RICERCA ITALIANA     

Meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nel rimodellamento muscolare indotto da elettrostimolazione in soggetti giovani ed anziani.

Università degli Studi di Padova

Abstract

Il presente progetto di ricerca è dedicato allo studio della Neuro Electrical Muscle Stimulation (NEMS/NMES) nell’uomo. In particolare lo studio sarà focalizzato sulla NEMS ad alta frequenza applicata per brevi periodi ripetuti quotidianamente: in base alle conoscenze disponibili questo tipo di protocollo aumenta la massa e la forza muscolare, senza modificare la resistenza alla fatica. Il progetto si prefigge di descrivere la risposta muscolare a NEMS e la comprensione dei meccanismi molecolari coinvolti, con l'obiettivo di migliorare i protocolli e quindi di poterli applicare al trattamento riabilitativo e preventivo, in particolare negli anziani con sarcopenia. A questo fine il progetto si propone di descrivere le modificazioni del muscolo sottoposto a NEMS cronica e studiare le vie di segnale attivate. Tutti i proponenti hanno competenze di biologia e fisiologia muscolare, ma molto diversificate fra loro, e questo permetterà che il problema verrà affrontato sotto angolazioni diverse.

Una posizione centrale nel progetto è dedicata agli esperimenti di NEMS che saranno condotti dalle unità di Pavia e di Chieti su volontari sani giovani e anziani. I muscoli sottoposti a NEMS verranno poi caratterizzati in vivo con misure di forza e di massa muscolare eseguite prima durante e dopo il protocollo di stimolazione. Campioni di muscolo verranno prelevati per agobiopsia prima e dopo l’esecuzione del protocollo e studiati in collaborazione con le diverse unità sfruttando le competenze proprie di ciascuna unità. La caratterizzazione a livello cellulare e molecolare delle biopsie prevede:
I) la misura della dimensione delle fibre in sezioni istologiche
II) la misura della forza e della velocità di accorciamento su singole fibre muscolari
III) l'analisi proteomica dei cambiamenti di espressione proteica con uso di gel bidimensionali
IV) l'analisi di espressione mediante real time PCR su un set di geni pre-selezionati.

Si prevede inoltre di avviare colture primarie da cellule satelliti provenienti da biopsie raccolte prima e dopo la NEMS, e di confrontarle tra loro.

Lo studio proteomico e di espressione, tuttavia, non ha solo una finalità descrittiva: si propone anche di individuare markers della risposta, geni la cui espressione a livello di RNA o di proteina cambia in modo significativo nei muscoli stimolati in relazione a un efficace rimodellamento. Questo dovrebbe consentire la messa a punto di markers molecolari per seguire in singoli individui l’evolversi della risposta a un determinato protocollo di NEMS, anche in condizioni di rilevanza clinica.

Lo studio descrittivo analitico sarà accompagnato dallo studio delle vie di segnale extra- e intracellulare attivate dalla NEMS. Saranno così studiati fattori ad azione extracellulare già noti per la loro importanza nella plasticità muscolare, come IGF-1 e miostatina; fattori regolatori della miogenesi, come gli MRF; fattori di controllo delle cellule satelliti, come Pax7. Saranno esplorate vie di segnale intracellulare, come AKT. Inoltre, basandosi sulle competenze specifiche delle unità partecipanti al progetto, saranno indagate alcune vie di segnale poco conosciute, ma potenzialmente importanti nel rimodellamento muscolare: si tratta della via di segnale attivata da S1P (sfingosina 1 fosfato), della proteina S100B e del recettore RAGE con il suo ligando HMGB1. Infine, tenendo presente che l’attività muscolare si accompagna alla produzione di radicali liberi dell’ossigeno (ROS) e che questi possono svolgere un ruolo significativo nelle risposte adattative si dedicherà una particolare attenzione alla modificazione dello stato ossidativo indotto dalla NEMS.

