RICERCA ITALIANA     

Agenti infettivi e fattori alimentari nell'oncogenesi della vescica del bovino: meccanismi patogenetici e sicurezza alimentare.

Università degli Studi di Napoli "Federico II"

Abstract

I tumori della vescica dei bovini sono particolarmente frequenti in determinate zone geografiche in cui i terreni destinati al pascolo di animali allevati allo stato brado e/o semibrado sono coperti da felce (Pteridium spp). I tumori della vescica del bovino, che possono colpire anche il 90% degli animali al pascolo, riconoscono una eziologia multifattoriale, caratterizzata dall’azione sinergica di infezioni virali (Bovine Papillomavirus tipo 2), infezioni batteriche e sostanze tossiche di origine vegetale. Quest’ultime derivano dalla felce aquilina, quali la braxina A, B e C, sostanze clastogene e mutagene come la quercetina e sostanze squisitamente oncogene, la più importante delle quali appare essere un sesquiterpenoide chiamato ptaquiloside (PT). E' verosimile che queste sostanze agiscono in sinergia con agenti virali e/o batterici potendosi rendere così responsabili di eventi neoplastici a carico della vescica. Praticamente sconosciuti sono, tutt'oggi, le cause e i pathways molecolari responsabili della cosidetta "promotion" della cellula uroteliale iniziata. Importanza sempre più rilevante infatti si attribuisce al processo infiammatorio cronico come evento-chiave nella promozione del tumore. Si ipotizza, infatti, che l'infiammazione cronica sostenuta principalmente da batteri e virus possa essere responsabile della promozione del tumore attraverso meccanismi nei quali un ruolo centrale viene svolto da processi immunitari. DNA di papillomavirus bovino tipo 2 è stato amplificato in un’alta percentuale di tumori vescicali così come numerosi batteri sono stati isolati dalle urine di bovini con tumori uroteliali. Si ritiene che i papillomavirus possano rimanere nell'organismo in forma latente in attesa di essere attivati da eventi immunodepressivi indotti da sostanze presenti nella felce. Un altro obiettivo del presente programma di ricerca è quello di indagare sul ruolo che le infezioni virali e batteriche possono avere nel promuovere una cellula iniziata studiando non solo il comportamento di alcune citochine pro-infiammatorie (interleuchina 6 e CXCL-8) ma anche eventuale pathways molecolari principalmente quelli associati all'overespressione della catena pesante della ferritina. Tali indagini molecolari, mai eseguite finora in medicina veterinaria, saranno utili per meglio capire i meccanismi patogenetici di eventi neoplastici che hanno negative ripercussioni sull'allevamento di bovini (principalmente podolici) che continuano ad essere autentiche ed importanti realtà zootecniche in alcune regioni dell'Italia meridionale. Inoltre l’obiettivo è anche di approfondire gli aspetti clinici e patogenetici dell’ematuria cronica del bovino da ingestione di felce, con il fine di identificare gli animali malati le cui produzioni possono essere potenzialmente pericolose per la salute umana. Si intende quindi studiare il profilo citofluorimetrico delle cellule coinvolte nel processo infiammatorio: particolare enfasi verrà data allo studio del fenotipo e della funzione delle sottopopolazioni di linfociti T infiltranti in lesioni persistenti e non. In questo progetto verificheremo, nel carcinoma vescicale dei bovini, anche l’attività antiapoptotica di BAG3, proteina co-chaperone appartenente alla famiglia BAG (Bcl-2 associated athanogene) coinvolta nella regolazione di diversi processi cellulari incluse la proliferazione e l’apoptosi, e la sua modulazione mediata da metaboliti della felce (Pteridium aquilinum). Inoltre verificheremo il coinvolgimento di BAG3 nella replicazione del virus BPV-2 e le possibili interazioni funzionali con l’oncoproteina virale E5. Infine recenti studi condotti da una delle nostre unità di ricerca hanno evidenziato che la ricognizione di recettori sigma-2 in termini quantitativi può essere correlata al grading ed allo staging tumorale, in particolare ha dimostrato ciò in alcuni casi di tumore della vescica umana. La loro sovraespressione in molti tessuti tumorali umani ed animali potrebbe costituire un utile strumento diagnostico soprattutto in quelle patologie in cui i biomarkers di riferimento risultano essere pochi o poco affidabili. Infine sarà studiata l'eventuale presenza di PT nel latte di bovini alimentati con felce. PT è considerato il più importante fattore oncogeno della felce che può essere riscontrato anche in alimenti destinati al consumo umano. E' ancora non perfettamente noto il ruolo che questo fattore può ricoprire nel determinismo di alcuni tumori gastrici nell'uomo. E' generalmente accettata l'idea che soprattutto il latte possa rappresentare il link tra alimentazione e tumore dello stomaco nell'uomo. Infatti, l'abitudine alimentare all'uso di latte bovino è considerata la principale causa della maggiore incidenza di tumori gastrici che si osservano in campo umano in alcune zone andine del Venezuela e Costarica. Sulla base di queste considerazioni pensiamo che il bovino possa senza dubbio assumere un particolare significato anche come Animal model for human disease. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Sante Roperto Università degli Studi di NAPOLI "Federico II"

