RICERCA ITALIANA     

BIOMONITORAGGIO DI AMBIENTI MARINI COSTIERI: SVILUPPO E APPLICAZIONE DI NUOVE METODOLOGIE CITOCHIMICHE E MOLECOLARI INTEGRATE

Università degli Studi di Messina

Abstract

Il progetto nazionale prevede lo studio di aree marine costiere selezionate in quanto sottoposte a impatti ecotossicolgici di origine industriale. Le aree sono situate in due regioni italiane (Liguria e Sicilia) e, per controllo saranno individuate corrispondenti aree con caratteristiche ecologiche sovrapponibili. Lo studio si propone di utilizzare un approccio metodologico basato sull’uso di organismi bioindicatori e di biomarker, quali segnalatori precoci di esposizione, effetto e di danno.
A questo riguardo nelle aree di studio, saranno valutati gli effetti dei contaminanti con particolare riferimento agli elementi in tracce su organismi marini (bioindicatori). Saranno utilizzati come bioindicatori molluschi bivalvi in gabbie e due specie di pesci appartenenti a livelli trofici differenziati (erbivori e predatori).
L’analisi statistica dei dati e la comparazione dello status delle specie esaminate rispetto all’area di controllo fornirà il dato finale sullo stato di contaminazione dell’area. Integrando i dati ottenuti con quelli delle altre unità sarà possibile formulare una valutazione di pericolo ed eventualmente di rischio ambientale.
Il presente progetto si propone di utilizzare un approccio metodologico innovativo, basato sull’uso di organismi come biomonitor per indagare i livelli di accumulo e le risposte biochimiche e metaboliche che gli organismi producono, in presenza di metalli pesanti nell’ambiente in cui vivono. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Salvatore Fasulo Università degli Studi di MESSINA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il presente progetto si propone di utilizzare un approccio metodologico innovativo, basato sull’uso di organismi come biomonitor per indagare i livelli di accumulo e le risposte biochimiche e metaboliche che gli organismi producono in presenza di metalli pesanti nell’ambiente in cui vivono. Gli strumenti metodologici utilizzati sono rappresentati dall’utilizzo di organismi bioindicatori e da una serie di parametri da valutare su questi, quali “indicatori sensibili” della presenza e degli effetti dei metalli nell’ambiente. L’area di studio sarà rappresentata da ambienti sottoposti a forte impatto ecotossicologico per la presenza di impianti industriali. Le aree sono situate in Sicilia (Baia di Augusta e golfo di Milazzo) e in Liguria (Stoppani). Nei distretti geografici saranno selezionate anche aree di controllo sovrapponibili, per caratteristiche ecologiche, agli ambienti impattati. Gli organismi indicatori saranno selezionati in funzione del livello trofico: filtratori (molluschi bivalvi), erbivori e predatori (pesci). I principali vantaggi nell’impiego di molluschi bivalvi in programmi di biomonitoraggio, sono soprattutto la conoscenza del loro ciclo biologico, delle abitudini alimentari, la facilità di raccolta e l’ampia diffusione geografica.
La realizzazione da parte del Ministero dell’Ambiente della banca dati Sistema Difesa del Mare (Si.Di.Mar.) per il “Programma di Monitoraggio per il controllo dell’Ambiente Marino”, il numero delle informazioni relative alla presenza di metalli pesanti e composti organoclorurati negli ambienti marini costieri risulta sempre estremamente limitato sia per la bassa densità di siti di campionamento, che per l’esclusione della valutazione degli effetti che tali contaminanti possono produrre.
Specie di pesci erbivori (es salpe) e carnivori (es scorpenidi o serranidi) sono il complemento indispensabile per caratterizzare la rete trofica ed i processi di trasferimento dei contaminanti nei vari livelli. <br />I dati relativi ai livelli di bioaccumulo dei metalli negli organismi campionati forniranno una misura della biodisponibilità.
La sintesi di tutte le informazioni, insieme alla comparazione dello status delle specie esaminate rispetto all’area di controllo fornirà il dato finale sullo stato di contaminazione dell’area.