Un elemento caratterizzante il progetto è il confronto fra soggetti giovani e soggetti anziani, per quanto attiene alla capacità di rispondere con incrementi di massa e forza muscolare alla NEMS ad alta frequenza. Il progetto si propone non solo di verificare se la risposta sia mantenuta o ridotta negli anziani, ma anche di comprendere le cause di una eventuale riduzione. A questo scopo serviranno le indagini sia sulle vie di segnale attivate a seguito di NEMS e implicate nel rimodellamento, sia sulla condizione delle cellule satelliti nel muscolo anziano e sulla loro potenziale attivazione a seguito di NEMS. La conoscenza sulla efficacia di NEMS nel soggetto anziano sarà rilevante per valutare il suo potenziale uso nella prevenzione o nel trattamento della sarcopenia. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Francesco Mascarello Università degli Studi di PADOVA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il presente progetto si propone di raggiungere i seguenti obiettivi:
1 - Caratterizzare le modificazioni strutturali e funzionali del muscolo indotte da NEMS (proteine marker e singole fibre);
2 - Chiarire i meccanismi molecolari alla base degli adattamenti del muscolo scheletrico indotti da NEMS identificando i targets e i pathways coinvolti nel processo di adattamento (ipertrofia, atrofia da disuso e sarcopenia);
3 - Definire la relazione rischio-beneficio di un trattamento di lunga durata con NEMS nel giovane e nell’anziano;
4 - Valutare l’efficienza di NMES nel contrastare gli effetti della sarcopenia sulla funzione e sulla struttura delle singole fibre muscolari;
5 – Fornire elementi per valutare una possibile applicazione clinica di NEMS.
La risposta a NEMS sarà analizzata con approcci di tipo strutturale, funzionale, proteomico e con uno studio delle principali vie segnale coinvolte nella miogenesi, nel rimodellamento e nella risposta ipertrofica muscolare. Le competenze di singoli laboratori che già da tempo lavorano in modo autonomo su aspetti diversi della biologia e fisiologia del muscolo scheletrico sono riunite in un progetto integrato che permetterà di avere risultati tra loro confrontabili ed integrabili a proposito dell’effetto di NEMS su soggetti normali e sarcopenici (anziani). In particolare l'unità di Pavia ha già definito in studi preliminari i protocolli per una NEMS con sicuri effetti ipertrofizzanti su soggetti giovani e sani.
Il confronto prima e dopo NMES evidenzierà i cambiamenti funzionali del muscolo in vivo, su singole fibre e i meccanismi molecolari alla base del rimodellamento. Particolare attenzione sarà data al confronto degli effetti prodotti da NEMS tra soggetti giovani ed anziani. Un obiettivo è l'identificazione di markers che potrebbero essere utilizzati come indicatori specifici del rimodellamento muscolare; tali markers potrebbero essere evidenziati mediante piccole biopsie meno invasive rispetto a quelle tradizionali.
I protocolli di NEMS considerati in questo progetto sono già stati approvati dai comitati etici dell’Università di Chieti e di Pavia e sono conformi alla Dichiarazione di Helsinki.

Obiettivo 1: Caratterizzare le modificazioni strutturali e funzionali del muscolo indotte da NEMS (proteine marker e singole fibre).
Il progetto si propone di descrivere la risposta muscolare nell’uomo alla NMES esaminando aspetti non ancora indagati delle modificazioni strutturali e funzionali del muscolo. Sul materiale bioptico si evidenzieranno le variazioni del pattern proteico mediante mappe proteomiche 2D e saranno identificate le proteine differenzialmente espresse. In parallelo, mediante uno studio di espressione con Real-time PCR, verrà valutata l’espressione di una serie di geni preselezionati. Fra i geni verranno studiati sia a livello di RNA che di proteina, le isoforme della miosina (unità di Padova-Veterinaria e di Pavia) e ciò permetterà di seguire lo spostamento del fenotipo muscolare. L'individuazione di geni con specifici cambiamenti di espressione sarà la base per la identificazione di markers specifici per la risposta alla NEMS.
Dalle biopsie si otterranno per dissezione singole fibre sulle quali studiare le proprietà funzionali legate alla risposta contrattile: indagini preliminari indicano un aumento della forza specifica delle fibre di tipo 1 dopo NMES. Inoltre lo studio di espressione delle isoforme delle MyHC condotto, a livello di proteina e di RNA, su singole fibre e in modo particolare sulle fibre ”ibride” 2A/X, chiarirà il mismatch tra i livelli di espressione e il riscontro delle corrispondenti isoforme dell'MyHC. Lo studio delle fibre ibride permetterà di evidenziare in modo più accurato l’azione indotta dalla NEMS sull’espressione delle isoforme delle MyHC nell’ipertrofia nei giovani e nel rallentamento della sarcopenia negli anziani.

Obiettivo 2: Meccanismi molecolari alla base del rimodellamento del muscolo scheletrico a seguito di NEMS individuazione dei targets e dei pathways.
Nelle biopsie muscolari raccolte prima e dopo elettrostimolazione, verranno esaminati i principali meccanismi intracellulari e umorali che possono essere responsabili delle variazioni di attività e massa muscolare. In base alle diverse competenze delle unità saranno studiati diversi meccanismi. Ci proponiamo quindi di definire A) le modificazioni nell’espressione sia di IGF-1 che agisce stimolando le cellule satelliti ma anche agendo direttamente sulla fibra, che della miostatina che svolge un ruolo inibitorio sulla massa muscolare; tra i processi miogenici verranno studiati una serie di fattori di trascrizione (MRF) che sono classificati come fattori “determinanti” (MyoD, Myf5), “differenzianti” (miogenina) e di “amplificazione” (MEF2) e fattori alla base del turnover delle cellule satelliti (Pax7) (Unità Padova Veterinaria). B) Il ruolo di fattori che regolano l’attivazione di cellule satelliti che proliferano, differenziano e fondono formando nuove fibre. Tra questi verrà analizzato il ruolo della S100B intracellulare abbinato all'espressione ed attivazione di RAGE che stimola il differenziamento mioblastico e la formazione di miotubi. RAGE non più espresso a sviluppo completato è riespresso in alcune situazioni nell’adulto. L’elettrostimolazione potrebbe riattivare questa via probabilmente con modalità diversa tra giovane ed anziano (Unità Perugia). C) La modificazione delle caratteristiche delle cellule satelliti a seguito della stimolazione indotta dalla NEMS (Unità Chieti). D) Il ruolo fisiologico svolto da S1P e quello dei suoi recettori, in particolare delle vie segnale attivate (Unità Padova-Fisiologia). La caratterizzazione di questa via di segnale sarà estesa anche a un modello di stimolazione cronica nel ratto. Ci si propone di sviluppare nel ratto un protocollo di NEMS sovrapponibile a quello sviluppato nell’uomo da altre Unità del progetto di ricerca e in grado di produrre ipertrofia al fine anche di valutare il danno.

