valuterà:
a) attività ed espressione di aconitasi, citocromo c-ossidasi e frataxina in condizioni basali di invecchiamento (senescenza replicativa) ed in presenza di stress indotto da ROS e RNS (senescenza da stress);
b) analisi redoxomica delle modifiche post-traduzionali da invecchiamento e da stress indotte sia su queste proteine che su altre proteine da identificare a livello molecolare con indagini immunologiche e di spettrometria di massa.
La seconda fase di ricerca avrà lo scopo di verificare la rilevanza biologica delle modifiche di attività e struttura di queste proteine rispetto al metabolismo energetico mitocondriale, allo stato redox cellulare, ai processi di signaling ed espressione genica che regolano invecchiamento, stress e morte cellulare per apoptosi.
La terza fase ha uno scopo più strettamente farmacologico andando a valutare, a livello pre-clinico, l’efficacia di molecole naturali e di sintesi ascrivibili alla famiglia della vitamina E che potrebbero essere usate in futuro per la prevenzione o il trattamento patologie età-relate.
Va detto che recentemente l’alfa-tocoferolo, la forma principale della vitamina E, è stato studiato sia in indagini epidemiologiche che in trial farmacologici su malattie quali la AD ed altre condizioni neurodegenerative. I risultati ottenuti, soprattutto nei trial clinici, non hanno confermato i dati prevalentemente positivi osservati in numerosi studi in vitro e su modelli animali. Ciò ha portato a rivedere criticamente sia il disegno sperimentale degli studi effettuati sinora sull’uomo sia la possibilità che altre forme di vitamina E (ovvero forme “non alfa”), introdotte con la dieta o come supplementi, abbiano l’efficacia richiesta.

Sulla base di tale premessa, il progetto si propone di testare in vitro le forme principali della vitamina E purificate da sorgenti naturali ed analoghi sintetici di vitamina E prodotti in seno all’attività di ricerca di questo progetto. In particolare, si cercherà di valutare l’azione delle diverse molecole sui processi di invecchiamento cellulare ed in condizioni di stress ossidativo e nitrosativo che rientrano nei meccanismi fisiopatologici di senescenza e di patologie quali la AD. I parametri di danno e funzione mitocondriale descritti nelle fasi 1 e 2 della ricerca saranno usati per valutare l’efficacia dei composti della vitamina E.
Ulteriori verifiche sulle proprietà terapeutiche di questi composti dovranno essere condotte in una fase successiva a questo specifico progetto, dove si potranno testare le molecole aventi maggiore efficacia in vitro su modelli animali di AD e quindi sull’uomo.

In sintesi gli obiettivi finali della ricerca consistono:

- nell’identificare a livello pre-clinico biomarcatori e meccanismi/vie di rilevanza patogenetica utili a migliorare le strategie diagnostiche e terapeutiche di patologie associate all'invecchiamento ed in particolare di forme neurodegenerative quali la AD;
- nel valutare le proprietà delle forme naturali e di analoghi di sintesi della vitamina E quali fattori anti-invecchiamento che potranno essere utilizzati in futuri trial d'intervento su queste patologie. <<<

Risultati parziali attesi

I risultati attesi in questa ricerca e le loro possibili applicazioni sono:

- caratterizzare l’identità molecolare dei bersagli ed i meccanismi di danno da ROS/RNS in proteine mitocondriali con la finalità , in questo studio ed in future ricerche, di verificarne l’applicabilità quali biomarcatori della perdita funzionale del mitocondrio e di altri meccanismi che si associano ai processi di senesecenza cellulare. A tale proposito saranno studiati come sistemi “reporter” del danno da ROS/RNS bersagli già conosciuti, quali l’enzima mitocondriale aconitasi, e quindi si faranno indagini redoxomiche tese a tracciare modifiche post-traduzionali su tutte le proteine mitocondriali e cellulari,
- identificare in dettaglio quali tipi di PTMs si verificano sul sistema reporter dell’aconitasi mitocondriale ed in altre proteine quali la CytC-ox e la frataxina, e stimare quali di questi siano rilevanti nei meccanismi fisiopatologici associati all’invecchiamento cellulare,
- produrre evidenze originali e nuove ipotesi sul ruolo biochimico che gioca nei processi d’invecchiamento il danno e la perdita di frataxina a livello mitocondriale. Questi aspetti saranno studiati in rapporto al controllo dei pool di Fe cellulare, alla regolazione del metabolismo cellulare attraverso l’attività dell’aconitasi stessa e di altre Fe-proteine, e sui meccanismi di apoptosi,
- verificare preliminarmente in ambito clinico la rilevanza dei biomarcatori e delle informazioni sui meccanismi di danno mitocondriale valutati in vitro. Questo risultato atteso potrebbe portare a definire nuovi strumenti per migliorare strategie diagnostiche e terapeutiche in malattie associate all'invecchiamento ed in particolare di forme neurodegenerative quali la AD.
- valutare ulteriormente le potenzialità che i composti naturali della vitamina E hanno sui processi di senescenza in vitro.
- identificare nuovi composti correlati alla vitamina E che possano essere studiati in futuro in trial clinici di chemioprevenzione e terapia di patologie cronico-degenerative associate all’invecchiamento quali la AD. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il coinvolgimento del danno mitocondriale nei processi di senescenza cellulare (teoria mitocondriale dell’invecchiamento) ed in numerose patologie età-relate, tra cui la malattia di Alzheimer (AD) (Humphries KM et al., 2006) è stato proposto sin dall’inizio della ricerca sulla biologia delle radiazioni e sui radicali liberi, e trova conferma ai nostri giorni in numerose ricerche (Navarro A, Boveris A, 2007). La sfida della ricerca moderna sarà quella di riuscire a tracciare il danno mitocondriale con biomarcatori che siano utili a descrivere meccanismi patogenetici ed a costruire strategie d’intervento per le malattie associate all’invecchiamento, e tra queste quelle a più ampio impatto sociale sono sicuramente il cancro, il danno cerebro-cardio-vascolare ed in particolare alcune forme neurodegenerative che stanno salendo alla ribalta come una vera e propria emergenza sanitaria e sociale.