Sarà quindi possibile definire un quadro della situazione ambientale attraverso la quantificazione dell’impatto sulle comunità bentoniche e formulare un’ipotesi di pericolo potenziale sulle comunità umane che usano organismi dell’area come alimento.
L’aspetto importante e innovativo del presente progetto è rappresentato dal’uso di una metodologia che prevede la caratterizzazione degli impatti ecotossicologici sugli ecosistemi marini e l’utilizzo di organismi (bioindicatori) e di indicatori sensibili di effetto e di esposizione (biomarker).
Questo approccio permette di ottenere una quantità e una qualità di informazioni sullo stato di salute del sistema ambientale, altrimenti non rilevabili con le tradizionali indagini basate sull’analisi chimica dei comparti abiotici.
Crediamo che l'originalità del progetto consista nell'ampia comparazione tra metodi molecolari, geneteici, istomorfologici, immunoistochimici e biochimici e, dunque, nell'accurata indagine a livello tissutale e citologico del danno che le metodiche chimiche da sole non riescono ad evidenziare portando, così, ad una individuazione mirata degli indicatori biologici che possono essere usati per identificare patologie da agenti tossici. L’innovazione dell’approccio si riscontra nella sinergia fra una molteplicità di competenze che spaziano dalla biologia cellulare alla genetica, e dall'istopatologia alla biochimica ed all'ecologia, e anche per i vari tipi di organi bersaglio presi contemporaneamente in esame (branchie, encefalo, fegato, urofisi, ghiandola digestiva) nei bioindicatori.
Anche la comparazione con i dati relativi ad ambienti naturali a diverso livello d'inquinamento rappresenta un approccio indispensabile alla comprensione dei meccanismi molecolari e cellulari di causa-effetto. La sintesi finale del complesso dei risultati così raccolti consentirà, fra l'altro, un'analisi approfondita del complessivo grado di qualità degli ecosistemi indagati e darà precise inidicazioni per gli opportuni interventi di risanamento e bonifica ambientale. <<<

Risultati parziali attesi

Il progetto tende ad approfondire gli aspetti ecofisiologici di specie esposte a vari tipi di impatto dovuti a, scarichi industriali/urbani, aree portuali, attività antropiche, ed a stimare, per via biologica, il livello di inquinamento, di aree marine.Tende inoltre alla definizione degli effetti citotossici dell'inquinamento sull'epitelio branchiale di tutti gli organismi sentinella presi in esame ed in particolare sui tipi cellulari specializzati come gli elementi paraneuronali.
I dati forniti dall'indagine biomolecolare sugli organi presi in esame di individui sottoposti a stress naturale e/o indotto (mitili trattati dall'UO di GE), potrebbero evidenziare una diversa espressione dei geni delle metallotioneine, NOS, aquaporine e heat shock proteins, rispetto agli esemplari di controllo. Il rilevamento degli effetti di contaminanti sul DNA, sia in termini di mutazioni cromosomiche che di rottura del filamento di DNA (singolo o doppio) fornirà
l'entita del danno genotossico attribuibile ai contaminanti presenti di tutti gli organismi sentinella presi in esame ed in particolare sui tipi cellulari specializzati come gli elementi paraneuronali presenti,
Il risultato finale sarà l'elaborazione di un modello relativamente ai processi di esposizione-effetto dei metalli pesanti nelle specie considerate. Tale modello oltre a fornire delle informazioni peculiari, consentirà, nella fase successiva dello studio in natura, una migliore interpretazione dei risultati ottenuti.
Tali studi consentiranno di evidenziare i livelli di bioaccumulo dei metalli negli organismi campionati fornendo una misura della loro biodisponibilità ambientale. Da quest'ultimo aspetto dipendono i successivi processi di interferenza a livello delle attività enzimatiche studiate. La sintesi di queste informazioni fornirà il dato finale sullo stato di contaminazione dell'area.