Obiettivo 3: Definizione del rapporto Rischio/beneficio in un trattamento con NEMS di lunga durata.
NMES è collegato ad effetti collaterali come iperCKemia e dolore muscolare e l’incerta relazione rischio/beneficio ha contribuito a limitarne l’applicazione rispetto all’esercizio volontario. Infatti, sebbene NEMS possa essere più efficace rispetto all’allenamento volontario nel migliorare la forza nei pazienti ipoattivi e nonostante sia privo di rischi traumatici, gli effetti collaterali appaiono a volte elevati. Proponiamo di definire un protocollo che consenta di ridurre i danni e di definire dei markers sia di risposta che di danno in modo da valutare il rapporto rischio/beneficio su singoli casi (unità di Pavia).

Obiettivo 4: Determinazione dell’efficienza di NEMS nel contrastare gli effetti della sarcopenia sulla funzione e sulla struttura delle singole fibre muscolari.
I processi di senescenza a livello delle cellule satelliti potrebbero limitare le capacità di risposta ipertrofica nell’anziano. Ci proponiamo un confronto fra le cellule satelliti del giovane e quelle dell’anziano al fine di mettere in evidenza eventuali differenze (Unità di Chieti e di Perugia). Inoltre ci proponiamo di verificare se la NMES ad alta frequenza nell’anziano sia in grado di limitare il danno da ROS che si associa all’esercizio fisico aerobico.

Obiettivo 5: Fornire elementi per valutare una possibile applicazione clinica di NEMS.
La NEMS può essere uno strumento utile per mantenere le masse muscolari in persone immobilizzate. Ci proponiamo di definire protocolli ottimali di stimolazione per minimizzare il danno e aumentare la risposta e, inoltre, di individuare una serie di markers molecolari, facilmente determinabili in piccoli campioni bioptici, ottenibili su biopsie con ago sottile. La disponibilità di tali markers sarà finalizzata alla valutazione della risposta miogenica da un lato, e del danno muscolare dall’altro. <<<

Risultati parziali attesi

Il presente progetto si propone di:
- ottimizzare un protocollo di elettrostimolazione NEMS ad alta frequenza;
- di identificare markers specifici dello stato di funzionalità muscolare che induce ipetrofia nel giovane;
- di verificare se nell'anziano il NEMS induca un miglioramento di massa e forza muscolare, mediante reclutamento di cellule satelliti;
- di identificare marker utilizzabili per monitorare il recupero funzionale nell'anziano;
- di identificare nuovi potenziali regolatori della miogenesi;
- di utilizzare biopsie poco invasive e quindi meno dolorose.

In riferimento agli obiettivi generali sopra indicati che sono stati articolati sui cinque punti presentati nella sezione “Obiettivi Finali”, si ritiene di poter individuare i seguenti risultati attesi dalla attività integrata e coordinata delle cinque unità.

Obiettivo 1. Caratterizzare le modificazioni strutturali e funzionali del muscolo (proteine marker e singole fibre).
Ci aspettiamo di riuscire a evidenziare in modo completo le modificazioni a carico delle fibre muscolari e il danno da elettrostimolazione.
A questo fine si procederà ad uno studio: a - morfologico mediante ematossilina-eosina e tricromica di Masson per le analisi morfometriche; b - di identificazione dei diversi tipi di fibre mediante uno studio istochimico (ATPasi-miosinica) ed immunoistochimico mediante anticorpi specifici per le isoforme delle MyHC di tipo 1, 2A e, per sottrazione, di tipo 2A/X e 2X.

Su singole fibre spellate “skinned” si procederà: a - ad una valutazione funzionale valutando forza specifica (Po/CSA) e massima velocità di accorciamento ( Vo); b - sulle stesse fibre si valuterà il pattern delle isoforme della MyHC mediante SDS-PAGE quantitativa.

Il profilo di espressione proteica verrà esaminato mediante elettroforesi 2D e analisi subproteomica del grado di fosforilazione di proteine selezionate, l’identificazione degli spot separati mediante 2D sarà condotta con spettrometria di massa (MALDI-TOF).
Per l’identificazione di markers specifici per la risposta alla NEMS quali le isoforme della MyHC si analizzerà, prima e dopo trattamento sia nel giovane che nell’anziano, lo spostamento del fenotipo muscolare espresso (dal tipo 2A al tipo 2X) mediante uno studio di espressione quantitativa con Real-time PCR parallelamente allo studio quantitativo delle corrispondenti isoforme. Verranno utilizzate delle sonde specifiche TaqMan.
Per risolverà il problema del mismatch tra espressione delle isoforme dell'MyHC e proteina corrispondente, si eseguirà uno studio parallelo su singole fibre. Per lo studio nelle fibre “ibride” del cambiamento in percentuale da una isoforma all'altra, riconducibile all’effetto della NEMS, verrà studiato nella stessa fibra il livello proteico delle MyHC e di espressione dei relativi geni.