Obiettivo del Programma di Ricerca

E’ ormai nota la stretta corellazione tra il BPV-2 e l’oncogenesi vescicale in presenza di cofattori, come le sostanze tossiche della felce, pianta ubiquitaria largamente diffusa nell’Italia meridionale e in molte zone tropicali e subtropicali. Già a partire dal 2003 e poi negli anni successivi il nostro gruppo di ricerca ha riscontrato DNA di BPV-2 in vesciche urinarie bovine in corso di tumori e nel sangue degli stessi, la cui unica manifestazione clinica era rappresentata dalla ematuria cronica enzootica (CEH). Più di recente in animali con tumori vescicali sono state riscontrate una lunga serie di ceppi batterici responsabili con molta probabilità di alcune infezioni croniche, che ormai molti autori considerano alla base dell’oncogenesi di diversi tumori.
Con le nostre unità di ricerca eseguiremo indagini di biologia molecolare e di batteriologia per riscontrare la presenza di tutti i fattori batterici e/o virali presenti nella vescica e nel sangue. Inoltre verranno condotte indagini chimiche verranno eseguite sul latte, destinato al consumo umano, di bovini alimentati con felce alla ricerca di ptaquiloside (PT), il più potente fattore oncogeno contenuto nella felce per impedire che lo stesso possa essere inserito nella catena alimentare dell'uomo ed affrontare, così, un'emergente problematica di sicurezza alimentare. E' utile ricordare che in alcune zone del Venezuela e del Costarica l'elevata incidenza di tumori gastrici, osservata nell'uomo, viene generalmente collegata all'abitudine alimentare di bere latte proveniente da bovini allevati in pascoli ricchi in felce.
È fondamentale quindi approfondire gli aspetti clinici e patogenetici coinvolti, attraverso un’analisi dei processi alla base delle infiammazioni sostenute principalmente da batteri e virus responsabili della promozione del tumore attraverso meccanismi nei quali un ruolo centrale viene svolto da processi immunitari. L’oncogenesi sarà inoltre studiata, nel suo sviluppo e nella sua promozione, studiando il comportamento di alcune citochine pro-infiammatorie quali l'interleuchina 6 e la CXCL-8 ma anche eventuale pathways molecolari.
Inoltre lo studio del profilo citofluorimetrico delle cellule coinvolte nel processo infiammatorio, nonché l’identificazione di marcatori BPV- specifici consentirebbe infatti di chiarire gli eventi alla base dell’oncogenesi vescicale. Così come lo studio sul coinvolgimento di alcune proteine (BAG3) coinvolte in diversi processi cellulari, nella replicazione del virus BPV-2 e le possibili interazioni funzionali con l’oncoproteina virale E5. Non meno importate è la correlazione di alcuni alcuni recettori (sigma-2) e la loro overespressione. L’obiettivo finale è quindi quello di valutare tutti i processi molecolari, clinici e patogenetici alla base dell’oncogenesi vescicale, in corso di infiammazioni d’origine batterica e/o virale. In questo contesto il bovino può senza dubbio assumere un particolare significato anche come Animal model per lo studio delle malattie infettive. <<<

