RICERCA ITALIANA     

Implicazioni diagnostico-terapeutiche delle nuove conoscenze cliniche e molecolari del carcinoma midollare della tiroide.

Università di Pisa

Abstract

BACKGROUND: Il carcinoma midollare della tiroide (CMT) è un tumore che origina dalle cellule C parafollicolari. Il CMT è un tumore raro la cui incidenza, tra tutti i tumori tiroidei, è del 5-10%. Le mutazioni di RET sono le uniche alterazioni geniche descritte per questo tumore. Sia le mutazioni somatiche che germinali sono in grado di attivare in maniera costitutiva la via metabolica delle MAP chinasi, che a sua volta determina una proliferazione cellulare incontrollata. Le mutazioni puntiformi di RET sono responsabili di quasi tutte le forme ereditarie e di circa il 40% delle forme sporadiche di CMT. Dal momento che le caratteristiche cliniche e patologiche del CMT con e senza mutazione di RET sono molto simili, è ipotizzabile che l’attivazione della via delle MAP chinasi possa comunque essere responsabile della trasformazione tumorale nei due gruppi di tumori. Meccanismi alternativi alla mutazione di RET potrebbero essere implicati nella attivazione delle MAP chinasi e necessitano quindi di essere valutati. L’analisi genetica di RET costituisce un potente mezzo diagnostico per il CMT. Anche se l’analisi di RET è di supporto nella diagnostica, sfortunatamente la guarigione definitiva del paziente con CMT si ottiene solamente con una diagnosi precoce ed una tiroidectomia eseguita quando il tumore è ancora localizzato all’interno della ghiandola. La percentuale di sopravvivenza dei pazienti con CMT a 10 anni è di circa il 50% e arriva al 10% nei casi in cui metastasi a distanza siano presenti al momento dell’intervento. Ad oggi, nella pratica clinica, non esistono marcatori in grado di valutare la progressione del tumore.
SCOPI: Il presente progetto è dedicato a chiarire alcuni aspetti ancora controversi del CMT: la patogenesi dei casi RET negativi, la prognosi, lo stato finale di malattia e la terapia dei tumori metastatici più avanzati. Per svolgere questo progetto saranno perseguiti 3 obiettivi principali: a) analisi delle caratteristiche molecolari del CMT e identificazione di meccanismi alternativi per la trasformazione tumorale; b) identificazione di nuovi fattori prognostici e marcatori biomolecolari; c) identificazione di terapie mirate per il CMT.
PROCEDURE: per raggiungere questi obiettivi, le 5 Unità coinvolte nel progetto e caratterizzate per le loro competenze specifiche nell’ambito della ricerca sul CMT, collaboreranno allo svolgimento dei seguenti punti: a) per migliorare le conoscenze di base sul CMT saranno caratterizzate nuove mutazioni di RET e i casi di CMT RET negativi e positivi saranno confrontati a livello molecolare. Nei casi RET negativi sarà studiata l’attivazione della via delle MAP chinasi e, se confermata, saranno valutati i meccanismi alternativi per l’attivazione di RET, quali l’iperespressione e l’amplificazione genica di RET. Verranno anche studiate le alterazione di altre vie di traduzione del segnale (es: il pathway di Notch). Saranno anche ricercate mutazioni in geni codificanti per recettori tirosino chinasici diversi da RET [questa parte del progetto verrà prevalentemente svolta dalle Unità di Pisa, Roma e Napoli] b) sarà analizzato il ruolo delle mutazioni e dei polimorfismi di RET correlandoli con le caratteristiche cliniche e patologiche dei pazienti e con il loro stato finale di malattia. Dal momento che in modelli animali alterazioni di RET sono associate con disgenesia del rene, verrà confrontata la frequenza delle malformazioni renali in pazienti con CMT ereditario e sporadico. Per l’identificazione di nuovi fattori prognostici e diagnostici verranno analizzati i profili di espressione proteica nel siero e nel tessuto tumorale in pazienti con CMT sporadico o ereditario, RET positivi e RET negativi [questa parte del progetto verrà prevalentemente svolta dalle Unità di Pisa, Siena e Perugia] c) per individuare nuove terapie per i CMT che non rispondono più alle terapie convenzionali, alcuni inibitori delle tirosino chinasi, noti per la loro efficacia in vitro, saranno testati in pazienti con CMT avanzato. Inoltre, saranno studiati gli effetti antineoplastici di derivati pirazolo-pirimidinici, con particolare attenzione all’inibizione della via delle MAP chinasi e di Notch. Infine sarà valutato il possibile ruolo di inibitori delle tirosino chinasici o di COX-2 come adiuvanti nelle terapie convenzionali, che hanno scarso successo nel trattamento del CMT più avanzato [questa parte del progetto verrà prevalentemente svolta dalle Unità di Roma e Pisa].