In accordo con i risultati ottenuti dal nostro gruppo e da numerosi altri, è possibile identificare in ambito mitocondriale danni prodotti da specie reattive dell’ossigeno (ROS) e dell’azoto (RNS) a livello del DNA, delle componenti lipidiche di membrana e di alcune proteine di rilevanza funzionale (Beckman KB, Ames BN, 1999; Sanz A et al., 2006; Mecocci P et al., 2002; Polidori MC et al., 2004 and Polidori MC et al., 2007). Negli ultimi anni l’attenzione dei ricercatori si è spostata soprattutto su quest’ultimo ambito, tentando di identificare modifiche post-traduzionali (PTM) di proteine mitocondriali e di stabilirne il ruolo nei processi di danno a carico del metabolismo cellulare (energetico e redox). A ciò hanno contribuito anche i più recenti sviluppi nelle strategie d’indagine molecolare che hanno permesso di studiare il danno di proteine da ROS/RNS (danno ossidativo e nitrossidativo) con indagini sempre più mirate e sensibili, spesso identificate con il termine di redoxomica (Piroddi M et al., 2007). Questa tecnica è stata estensivamente applicata allo studio di PTM in diversi tipi di cellule e tessuti (quali fibroblasti, linfo-monociti e tessuto nervoso) e nei fluidi biologici (plasma e liquor) di pazienti affetti da patologie cronico-degenerative su base infiammatoria ed in particolare in pazienti affetti da diabete, uremia (Galli F, 2007) e da malattie neurodegenerative quali AD e forme iniziali di deterioramento cognitivo, condizione definita come “mild cognitive impairment” (MCI) (Markesbery WR, Lovell MA, 2007). Benché non siamo ancora in grado di definire con certezza quali siano i più precoci eventi di danno di proteine con rilevanza nell’impairment funzionale del mitocondrio, preliminari indagini di redoxomica funzionale condotte in vari modelli in vitro hanno portato ad identificare pathway e meccanismi di possibile rilevanza patogenetica. Due tra i maggiori candidati a rappresentare target funzionali di danno da ROS/RNS sono gli enzimi aconitasi (Acn) e citocromo C-ossidasi (CytC-ox). L’aconitasi è un enzima che contiene un gruppo [4Fe-4S] e catalizza in modo bi-direzionale la trasformazione del citrato in isocitrato. Esistono almeno 2 tipi di Acn: una forma mitocondriale (mAcn), ed una forma citosolica (cAcn) che svolgono funzioni diverse all’interno della cellula. È stato dimostrato che questa Fe-S proteina può subire una perdita funzionale a seguito di processi di modificazione sia reversibili che irreversibili indotti da condizioni di stress ossidativo/nitrossidativo e ci sono evidenze di una progressiva alterazione età-relata dell’attività della mAcn (Yarian CS et al., 2006). Dati preliminari hanno evidenziato una ridotta attività della mAcn nei linfo-monociti di pazienti affetti da AD e MCI, ed è interessante il fatto che tale perdita funzionale sembrerebbe essere associata a ridotti livelli plasmatici di antiossidanti non-enzimatici, tra cui la vitamina E (Mecocci et al., submitted). Ad oggi non sono disponibili informazioni conclusive sul tipo e sulla rilevanza biologica di PTM che si formano a carico della mAcn durante il danno ossidativo/nitrossidativo mitocondriale.
Per quanto concerne la CytC-ox, questo è stato di recente dimostrato essere il più sensibile e critico elemento nella catena respiratoria mitocondriale in condizioni di normale od aumentato flusso di ROS/RNS (Landar A, Darley-Usmar VM, 2007), ed inoltre è stata preliminarmente identificata subire danno da nitrazione di residui tirosinici specifici (es. 3’-Nitro-Tyr) che quindi possono essere considerati PTM candidati a diventare biomarcatori utili a tracciare il rapporto causa effetto tra il danno nitrossidativo mitocondriale ed i processi di senescenza cellulare.
Un’ulteriore proteina di possibile interesse nel danno mitocondriale da ROS e RNS è la frataxina. Questa proteina partecipa al mantenimento dell’attività metabolica mitocondriale e di altre funzioni cellulari rendendo il Fe disponibile per la biosintesi del gruppo eme e per l’assemblaggio e la riparazione di gruppi Fe-S (iron–sulfur cluster, ISC), tra cui l’aconitasi e componenti della catena mitocondriale di trasporto degli elettroni. È stato dimostrato che la frataxina è importante per la sopravvivenza di diverse linee cellulari, come gangli delle radici dorsali, cardiomiociti e cellule pancreatiche di tipo beta. È inoltre stato proposto che tale proteina non solo promuove la sintesi di metalloproteine contenenti Fe, ma contribuisce alla detossificazione del metallo in eccesso, costituendo così un importante meccanismo antiossidante (Bencze KZ et al., 2006).
Aconitasi, CytC-ox e frataxina sono quindi potenziali bersagli, che una volta modificati dall’azione dannosa dei ROS/RNS, potrebbero essere causa di un deficit energetico e di un alterato stato redox della cellula in quanto sono elementi funzionali essenziali del mitocondrio. Al contempo, non è escluso che un danno anche parziale di queste proteine possa generare danno mitocondriale aumentando od alterando il flusso di ROS/RNS e sostenendo eventi di stress ossidativo a carico di altri bersagli. Infatti, tali proteine potrebbero essere coinvolte direttamente ed indirettamente nella produzione di specie reattive, ad esempio attraverso il disaccoppiamento di elementi della catena respiratoria che potrebbero dissipare intermedi reattivi dell’ossigeno o tramite l’azione catalitica del Fe ed altri metalli di transizione contenuti in proteine che subiscono danno strutturale. Alterazioni del folding proteico (o “misfolding”) in metalloproteine quali alcune eme-proteine, sono classicamente conosciute catalizzare reazioni quali quella conosciuta con il nome di “reazione di Fenton” o di riduzione tetravalente dell’ossigeno molecolare, che produce intermedi a diverso grado di reattività che vanno dall’anione superossido, al perossido d’idrogeno sino al radicale idrossilico.
Lo studio del danno di proteine mitocondriali, pertanto, è uno degli aspetti più attuali della ricerca finalizzata ad identificare biomarcatori e meccanismi associati ai processi di invecchiamento ed alle patologie età-relate. Questo tipo di studi saranno importanti anche al fine di disegnare opportune strategie d’intervento. A questo proposito, la possibilità di improntare terapie con agenti antiossidanti che possano specificamente contrastare i meccanismi di danno mitocondriale proposti per ROS/RNS, continua a stimolare numerose ricerche. L’antiossidante lipofilo vitamina E è stato proposto produrre con le sue diverse forme naturali (alfa-, beta-, gamma-, delta-tocoferolo, alfa-, beta-, gamma-, delta-tocotrienolo) un ruolo fisiologico di protezione e di controllo delle risposte da stress a livello cellulare, con particolare rilevanza in ambito vascolare, cutaneo e neuronale. I maggiori trial interventistici basati sulla supplementazione di questa vitamina (principalmente come alfa-tocoferolo) si sono focalizzati sulla prevenzione primaria e secondaria del danno cardiovascolare, ma in genere hanno prodotto risultati modesti e spesso contrastanti. Meno studiate sono altre condizioni su base cronico-degenerativa ed associate all’invecchiamento quali il cancro e le patologie neurodegenerative come l’Alzheimer. In queste ultime comunque, la supplementazione di antiossidanti ed in particolare di vitamina E, rimane ad oggi una pratica diffusa viste le evidenze pre-cliniche disponibili e l’assenza di alternative terapeutiche efficaci. Uno dei limiti maggiori degli interventi con antiossidanti quali la vitamina E in malattie degenerative associate all’invecchiamento rimane quello dell’uso esclusivo di alfa-tocoferolo (a-TOC). Questa è la forma ritenuta maggiormente attiva a livello biologico e che normalmente viene selezionata con un meccanismo selettivo a livello epatico e che pertanto presenta la maggiore abbondanza relativa nel nostro organismo (Galli F et al., 2007). Ciò ha portato a trascurare le altre forme della vitamina E delle quali solo negli ultimi anni abbiamo imparato a conoscere proprietà che sono superiori ed in alcuni casi alternative a quelle dell’a-TOC (Sen CK et al., 2007). È importante sottolineare il fatto che queste proprietà vanno oltre il semplice ruolo di antiossidanti lipofili spingendosi ad effetti di regolazione di vie di signaling cellulare e di espressione genica che risultano in ruoli di regolazione dei processi fondamentali di sviluppo, differenziamento e morte nelle cellule eucariotiche (Aisa MC et al., 2006). I trial clinici ad oggi effettuati sono stati disegnati in modo che tali ruoli spiccatamente omeostatici e protettivi della vitamina E, non potessero essere evidenziati. Questo perchè sono stati trascurati aspetti importanti, quali ad esempio l’apporto ed il metabolismo delle varie forme della vitamina E diverse dall’ a-TOC, che in presenza di un eccesso di quest’ultimo sono fortemente escluse dai meccanismi di uptake epatico, che privilegia l’immissione in circolo e la distribuzione ai tessuti periferici di a-TOC (Galli F et al., 2007). È stato infatti dimostrato lo “spiazzamento” dal plasma delle isoforme della vitamina E diverse dall’a-TOC a vantaggio di quest’ultimo nei trials in cui è stato utilizzato a-TOC ad alte dosi, e ciò può interferire con le azioni regolatorie e protettive dei diversi vitameri. Inoltre, in molti dei trial eseguiti, non sono stati studiati biomarcatori utili a verificare la compliance al trattamento e la reale outcome biologica e clinica che da questo ci si attendeva.
Il futuro degli interventi basati sulla supplementazione con vitamina E, pertanto dovrà prevedere:
• trial con diversi analoghi ed eventualmente con nuove forme sintetiche che esaltino le proprietà positive degli analoghi naturali sino al punto da ottenere da queste effetti chemiopreventivi o terapeutici,
• una selezione oculata delle patologie su cui intervenire e nelle quali vi siano meccanismi biologici realmente aggredibili dall’azione biologica della vitamina E,
• una selezione ottimale dello stadio clinico della malattia in cui intervenire (grado di avanzamento della malattia) in modo tale da modificarne in modo positivo il decorso e definizione dell’outcome,
• l’ausilio di biomarcatori attendibili che permettano di monitorare compliance dei pazienti ed outcome biologica e clinica del trattamento.