Risultati parziali attesi

I risultati prevedono il riscontro, nei campioni prelevati, di DNA di Bovine Papillomavirus type 2, l'isolamento di diversi ceppi batterici, l'overespressione della ferritina, l'overespressione dei Bag2, l'overespressione dell'NF-kB, l'overespressione dei sigma-2 e di tutte le proteine antiapoptotiche. In aggiunta si pensa di studiare nei tumori la presenza di specie linfocitarie correlate, con progressione ed evoluzione del tumore stesso (es. riduzione dell'espressione dei MHC-I e II). La conoscenza nell'espressione delle succitate proteine ad azione antiapoptotica permetterà l'avanzamento nella conoscenza del meccanismo patogenetico necessario per la promozione e progressione del tumore. Sui bovini con tumore della vescica si potranno, infine, approntare nuovi protocolli terapeutici che possono essere di valore in patologia comparata. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Nonostante siano sempre più numerose le prove scientifiche che chiaramente dimostrano la stretta relazione tra infiammazione cronica ed oncogenesi (Tan e Coussens, 2007), ancora non sono conosciuti tutti gli intimi meccanismi molecolari attraverso i quali un'infiammazione cronica può promuovere la cancerogenesi (Moss e Blaser, 2005;). In particolare, nel 16% circa dei tumori umani è possibile riscontrare la presenza causale di numerosi agenti infettivi compresi batteri e virus (Herrera et al., 2005). Si ritiene che virus e batteri possono causare processi infiammatori cronici che si pensa contribuiscano a determinare oltre un milione di casi di tumori per anno (Balkwill e Mantovani, 2001; Kuper et al., 2000). Virus quali papillomavirus e batteri quali Helicobacter pylori sono ben riconosciuti agenti infettivi associati a tumori della cervice e dello stomaco rispettivamente. Recentemente, un nuovo meccanismo molecolare è stato descritto in corso di infezione batterica associata alla progressione tumorale. E' stato dimostrato che attraverso Toll-like receptor 2 Lysteria monocytogenes attiva il NF-kB il quale fattore stimola le cellule tumorali a produrre interleuchina-6 (Huang et al., 2007). Viene così confermato il ruolo essenziale che hanno i recettori Toll-like nel promuovere un microambiente favorevole all'iniziazione e alla progressione
tumorale (Chen et al., 2007). IL-6 ed IL-8 (CXCL-8) sono tra i più importanti fattori che favoriscono la progressione dei tumori via TLRs (Chen et al., 2007). In medicina veterinaria i tumori uroteliali della vescica sono rarissimi rappresentando circa lo 0,01-0,1% di tutti i tumori riscontrati in questa specie (Pamukcu, 1974). Sono invece comuni in bovini allevati allo stato brado e/o semibrado su terreni ricchi in felce (Pteridium spp) con una prevalenza che può raggiungere anche il 90% degli animali adulti (Pamukcu et al., 1976). E' noto che la felce contiene sostanze flogogene quali la braxina A, B e C, sostanze clastogene e mutagene quali la quercetina e sostanze squisitamente oncogene, la più importante delle quali è un sesquiterpenoide chiamato ptaquiloside (PT). Ptquiloside è oncogeno anche per l'uomo che raggiunge attraverso il latte di bovini alimentati con felce rendendosi responsabile di tumori dello stomaco (Alonso-Amelot e Avendano, 2002). E'
verosimile che queste sostanze agiscono in sinergia con agenti virali e/o batterici potendosi rendere così responsabili di eventi neoplastici a carico della vescica. Si ritiene infatti che PT, in un ambiente alcalino quale quello della vescica del bovino, viene attivato in APT (activated PT) il quale, alchilando il codone 61 del gene H-Ras, determina alterazioni nei segnali di trascrizione che si esprimono in una alterata sintesi proteica. Con questo meccanismo patogenetico si giustifica una
alterata sintesi della proteina p21 che normalmente contribuisce al normale ciclo cellulare. La p21 modificata si renderebbe responsabile di eventi iperplaseogeni che "inizierebbero" le cellule uroteliali ad una potenziale trasformazione in senso neoplastico. Si ritiene infatti che l'alchilazione dell'adenina nel codone 61 del gene H-Ras sia il dato molecolare più importante nella cosiddetta "initiation" del processo cancerogenetico. Praticamente sconosciuti sono, a tutt'oggi, le cause e i pathways molecolari responsabili della cosidetta "promotion" della cellula uroteliale iniziata. Importanza sempre più rilevante si attribuisce al processo infiammatorio cronico come evento-chiave nella promozione del tumore (Lu et al., 2006). Si ipotizza, infatti, che l'infiammazione cronica sostenuta principalmente da batteri e virus possa essere responsabile della promozione del tumore attraverso meccanismi nei quali un ruolo centrale viene svolto da processi immunitari (Chen et al., 2007; Philip et al., 2004; Tan e Coussens, 2007).
DNA di papillomavirus bovino tipo 2 è stato amplificato in una alta percentuale di tumori vescicali così come numerosi batteri sono presenti nelle urine di bovini con tumori uroteliali. Si ritiene che i papillomavirus possano rimanere nell'organismo in forma latente in attesa di essere attivati da eventi immunodepressivi indotti da sostanze presenti nella felce le quali avrebbero così la capacità di indurre la progressione dei tumori indirettamente in seguito all'infiammazione virale cronica
(Campo et al., 1992; Borzacchiello et al., 2003). Lo stato immunodepressivo indotto dalla felce favorirebbe anche l'insorgenza di infezioni batteriche croniche della vescica anche esse riportate piuttosto frequentemente in corso di cancerogenesi uroteliale (Roperto et al., 2006). E' molto verosimile che l'infiammazione cronica giochi un ruolo principale nella promozione cancerogenetica a livello della vescica. Infatti in tutti i tumori uroteliali nei bovini si riscontrano, costantemente, focolai infiammatori a carico della parete dell'organo (Roperto et al., 2007).