Obiettivo 2. Meccanismi molecolari alla base del rimodellamento del muscolo scheletrico a seguito di NEMS: Individuazione dei targets e dei pathways.
Ci aspettiamo di individuare nelle biopsie muscolari, raccolte prima e dopo elettrostimolazione nel giovane e nell'anziano, alcuni importanti meccanismi di regolazione intracellulari e umorali che agiscono sulla dimensione (ipetrofia) e sul tipo delle fibre muscolari.

- Fattori che agiscono sulla fibra e sulla miogenesi.
Saranno disegnati primers e sonde TaqMan specifiche per lo studio di espressione qualitativa e quantitativa dell’ IGF-1, MyoD, MSTN, HIF, VEGF, Ubiquitin-ligase (Hsp), CAT, SOD; tra i fattori miogenici l’espressione di MRF MyoD, Myf5, MEF2 e Pax7.

- Fattori che regolano l’attivazione di cellule satelliti e il loro differenziamento.
RAGE normalmente non è espresso nei muscoli adulti. Noi ipotizziamo che nei muscoli e/o loro cellule satelliti, a seguito di NEMS, RAGE possa essere ri-espresso e che l'espressione sia inversamente correlata all'atrofia/invecchiamento; l'attivazione avviene attraverso il suo ligando HMGB che ha un ruolo attivo nei processi infiammatori). Per supportare tale ipotesi pensiamo di operare come segue.
In colture di cellule satelliti ottenute dalle biopsie verrà studiata l’espressione di RAGE e la secrezione del suo ligando HMGB1 mediante Western blot, ELISA, RT-PCR, immunoistochimica ed ibridazione in situ. Per avere informazioni sui fattori e/o meccanismi che regolano il rilascio di HMGB1 i mioblasti primari e linee di mioblasti verranno trattati: a - con fattori noti per la loro capacità di attivare le cellule satelliti e/o spingerle verso uno stato proliferativi (bFGF, HGF, TNF-alfa, S100B); b - fattori e condizioni noti per favorire il differenziamento miogenico (insulina, fattori insulino-simili, vasopressina).
Per analizzare la relazione tra RAGE e Pax 7 si studieranno gli effetti di un blocco funzionale di RAGE in mioblasti differenziati tramite trasfezione con un mutante di RAGE e il blocco di espressione di Pax7 tramite RNA interference.
Verranno analizzate con diverse tecniche le vie metaboliche attraverso cui S100B intracellulare agisce per bloccare il differenziamento dei mioblasti. Allo studio sull’espressione di S100B durante lo sviluppo pre e post-natale, si affiancherà quello condotto sul tessuto scheletrico adulto per verificare se la sua espressione sia modulata dopo elettrostimolazione nelle cellule satelliti in situ o nelle colture derivate da biopsie.

- Ruolo fisiologico svolto dalle vie segnale di S1P attivate dalla NEMS
Ci si aspetta di identificare il ruolo dei recettori specifici per S1P e delle corrispondenti vie segnale attivate durante l'elettrostimolazione e l'effetto prodotto dall'invecchiamento. A questo scopo: a - sarà messo a punto e validato un modello animale di elettrostimolazione che provochi effetti paragonabili a quelli della stimolazione su uomo; b - sarà somministrato attraverso mini pompe osmotiche S1P sul muscolo stimolato, per tutta la durata del programma di stimolazione, e sul muscolo di controllo S1P contemporaneamente a modulatori delle possibili vie segnale legate al lipide; c - sarà analizzato mediante Western blot dell’omogenato di questi diversi muscoli, trattati e non con S1P, stimolati e non, l’espressione dei recettori S1P1-3 e l’attivazione di elementi chiave delle possibili vie segnale coinvolte nell’azione trofica di S1P; d - saranno esaminate le vie che regolano la massa muscolare attraverso la co-somministrazione di S1P con modulatori di ERK1/2 o di PI3-K/Akt (ad esempio, rapamicina, inibitore di mTOR, il principale effettore di Akt, LY-294002 e wortmannin, inibitori della PI3-kinase o Ro 31-8220, attivatore di Akt) o con inibitori della calcineurina, come ciclosporina A o FK506, per valutare se questa via è coinvolta nell’azione di S1P nel rimodellamento muscolare.
Una volta individuati i recettori e le vie segnale attivate verranno valutati i livelli di espressione mediante RT-PCR e Western blot dei recettori S1P1-3 nelle biopsie umane prima e dopo elettrostimolazione, sia in soggetti giovani che vecchi. In questo modo si potrà determinare il ruolo della via di segnale di S1P nell'invecchiamento e l'efficacia da parte dell'elettrostimolazione nell'attivare questa via, in soggetti di diverse età.