La seconda fase (8 mesi) consisterà nella correlazione dei dati ottenuti nella fase precedente con quelli relativi a tutte le U.O. che utilizzeranno modelli metodologici diversi; ciò consentirà di individuare le risposte molecolari e cellulari al fine di analizzare imeccanismi di azione per la mesa a punto di biomarkers più sensibili all'inquinamento ambientale.
In questa ricerca, la proteomica/genomica, rappresenta il terzo importante livello di indagine utilizzato dalle U.O. GE. Gli obiettivi dell'analisi proteomica sono: la possibilità di verificare sperimentalmente i pathway dedotti dall'analisi dei microarray; (ii) studiare le modifiche post-traduzionali delle proteine; (iii) la possibilità di identificare nuovi e sicuri marcatori (biomarkers) di esposizione a composti inquinanti poco caratterizzati (per es. i distruttori endocrini).
Alcune proteine che risulteranno di particolare interesse per via di notevoli cambiamenti quantitativi o qualitativi, saranno ulteriore oggetto di indagine mediante approcci immunoistologici e immunobiochimici, che prevederanno la realizzazione di anticorpi specifici a partire dalle sequenze aminoacidiche indentificate.
I risultati ottenuti mediante l'utilizzo di metodologie innovative nel campo del biomonitoraggio ambientale, quali le analisi di espressione genica e proteica, verranno confrontati con i risultati sullo stato di salute degli organismi forniti dai biomarkers. Inoltre tale ricerca, nella sua complessità, dovrebbe portare ad identificare nuove proteine coinvolte nella risposta a interferenti endocrini EDC e, pertanto, ad evidenziare un pattern proteico tipico della risposta ad un particolare inquinante (o classe di inquinanti). I dati ottenuti permetteranno di valutare quantitativamente se ai cambiamenti nell'espressione genica corrispondono variazioni nella concentrazione e/o nelle modificazioni post-trasduzionali delle corrispondenti proteine e di avviare ricerche più approfondite sul possibile ruolo biologico delle proteine identificate. I dati raccolti permetteranno la messa a punto di adeguate sonde per RT-PCR quantitativa per dare una corretta valutazione circa le variazioni quantitative di alcuni mRNA del DNA microarray. Le indagini relative alle analisi genomica e proteomica contribuiranno alla identificazione di nuove proteine e/o trascritti coinvolti nella
risposta allo stress e i dati ottenuti verranno associati a quelli relativi alle alterazioni della batteria di biomarkers.
L'integrazione di tutti i risultati, consentirà di correlare l'evoluzione dell'alterazione dei profili di espressione genica e proteica con la risposta adattativa degli organismi alle variazioni ambientali valutata a livello cellulare, tissutale ed organismico. In particolare,i dati ottenuti dai campioni prelevati in campo, da siti caratterizzati dalla presenza di diversi inquinanti, quali metalli pesanti, idrocarburi (IPA), industriali e potenzialmente contenenti EDC, permetteranno di identificare specifiche risposte a particolari classi di inquinanti, mentre gli esperimenti in laboratorio permetteranno l'identificazione di bersagli
molecolari di distruttori endocrini rispetto a quelli dell'estrogeno naturale. Questi risultati forniranno informazioni chiave per la valutazione degli effetti di sostanze inquinanti ad azione estrogenica/antiestrogenica in Bivalvi marini e permetteranno lo sviluppo di biomarker specifici di distruzione endocrina.
La determinazione dei contaminanti bioaccumulati nelle specie da noi indagate, e l'importante compendio informativo costituito dall'analisi del proteoma di alcuni campioni accuratamente selezionati potranno migliorare l'interpretazione complessiva dei risultati e fornire preziosi spunti per ulteriori ricerche e per la definizione di analisi praticabili in estesi programmi di biomonitoraggio.