Dal punto di vista clinico vengono colpiti bovini adulti di età compresa generalmente tra i tre ed i sette anni, che, dopo un periodo prodromico asintomatico di almeno 2 anni, mostrano ematuria clinicamente manifesta (macroematuria), più o meno intermittente, di intensità variabile e proporzionale alla quantità di felce ingerita. In genere la malattia evolve in forma cronica con periodi di completa remissione clinica, sebbene non sia possibile escludere la presenza di ematuria occulta (microematuria). Nei casi avanzati la minzione può risultare difficoltosa in seguito alla formazione di coaguli, che occludono totalmente o parzialmente l’uretra. La diagnosi di certezza si può ottenere soltanto mediante la cistoscopia, che consente inoltre di effettuare prelievi bioptici di tessuto neoplastico da utilizzare per le indagini istopatologiche ed immunoistochimiche.L’esame cistoscopico rappresenta il “gold standard” consentendo di evidenziare a livello di mucosa vescicale anche la presenza di focolai emorragici della grandezza di una capocchia di spillo localizzati a livello del trigono. I rilievi di laboratorio in genere evidenziano una anemia normocitica ed ipocromica associata a trombocitopenia. In letteratura i dati relativi alle prove emocoagulative, concernenti l’emostasi primaria e secondaria, nei bovini con ematuria cronica da neoplasia vescicale appaiono scarsi e frammentari. Negli ultimi anni numerosi studi hanno sottolineato in pazienti umani lo stretto legame tra progressione della malattia neoplastica e disturbi emocoagulativi, più o meno mediati da disfunzione endoteliale. In particolare nei pazienti portatori di neoplasia è frequente osservare condizioni di coagulazione intravasale disseminata (CID), più o meno compensata, la cui patogenesi appare complessa e multifattoriale. In tale condizione la modificazione della concentrazione sierica di alcuni fattori della coagulazione, quali fattore V, VIII, IX, X, XIII, ATIII e PC è stata frequentemente descritta in medicina umana, mentre lo studio del comportamento di tali fattori appare in campo veterinario ancora preliminare e ad esclusivo appannaggio della clinica dei piccoli animali. I cambiamenti dei fattori emocoagulativi in corso di malattia neoplastica possono essere dovuti ad una loro diretta secrezione da parte di cellule tumorali, da parte di cellule infiammatorie o, ancora, di cellule endoteliali. Sempre per quanto concerne l’emostasi secondaria, è possibile osservare una iperfibrinogenemia, espressione della stimolazione antigenica cronica. Studi concernenti lo stato emocoagulativo dei bovini affetti da ematuria collegata a neoplasia appaiono del tutto assenti, nonostante appaia verosimile che tali animali mostrino un’alterazione della via intrinseca ed estrinseca della coagulazione associata a trompocitopatia, al pari di quanto riportato sia in vivo che in vitro in campo umano. Diversi studi sperimentali hanno inoltre evidenziato come un ruolo di fondamentale importanza per la genesi, e l’accrescimento, delle neoplasie vescicali sia svolto dall’attivazione di recettori di membrana specifici (PARs) da parte delle serino-proteasi della coagulazione, tra cui un ruolo critico è rappresentato dalla trombina. Essa oltre a determinare la formazione di fibrina presenta diverse altre attività biologiche, essendo coinvolta nella risposta infiammatoria, nella riparazione del danno endoteliale, nella determinazione dell’ispessimento intimale secondario a danno vasale e nello sviluppo di fibrosi. In particolare tale molecola attiva i PAR 1 e 3, ed unitamente alla tripsina anche i PAR-4, mentre i PAR-2 sono attivati dalla triptasi e da altri fattori della coagulazione. L’attivazione dei PARs induce una serie di effetti biologici, tra i quali aggregazione piastrinica, vasodilatazione endotelio-dipendente e stimolazione mitogena. Il PAR-1 partecipa inoltre ai processi di riparazione delle ferite e di rimodellamento tissutale, stimolando la proliferazione delle cellule endoteliali ed i fibroblasti, sia direttamente che attraverso la secrezione di altri fattori di crescita.