Obiettivo 3. Definizione del rapporto Rischio/beneficio in un trattamento con NEMS di lunga durata.
Il programma di allenamento per indurre un aumento della forza massima volontaria (MVC) comprenderà: a - il reclutamento di soggetti maschi giovani (20-30 anni, n=12) e anziani (70-80 anni, n=12); b - test preliminari neuromuscolari in vivo quali scossa singola e doppia a carico di entrambi i quadricipiti a riposo; c - MVC di entrambi i quadricipiti con registrazione elettromiografica (EMG); d - valutazione del livello di attivazione e del potenziamento post attivazione. Il programma di NEMS sarà completato in condizioni isometriche con 30 sessioni per 8 sett (3-4 sessioni/sett) come descritto da Maffiuletti e collaboratori.
Le agobiopsie del muscolo vasto laterale prima e dopo NEMS saranno eseguite come descritto da Bergstrom. L’ago utilizzato permette di ottenere circa 100mg di tessuto che sarà suddiviso in fascetti e conservato, per le successive analisi,in azoto liquido per l’analisi dell’espressione genica e proteica, per elettroforesi 1D e 2D, in una soluzione ad alto potassio, EGTA e glicerolo per l’analisi delle singole fibre e infine in tissuetek che poi viene congelato in azoto liquido per le analisi morfologiche ed isto-immunoistochimiche.

Ci aspettiamo di essere in grado di valutare il rapporto rischio/beneficio attraverso la raccolta di informazioni analitiche sia sul danno indotto da stimolazione che sul miglioramento di massa e di forza del muscolo. Il danno viene esaminato tramite lo studio morfologico delle biopsie abbinato ad uno di immunoistochimica che evidenzia, con l’anticorpo anti miosina neonatale, le cellule che rigenerano a seguito di danno muscolare. I dati di funzionalità meccanica in vivo, i dati morfometrici di ipertrofia, i cambiamenti a carico dell’espressione delle diverse isoforme della MyHC, abbinati allo studio dei meccanismi molecolari che regolano la biogenesi, saranno indicativi dei benefici indotti dalla NEMS nel giovane e nell’anziano.

Obiettivo 4. Determinazione dell’efficienza di NMES nel contrastare gli effetti della sarcopenia sulla funzione e sulla struttura delle singole fibre muscolari.
Riteniamo che risultati significativi in vista del raggiungimento di questo obiettivo si possano ottenere studiando le modificazioni delle caratteristiche delle cellule satelliti a seguito della stimolazione indotta dalla NEMS. A tale scopo verrà utilizzato un protocollo per coltivare le cellule satelliti e verificare la purezza delle colture, già messo a punto da una delle unità.
Sulle cellule satelliti verrà studiato: 1 - il danno ossidativo tramite dosaggio di carbonili proteici e malondialdeide (MDA); 2 – l’attività degli enzimi antiossidanti (Superossido dismutasi, catalasi, glutadione-perossidasi, glutadione-reduttasi, glutadione-trasferasi tramite saggi spettrofotometrici; 3 – la differente sensibilità ai ROS di mioblasti e miotubi ottenuti da biopsie (giovane, anziano, prima e dopo NEMS) mediante esperimenti di CA2+ imagining; 4 – localizzazione di RyR e DHPR mediante immunostining con l’uso di diversi mAbs; 5 – l’influenza dei perossidi (ROS) sulle proprietà elettriche dei miotubi che si contraggono mediante la tecnica del perforating patch-clamp; 6 – l’influenza dei ROS sulla funzionalità mitocondriale mediante lo studio del potenziale di membrana mitocondriale (capacità a generare ROS e a rispondere a ROS come H2O2); 7 - la possibile induzione di ROS durante la miogenesi da parte di ATP e ACh mediante l’utilizzo di antagonisti di recettori ionotropici; 8 - la capacità di mantenere una adeguata distribuzione ionica mediante l’esecuzione di saggi enzimatici della Ca-ATPasi e binding della Rianodina e del [3H]PN200-110; 9 – la tecnica di voltage clamp per analizzare l’azione dei ROS a livello della giunzione neuro muscolare; 10 – un profilo post trascrizionale mediante la tecnica microarray dei campioni bioptici.

Obiettivo 5. Fornire elementi per valutare una possibile applicazione clinica di NMES.
I risultati attesi da questa ricerca consentiranno di superare alcuni dei fattori che hanno contribuito a limitare la comprensione dei meccanismi alla base della risposta muscolare a NEMS. Ci si attende che i risultati siano probabilmente diversi nel giovane rispetto all’anziano riguardo alla potenzialità miogeniche
L’obiettivo è di dimostrare che la NEMS possa essere uno strumento utile per mantenere le masse muscolari in persone immobilizzate e trovare quindi pratica applicazione nella terapia riabilitativa. L’identificazione di marker indicativi dello stato di funzionalità muscolare potranno in futuro essere utilizzati in clinica per valutare le terapie di recupero funzionale. I markers molecolari che sono anche determinabili in piccoli campioni bioptici, permetteranno di monitorare il recupero funzionale eseguendo biopsie con ago sottile.
La disponibilità di tali markers in clinica sarà utile per una valutazione della risposta miogenica da un lato e del danno muscolare dall’altro.
La NEMS ad alta frequenza potrebbe inoltre rappresentare un protocollo di allenamento efficace in soggetti anziani per portare ad un recupero della massa, grazie a reclutamento di cellule satelliti, con beneficio sia nella forza che nella resistenza.
La NEMS ad alta frequenza che stimola le fibre anaerobiche potrebbe ridurre la produzione delle specie ossigeno reattive (ROS) che vengono prodotte in gran quantità nell’anziano con una attività di tipo aerobica. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