Lo studio, complesso ed articolato, permetterà di valutare lo stato di inquinamento biologico ed il rischio tossicologico dei composti inquinanti sugli organismi marini attraverso un approccio originale basato sulla valutazione delle risposte che gli organismi mettono in atto nei confronti di uno stress ambientale. Ciò permetterà di identificare lo stato qualitativo dell'ambiente e gli interventi più idonei per la sua tutela. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Molte sostanze persistenti, non sottoposte a degradazione ambientale o metabolizzazione possono in certe condizioni essere accumulate dopo essere state assunte per via alimentare, branchiale o per via cutanea. Si parla di bioaccumulo quando un organismo assume sostanze e le concentra nei propri tessuti con una relazione diretta tra le concentrazioni misurate nell’organismo ed il tempo ed i livelli di esposizione. La misura dei livelli di bioaccumulo viene normalmente utilizzato per la valutazione della contaminazione ambientale da metalli pesanti.
Elementi quali il cadmio, il piombo, l’arsenico generalmente non sembrano determinare processi di bioaccumulo crescente in funzione del livello trofico ma piuttosto in funzione della nicchia trofica (es: filtratori, detritivori, organismi associati al sedimento). Il mercurio al contrario è il solo metallo che attraverso la catena trofica realizza processi marcati di biomagnificazione in quanto la sua forma organica (metilmercurio) è relativamente stabile e affine alle strutture biologiche. Il mercurio, inoltre, tende ad essere metilato nei sedimenti anossici da parte dei batteri anche se la molecola del metilmercurio è molto sensibile alla fotodegradazione. Il processo di rilascio di metilmercurio ed il suo conseguente intrappolamento nella biomassa vivente è quindi molto più efficace nelle zone buie e profonde (Bacci,1989). In letteratura sono stati riportati casi nei quali i livelli di bioaccumulo del mercurio in organismi bioindicatori erano correlabili con la profondità di cattura (Leonzio et al., 1982). Le concentrazioni dei metalli pesanti possono essere misurate negli organismi in toto (soprattutto quando si tratta di organismi di piccola taglia) oppure selezionando organi e tessuti quali sedi particolari di bioaccumulo (ghiandola digestiva di molluschi e crostacei, fegato e rene nei pesci).
L’analisi del bioaccumulo dei metalli pesanti negli organismi è un sistema di valutazione della loro biodisponibilità ambientale. Il bioaccumulo dei metalli può essere considerato un importante indizio di esposizione specialmente se comparato in organismi della stessa specie provenienti da aree a differente impatto. Questo però dovrebbe essere sempre correlato con altri indicatori di “benessere” fisiologico che vanno generalmente sotto il nome di biomarker.
L’aspetto tipicamente diagnostico dei biomarker si associa al loro significato prognostico di imminente stress o danno all’individuo e conseguentemente alla popolazione. Il metabolismo di alcuni composti biologici endogeni può essere alterato dalla presenza di inquinanti che provocano un accumulo anormale dei prodotti di sintesi intermedi.
La ricerca di nuovi approcci per la valutazione degli effetti biologici di sostanze inquinanti e l’identificazione dei meccanismi molecolari coinvolti costituisce uno dei maggiori e più attuali interessi della ricerca in campo ambientale. In particolare, un approccio integrato genomico/proteomico consente di analizzare da un lato il profilo trascrizionale di un elevato numero di geni (tramite DNA microarray), fino alla quantificazione di singoli trascritti di interesse (tramite real time PCR), dall'altro i profili di espressione e le modificazioni post- traduzionali delle proteine (via elettroforesi 2D, spettrometria di massa ed analisi statistica) (Koskinen et al., 2004; Jenny et al., 2004; Waters e Fostel, 2004; Storey, 2006; Venier et al., 2006; Dondero et al., 2006).
L’integrazione dell’approccio genomica/proteomica/biomarkers riveste pertanto un enorme potenziale ove applicato nei programmi di monitoraggio ambientale. Esso appare particolarmente promettente nello studio dei meccanismi di azione di una particolare classe di inquinanti organici noti come distruttori endocrini (EDC), quali pesticidi, alchilfenoli, PCB, in grado di interferire con il sistema endocrino degli organismi, con effetti nocivi sullo sviluppo e la riproduzione e possibili conseguenze a livello di popolazione e comunità (Witorsch et al., 2002; Rotchelle and Ostrander, 2003).