Il gene bag3 appartiene alla famiglia dei geni bag presenti in diversi organismi ed è stato identificato attraverso tre differenti approcci : screening del doppio ibrido in lievito utilizzando il dominio ATPasico di Hsc70 come “esca” (Takayama et al,1999); screening di una libreria di cDNA per proteine che interagiscono con Bcl-2 (Lee et al,1999); ibridazione sottrattiva differenziale tra cellule di controllo e cellule cresciute in presenza di un inibitore dell’influsso del calcio CAI (Doong et al,2000). BAG3 è una proteina citoplasmatica di 74 kDa particolarmente concentrata nel reticolo endoplasmatico rugoso; può essere osservato un segnale ad un peso molecolare leggermente diverso in alcuni tipi cellulari e/o dopo l’esposizione ad alcuni tipi di stress (Doong et al,2002; Pagliuca et al,2003;osservazioni). Durante il processo di trasformazione maligna, le cellule neoplastiche acquisiscono resistenza all’apoptosi attraverso diversi meccanismi, tra cui mutazioni nei geni p53 e K-ras, aberrante espressione dei geni della famiglia Bcl-2 e una eccessiva attivazione dei “pathways” mitogenici. Lo stress cellulare è responsabile dell’attivazione di alcuni meccanismi (attivazione di JNK, attivazione di Bax e Bak, alterazioni della membrana mitocondriale), capaci di mediare la morte cellulare, e altri (attivazione di Akt, stimolazione dei fattori trascrizionali NF-kappaB), coinvolti nel mantenimento della sopravvivenza cellulare. La risultante di questi due tipi di risposte determina il destino della cellula (Pirkkala et al, 2001). Le Hsps (Heat shock proteins) hanno un ruolo importante sulla regolazione dei segnali anti-apoptotici, inclusi quelli mediati da Akt, JNK e NF-kappaB. Attraverso tale effetto le Hsps mostrano un effetto su diversi eventi prossimali e distali alla depolarizzazione della membrana mitocondriale, così come sui segnali attivati dalla via estrinseca dell' apoptosi. Inoltre Hsp70 assiste il “refolding” delle proteine danneggiate e il loro rilascio al proteasoma (Beere, 2005). In una recente pubblicazione è stato dimostrato che Hsp70 è in grado di regolare la stabilità dell’ RNA messaggero di Bim (Matsui et al,2007). Le proteine della famiglia BAG si legano attraverso il dominio BAG al dominio ATPasico di Hsp70 e anche BAG3 forma un complesso con Hsc/Hsp70 modulandone la sua attività. Nell'uomo Bag3 è espressa nei miociti e in pochi altri tipi cellulari, mentre la sua espressione è stata riscontrata in diversi tipi di tumore; nelle cellule neoplastiche, la modulazione negativa dei livelli di BAG3 induce l’apoptosi, indicando che questo co-chaperone presenta un ruolo chiave nel mantenimento della sopravvivenza cellulare (Romano et al,2003a,2003b; Bonelli et al,2003; Chiappetta et al,2007). L’espressione di BAG3 nei tessuti bovini non è stata ancora dimostrata. I meccanismi attraverso i quali BAG3 influenza l’apoptosi cellulare non è stato ancora chiarito. Uno dei partner molecolari di BAG3 è Hsp70, uno chaperone che interagisce con proteine coinvolte nel processo apoptotico, e tra questi i fattori trascrizionali NF-kappaB. Uno dei meccanismi ipotizzati è rappresentato dalla regolazione negativa dell’attivazione dei fattori trascrizionali NF-kappaB: infatti la riduzione dei livelli della proteina BAG3 attraverso l’utilizzo di specifici siRNAs risulta in una riduzione dell’attività dei fattori trascrizionali NF-kappaB, come confermato da saggi EMSA in alcune linee cellulari; inoltre, mentre l’apoptosi è fortemente amplificata dal siRNA specifico per BAG3 in queste cellule, quest’effetto viene ridotto quando si co-trasfetta un costrutto esprimente la forma costitutivamente attiva di IKKbeta (risultati preliminari). La nostra unità ha indagato sui livelli della proteina BAG3 in 8 tumori di origine vescicale nel bovino rispetto a 8 tessuti vescicali ottenuti da bovini sani. Abbiamo utilizzato due anticorpi creati nei nostri laboratori: un anticorpo policlonale diretto contro BAG3 ricombinante e un anticorpo monoclonale diretto contro la porzione amino-terminale della proteina BAG3. Inoltre, abbiamo analizzato i livelli dell’RNA messaggero di BAG3 negli stessi tessuti attraverso PCR REAL-TIME. Abbiamo osservato per la prima volta che la proteina BAG3 è espressa a bassi livelli nei tessuti vescicali sani, mentre un’elevata espressione è stata riscontrata nei tessuti tumorali della vescica. Questo progetto intende studiare il ruolo di BAG3 nella regolazione dell’apoptosi ed i meccanismi di tale regolazione in questo modello neoplastico.