LA STIMOLAZIONE ELETTRICA DEL MUSCOLO UMANO. La stimolazione elettrica neuromuscolare (NEMS) esercita significativi effetti sul fenotipo e sulla funzione muscolare. NEMS è ampiamente utilizzata come strumento per l’allenamento alla forza negli atleti in aggiunta ai convenzionali metodi di allenamento, in soggetti inseriti in programmi di riabilitazione in ambito geriatrico e cardiovascolare e in protocolli di prevenzione della sarcopenia. Il principio base di NEMS è l’applicazione di stimoli elettrici in forma di treni di impulsi intermittenti e successiva attivazione delle terminazioni assonali motorie. NEMS normalmente utilizza frequenze di stimolazione tra 20 e 60Hz e durate tra 200 e 400micros. La stimolazione recluta preferenzialmente gli assoni motori rispetto agli assoni sensoriali e questo consente l’attivazione diretta degli assoni motori. In NEMS si utilizzano diverse frequenze di stimolazione distinte in basse frequenze (LF,&lt; 40Hz) e alte frequenze (HF,&gt; 40Hz). Entrambi i protocolli sono in grado di aumentare la massima forza volontaria (MVC) muscolare e/o la capacità all’esercizio. HF NMES sembra in grado di indurre un maggiore aumento della forza muscolare, mentre la stimolazione LF è associata ad un minore aumento di forza e ad un maggiore incremento della resistenza alla fatica. Tuttavia non è ancora disponibile uno studio comparativo completo. HF NEMS è stata occasionalmente associata ad aumento del CK plasmatico e dolore muscolare che ne limitano l’uso. Inoltre non esiste una chiara indicazione sul rapporto rischio/beneficio di NEMS rispetto all’esercizio volontario. Infatti, sebbene HF NEMS risulti essere più efficace dell’allenamento volontario nel determinare un aumento di forza nel soggetto sedentario, il rischio di insorgenza di effetti collaterali è più alto. Nel progetto di ricerca ci proponiamo una approfondita valutazione del rapporto rischio/beneficio associato a HF NEMS con lo scopo di chiarire il possibile impiego di NEMS nell’allenamento e nella riabilitazione.

INVECCHIAMENTO E SARCOPENIA. Considerando gli effetti generali di NEMS sul muscolo (aumento di forza e massa), di grande interesse è anche la sua possibile applicazione nella prevenzione della sarcopenia da invecchiamento. La sarcopenia è una condizione del tessuto muscolare scheletrico dato da perdita di massa, forza e capacità funzionale. È un processo multifattoriale derivante dal rimodellamento delle unità motorie, dalla diminuzione di livelli ormonali, dal danno da stress ossidativo, dalla diminuita capacità rigenerativa delle cellule satelliti. Il processo comincia con la perdita di motoneuroni che muoiono con l’invecchiamento, con conseguente denervazione delle fibre muscolari. Inoltre con l’età diminuisce la capacità rigenerativa delle cellule satelliti, pool di cellule quiescenti del muscolo scheletrico adulto, che in seguito a vari stimoli vengono attivate, proliferano e fondono per formare nuove fibre. Pochi studi hanno analizzato gli effetti di NEMS sulla funzione muscolare in soggetti anziani in vivo e non sono disponibili dati relativi ai cambiamenti indotti da questo protocollo a livello di singole fibre nella condizione di sarcopenia. Lo studio degli effetti e dei meccanismi che vengono attivati da NEMS potrebbe dare indicazioni relativi all'uso di questo protocollo nel contrastare il fenomeno sarcopenia nei soggetti anziani, soprattutto in quelli che non possono seguire un regolare programma di allenamento volontario. L’analisi degli effetti di NEMS potrebbe offrire vantaggi significativi nel comprendere se questo programma di allenamento, da solo o in combinazione con l’allenamento volontario, sia in grado di ridurre il rischio di danno traumatico nei soggetti anziani. In particolare NEMS potrebbe essere applicato in soggetti immobilizzati a letto oppure molto sedentari, poco inclini ad essere coinvolti in un regolare programma di allenamento volontario.