L'analisi del profilo trascrizionale di un campione condotta tramite l'uso dei "DNA-microarray" consente di determinare i livelli di trascrizione di piu' geni contemporaneamente (fino a migliaia) con elevata sensibilita' sfruttando il principio di ibridizzazione tra sequenze geniche complementari, con enormi benefici in termini di rapidita', flessibilita' e rapporto costi/benefici.
La proteomica consiste nell’analisi sistematica del profilo di espressione delle proteine che permette, tramite misurazioni quali-quantitative, di caratterizzare un determinato processo biologico ed identificarne i meccanismi molecolari (Williams 1996; Anderson e Anderson, 1998). Tale approccio sta diventando sempre più diffuso grazie a recenti progressi tecnologici e strumentali per la separazione e identificazione delle proteine (Hunphery-Smith et al., 1977), ed è stato utilizzato anche su organismi aquatici (Knigge et al., 2004; Jenny et al., 2004; Mi et al., 2005; Bjornstad et al., 2006). L’'utilizzo della proteomica in campo ambientale si basa sul principio che il pattern di espressione proteico rispecchia la risposta dell’organismo a stress ambientali (Corella e Ordovas, 2005; Lopez-Barea e Gomez-Ariza, 2006).
Un'elevata concentrazione di metalli pesanti nell'ambiente provoca nei Teleostei alterazioni nell'omeostasi del calcio, danni istomorfologici tra i tessuti più esposti a tale rischio, quale l'epitelio respiratorio, dove i contaminanti possono agire direttamente, con compromissione della concentrazione ionica nei fluidi extracellulari ed alterazioni della capacità osmoregolativa. Le branchie rivestono, quindi, un ruolo fondamentale oltre che nella respirazione, anche nei meccanismi sensoriali e di osmoregolazione e rappresentano il primo bersaglio dell'azione tossica degli eventuali inquinanti presenti. In questo quadro generale, lo studio del sistema di regolazione paracrina riveste un significato particolare per la diretta esposizione dell'epitelio all'ambiente esterno. L'individuazione di cellule paraneuronali nell'epitelio branchiale ha consentito di capire come queste funzioni possano essere controllate e coordinate in sede locale (Dunel-Erb et al. 1982; Bailly et al. 1992; Mauceri et al 1999). Gli studi condotti sui modelli di distribuzione di sostanze bioattive, filamenti intermedi e proteine leganti il calcio negli epiteli branchiali di individui normali ed in condizioni sperimentali (Fasulo et al. 1998, Mauceri et al. 2002, 2005) rappresentano dunque una fondamentale base di riferimento per valutare l'effetto di sostanze xenobiotiche su un sistema di regolazione paracrina locale particolarmente sensibile e le cui disfunzioni possono incidere pesantemente sullo stato generale (Triebskorn et al, 2007). L'utilizzo di organismi acquatici come bioindicatori della qualità dell'ambiente è ampiamente adottato a causa delle loro peculiari caratteristiche di accumulo di contaminanti. Infatti, organismi esposti a livelli subletali di metalli sono spesso capaci, tramite l'innesco di meccanismi fisiologici, di compensare le condizioni ambientali alterate anche con un incremento della tolleranza agli stessi metalli (McDonald &amp; Wood, 1993). L'iperproduzione di muco riscontrata nelle branchie di esemplari provenienti da ambienti acquatici contaminati rappresenta una risposta di difesa (Rinaldi et al, 2005). Il muco, infatti, agisce da barriera alla diffusione dell'ossigeno provocando un'accentuata ipossia (Part &amp; Lock, 1983; Handy et al. 1989). La reazione locale all'ipossia implica una più intensa produzione di sostanze vasoattive, come l'ossido di azoto o di endoteline, (Mauceri 1999, 2005). Ciò conferma quanto osservato da Wood (1992), secondo il quale, negli organismi acquatici, le branchie, essendo il sito primario della regolazione ionica e degli scambi gassosi, rappresentano sistemi estremamente sensibili alla tossicità dei metalli pesanti. <<<