Un altro importante capitolo riguarda i recettori sigma che sono costituiti da due sottotipi recettoriali: sigma-1 e sigma-2. I recettori sigma-1 sono stati clonati e sono coinvolti in varie funzioni fisiologiche quali il rilascio di neurotrasmettitori (acetilcolina, serotonina, noradrenalina) sia a livello del sistema nervoso centrale (SNC) che di quello periferico. Sono inoltre coinvolti nella modulazione della biosintesi di ormoni steroidei, del colesterolo in particolare. A livello del SNC, ligandi attivi su questi recettori sono studiati quali potenziali agenti antipsicotici e neuroprotettivi in patologie neurodegenerative. I recettori sigma-2 invece non essendo stati ancora clonati presentano poche informazioni biomolecolari e non sono ancora definiti i pathways biologici in cui risultano coinvolti. Tuttavia, uno degli aspetti interessanti legati a questo sottotipo recettoriale é la loro sovraespressione in molti tumori solidi umani ed animali. Questa evidenza sperimentale ha portato a studiare e correlare la presenza di questi recettori con il "grading" e lo "staging" tumorale. In molte linee cellulari tumorali umane ed animali é stata accertata la presenza di tali recettori mentre studi sono in corso per verificare la loro presenza in tumori liquidi soprattutto del tessuto emopoietico.
Uno degli ambiti in cui si é riscontrato maggiore interesse nello sviluppo di ligandi sigma-2 é quello dell'imaging diagnostico (PET e SPECT). Tale tecnica rappresenterebbe una nuova risorsa per la diagnostica tumorale in vivo. Molti studi hanno evidenziato possibili impieghi farmacologici di ligandi attivi su questi recettori come l'induzione di apoptosi in cellule tumorali che li sovraesprimono e la modulazione di trasportatori di membrana coinvolti nella farmacoresistenza quali la glicoproteina-P (P-gp) e la Breast Cancer Resistance Protein (BCRP). Lo studio comparato di reperti biologici umani e bovini permetterebbe di definire meglio il ruolo patologico di questi recettori e, se sovraespressi, di valutare la possibilitá di impiegarli quali biomarkers specifici in quelle patologie tumorali. <<<