CARATTERIZZAZIONE DELLA RISPOSTA. La risposta del muscolo alla NEMS si può valutare in vivo con determinazioni della forza di contrazione (ad esempio nella massima contrazione volontaria o MCV) e della massa, possibilmente valutata con metodi di immagine quali RM. Si può poi valutare, su biopsie, innanzitutto la dimensione delle fibre in sezioni istologiche (area della sezione trasversa), la meccanica di singole fibre muscolari dissezionate dalla biopsia e la composizione proteica con elettroforesi e Western blot o la espressione genica con microarray e PCR. Un ruolo particolarmente importante viene attribuito alle isoforme delle proteine miofibrillari ed in particolare alle catene pesanti della miosina (MyHC). Le isoforme delle MyHC sono considerate i markers molecolari dei tipi di fibre e il cambiamento della loro espressione è correlato alle caratteristiche funzionali del muscolo. L’espressione delle diverse isoforme può quindi essere correlata: 1- alla specie; 2- a situazioni funzionali che modificano il pattern di espressione tra le diverse isoforme; 3- all’origine embriologica dei muscoli, 4- all’evoluzione. Le fibre muscolari degli arti e del tronco nell’uomo sono formate da fibre “pure” che esprimono una sola isoforma delle MyHC (tipo 1, 2A e 2X) ma anche da fibre “ibride” che coesprimono più isoforme (fibre di tipo 1/2A, 2A/X e 2X/B). Nelle specie di maggior taglia e nell’uomo le fibre “ibride” sono molto abbondanti e sembrano rappresentare degli elementi stabili. La plasticità muscolare potrebbe agire modulando il rapporto dell’una o dell’altra isoforma nell’ambito della stessa fibra.
L’effetto della NEMS, studiato in esperimenti preliminari da alcuni gruppi proponenti questo progetto, ha determinato un aumento delle dimensioni delle fibre (ipertrofia) accompagnato ad un cambiamento nel pattern di espressione delle isoforme delle MyHC. In questo caso si è evidenziata una riduzione della isoforma di tipo 2X a vantaggio del tipo 2A (13).

LE VIE DI SEGNALE. Nella stimolazione elettrica (NEMS) come nelle diverse forme di allenamento il rimodellamento/plasticità delle fibre muscolari si verifica in modo coordinato attraverso l'attivazione di diverse vie segnale. Tra queste, quella di PI3K/Akt/mTor sembra avere un ruolo centrale nel regolare la massa muscolare, mentre la via calcineurina/NFAT, sembra essere coinvolta nel regolare la specializzazione delle fibre. Anche le vie della CaMK e delle MAP chinasi dipendenti da Ras sembrano attive in questi processi. Negli ultimi anni, sono stati identificati anche i meccanismi umorali che accoppiano l’attività muscolare e la sua massa. Tra questi fattori, il più rilevante sembra essere IGF-1 che svolge un ruolo positivo di regolazione della massa muscolare, mentre miostatina svolge un ruolo inibitorio. La risposta alla stimolazione potrebbe coinvolgere anche le cellule satellite, attivate da un eventuale danno alle fibre muscolari adulte indotto dalla stimolazione elettrica. Diventano in questo caso importanti i fattori che controllano la proliferazione e il differenziamento delle cellule satelliti, come gli MRF, Pax7 e, in senso inibitorio, ancora miostatina. L'effetto della NEMS su questi fattori nel muscolo umano non è conosciuto e in particolare mancano informazioni relative ai meccanismi di risposta alla stimolazione durante l’invecchiamento muscolare.

LA SFINGOSINA-1-FOSFATO. Altri fattori trofici umorali possono tuttavia essere coinvolti nel rimodellamento muscolare. Recenti evidenze suggeriscono che il lipide bioattivo sfingosina 1-fosfato (S1P) possa avere un ruolo nel rimodellamento del muscolo. S1P, prodotto dalle cellule a partire dalla sfingomielina, controlla molti processi biologici agendo prevalentemente su specifici recettori di membrana, accoppiati a proteine G, che attivano diverse vie segnale. Molte di queste vie coincidono con quelle attivate nel rimodellamento del muscolo scheletrico ed è importante sottolineare che due recettori specifici (S1P1 e S1P3) sono presenti sulla membrana delle fibre muscolari. Inoltre il muscolo scheletrico è in grado di generare S1P attivando la via della degradazione della sfingomielina, particolarmente durante l’attività contrattile. Recenti evidenze dimostrano che S1P è in grado di regolare diverse funzioni nella linea muscolare C2C12, tra cui l’organizzazione del citoscheletro e la motilità, ma anche sembra agire come fattore miogenico. Inoltre, S1P sembra coinvolto nell’attivazione delle cellule satelliti nel muscolo scheletrico.