Va considerata la scarsa conoscenza del ruolo biologico della vitamina E nell’organismo umano, ed in particolare delle forme “non-alfa”, soprattutto in strutture complesse quali il sistema nervoso centrale. Vista la disponibilità di nuovi analoghi di sintesi della vitamina E, molti degli aspetti sopra discussi dovranno essere determinati nel corso di ulteriori studi pre-clinici prima di improntare la prossima generazione di trial clinici d’intervento nelle patologie età-relate, in particolare i disordini neurodegenerativi.
È proprio questo l’intento che si prefigge la presente ricerca perseguendo l’obiettivo di saggiare prima biomarcatori di danno mitocondriale da specie reattive dell'ossigeno e dell'azoto (ROS/RNS) in modelli di senescenza cellulare ed in pazienti affetti da AD e MCI, e poi di verificarne l’utilizzo nello studio di interventi con analoghi della vitamina E in vitro ed in futuri trial d’intervento su questi pazienti. Allo stesso tempo valuteremo il potenziale effetto protettivo, e la capacità di contrastare modificazioni età-relate, delle isoforme naturali e di analoghi di sintesi della vitamina E in diversi modelli cellulari, sia in condizioni basali che di aumentato stress ossidativo/nitrosativo. Le proprietà protettive di questi vitameri, una volta evidenziate in vitro andranno verificate in vivo, anche in soggetti affetti da AD.


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