I RADICALI LIBERI DELL’OSSIGENO. Vari fattori, incluse le specie ossigeno reattive (ROS), sono ritenute esercitare importanti funzioni modulatorie nella regolazione dell’espressione genica del muscolo scheletrico. In questo tessuto i ROS sono generati e rilasciati durante l’attività fisiologica ed i loro livelli aumentano sia intra- che extracellularmente in colture di cellule muscolari con l’attività contrattile, ma il pathway che media il segnale dei ROS rimane ancora sconosciuto. Sebbene l’aumentata formazione di ROS sia stata ritenuta a lungo nociva, vi sono ormai svariate evidenze di un importante ruolo dei ROS nel signaling cellulare, che potrebbe alterare l'equilibrio redox delle proteine. Questo potrebbe essere molto importante per l’attivazione di risposte miogeniche da parte di cellule satelliti. Comunque, poiché durante l’invecchiamento si modifica il controllo dell’omeostasi del Ca2+, in seguito a modificazioni dello stato redox di proteine regolatorie del Ca2+ , è possibile che i ROS influenzino transienti di Ca2+ correlati al pool di Ca- IP3 e RyR dipendenti, condizionando anche la capacità funzionale delle miofibre. In esperimenti preliminari condotti su muscolo umano di anziani, i ricercatori afferenti all’unità di Chieti hanno dimostrato che si verifica un aumento di danno ossidativo a macromolecole con alterazione della capacità antiossidante endogena, non solo nelle fibre muscolari mature, ma anche nelle cellule satelliti, nonostante il loro stato quiescente. Questo stato di stress ossidativo potrebbe contribuire all’alterazione della capacità rigenerativa del muscolo in cui tali cellule risiedono. La capacità del muscolo di rigenerare pienamente in seguito a danno diminuisce con l’età e questo contribuisce allo sviluppo di debolezza muscolare e fisica in generale. Una rigenerazione muscolare completa dipende strettamente da un adeguato cross-talking tra nuove fibre e motoneuroni associati al muscolo rigenerante immaturo. Le modificazioni regolate nella formazione dei ROS sono importanti nel mantenere i normali sequenza e sviluppo dei processi miogenici. Ad es. l'ossido nitrico (NO) funge da messaggero retrogado nelle co-culture nervo-miotubo e i cambiamenti della sua concentrazione facilitano la fusione di mioblasti in miotubi. Comunque i cambiamenti età-correlati in queste interazioni sono scarsamente conosciuti ma chiaramente giocano un ruolo importante nei processi rigenerativi difettosi. Inoltre sostanze endogene come ATP extracellulare inducono ROS nel muscolo scheletrico.

S100B e RAGE. Altri meccanismi di regolazione potrebbero giocare un ruolo importante, ma tuttora poco esplorato nella risposta alla NEMS. S100B, un membro della famiglia multigenica di proteine Ca2+-modulate del tipo EF-hand con attività regolatrici intracellulari ed extracellulari, inibisce il differenziamento mioblastico inattivando la p38 MAPK e stimola la proliferazione dei mioblasti attivando le chinasi ERK1/2 in maniera recettore-dipendente. S100B potrebbe, pertanto, sostenere l’attivazione e la proliferazione delle cellule satelliti nel corso della rigenerazione e dell’ipertrofia muscolari, al pari di bFGF e HGF. La S100B è espressa nei mioblasti. Tuttavia mancano informazioni circa il ruolo di S100B nei mioblasti e la regolazione dell’espressione di S100B nelle SC. In altri tipi cellulari, l’accumulo di S100B causa aumento della proliferazione ed inibizione del differenziamento, mentre l’inibizione dell’espressione di S100B causa una diminuita proliferazione. L’attivazione di RAGE (receptor for advanced glycation end products) stimola invece il differenziamento mioblastico e la formazione di miotubi, e la HMGB1 si lega a RAGE per accelerare questi due eventi. RAGE, un recettore multiligando della superfamiglia delle immunoglobuline, trasduce stimoli infiammatori ed effetti neurotrofici e neurotossici, ed ha un ruolo nella crescita tumorale. RAGE è espresso in vari tipi cellulari durante lo sviluppo embrionale, è represso a sviluppo completato ed è riespresso nell’adulto nel corso di diverse condizioni patologiche. HMGB1, un ligando di RAGE che attiva il recettore in tutti i tipi cellulari che lo esprimono, potrebbe partecipare alla rigenerazione muscolare stimolando RAGE. L’espressione di RAGE nelle miofibre è regolata durante lo sviluppo, essendo espresso fino all’11° giorno postnatale ma non oltre. Pertanto, RAGE potrebbe avere un ruolo durante il processo miogenico ed essere represso a sviluppo completato, mentre potrebbe essere riespresso in muscoli danneggiati contribuendo così alla rigenerazione muscolare. Il potenziale ruolo della coppia HMGB1/RAGE nella rigenerazione muscolare è sostenuto dal fatto che la somministrazione di HMGB1 in vivo promuove la rigenerazione muscolare in topi distrofici. La coppia HMGB1/RAGE inibisce la proliferazione dei mioblasti e ne stimola il differenziamento via p38 MAPK, mentre l’iperespressione di un dominante negativo di RAGE produce effetti opposti. Esiste inoltre una relazione diretta tra la quantità di RAGE espresso in linee di rabdomiosarcoma e la loro capacità di procedere verso il differenziamento miogenico, ed una relazione inversa rispetto alla loro migrazione, invasività e formazione di tumori in vivo. Questi dati indicano che RAGE trasduce un segnale promiogenico ed antiproliferativo nei mioblasti, e che la sua inattivazione funzionale potrebbe contribuire a difetti della miogenesi. Mancano tuttavia informazioni circa l’espressione e il ruolo funzionale di RAGE in SC in condizioni normali e patologiche, nell’invecchiamento e dopo elettrostimolazione muscolare. Mentre i mioblasti in coltura esprimono e rilasciano HMGB1, mancano dati sull’espressione e sulla regolazione dell’espressione e del rilascio di HMGB1 da parte di cellule satelliti in vivo.

In considerazione delle numerose e diversificate tematiche considerate nel progetto, risulta difficile, anche per limiti di spazio, fare in questo contesto una esauriente referenza bibliografica; i reviewers possono in ogni caso fare riferimento ai modelli B. <<<