RISULTATI ATTESI: questo studio dovrebbe identificare nuove mutazioni di RET e/o nuovi meccanismi di attivazione della via delle MAP chinasi soprattutto nei casi RET negativi. Ci proponiamo anche di individuare nuovi marcatori molecolari e sierici da utilizzare per predire l’aggressività e la prognosi del tumore. Infine, studi in vitro ed in vivo dovrebbero suggerire nuovi farmaci o nuove strategie terapeutiche. Questi risultati permetteranno di migliorare la gestione clinica di questa patologia rara ma letale. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Rossella Elisei Università degli Studi di PISA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Lo scopo complessivo del presente progetto è di studiare le caratteristiche molecolari del Carcinoma Midollare della Tiroide (CMT), di identificare meccanismi alternativi responsabili della trasformazione tumorale e di trovare nuovi indicatori prognostici e nuove terapie. Dal momento che questa neoplasia tiroidea è rara (0,05-0.1% di tutti i tumori umani) gli studi sono sempre stati eseguiti in serie limitate e con brevi follow-up. Nonostante il CMT sia un tumore raro è un tumore in grado di portare alla morte del paziente: la sopravvivenza a 5 anni è del 50% e diminuisce al 10% quando si presenta già ad uno stadio avanzato alla diagnosi. Terapie convenzionali, come la chemioterapia e la radioterapia, sono spesso inefficaci e spesso vengono utilizzate come palliativi. Visto che la patogenesi del CMT è legata all’attivazione del proto-oncogene RET, un gene che codifica per un recettore di membrana ad attività tirosino chinasica, si stanno studiano nuovi farmaci inibitori delle tirosino chinasi. Mentre il 99% dei CMT ereditari sono associati a mutazioni germinali di RET, mutazioni somatiche di questo gene sono presenti solo nel 40-50% dei CMT sporadici. E’ perciò verosimile che altri oncogeni o altri meccanismi di attivazione di RET siano responsabili dei rimanenti casi di CMT. Perciò, l’identificazione di questi meccanismi alternativi o di altri geni coinvolti nello sviluppo del CMT sarà di notevole valenza clinica non solo per meglio comprendere la patogenesi di questo tumore ma anche per sviluppare nuove strategie terapeutiche fondamentali per questi pazienti.
Il presente progetto si prefigge di raggiungere 3 obiettivi principali.
• OBIETTIVO 1 Analisi delle caratteristiche molecolari del CMT ed identificazione di meccanismi alternativi della trasformazione tumorale.
Questo obiettivo ha lo scopo di migliorare la comprensione dei meccanismi molecolari di trasformazione tumorale e di verificare se meccanismi alteranitiv alle mutazioni puntiformi di RET possano essere responsabili della sua attivazione e di conseguenza della via delle MAP chinasi. Questo obiettivo sarà realizzato attraverso il raggiungimento di specifici punti:
a) identificazione di mutazioni puntiformi di RET, classiche e mai descritte, in un’ampia casistica di CMT;
b) studio delle caratteristiche biochimiche e biologiche di mutazioni di RET mai descritte e della loro capacità di attivazione di questo gene;
c) identificazione di meccanismi alternativi di attivazione di RET, in particolare l’iperespressione dell’mRNA e l’amplificazione genica, per spiegare la patogenesi dei casi RET negativi;
d) analisi della sequenza di 90 geni codificanti per tutte le tirosino chinasi presenti nel genoma umano in vari tipi di CMT (familiari, sporadici, RET positivi e RET negativi), per verificare se, in questo tumore, oltre RET altre tirosino chinasi siano mutate;
e) analisi dell’attivazione delle chinasi determinando il livello di fosforilazione di recettori ad attività tirosino chinasica ed altre serine/treonine chinasi, sia in linee cellulari di CMT che in colture primarie e in tessuti tumorali.
Oltre a RET, sono noti altri meccanismi di trasformazione tumorale. Per questo motivo un ulteriore scopo sarà:
f) valutare l’espressione e le alterazioni di fattori appartenti alla via metabolica di Notch e dei loro geni bersaglio utilizzando in prima analisi modelli in vitro (linee cellulari di CMT) e dopo tessuti di CMT umano, in considerazione della presenza o assenza delle mutazioni somatiche di RET.
• OBIETTIVO 2 Identificazione di nuovi fattori prognostici e di nuovi marcatori molecolari
Dal momento che la guarigione di un paziente con CMT è dovuta principalmente alla completezza dell’intervento chirurgico, nuovi biomarcatori specifici per la presenza del CMT sarebbero importanti sia per un diagnosi precoce che per predire il grado di aggressività del tumore. Alcuni studi sul ruolo della mutazione di RET come fattore prognostico sono già stati riportati. Tuttavia i dati pubblicati sono stati ottenuti su casistiche limitate e con brevi periodi di follow-up. Per confermare questi dati e per identificare nuovi marcatori sono necessari studi ulteriori.
E’ noto che il proto-oncogene RET ed il suo ligando GDNF hanno un ruolo importante nello sviluppo renale. L’associazione tra CMT ereditario e malformazioni renali recentemente riportata pone la domanda se una tale associazione sia casuale o dovuta alla mutazione di RET. In questa parte del progetto valuteremo se una nuova patologia (anormalità nel sistema renale, urinario) possa essere inclusa nelle neoplasie endocrine multiple in relazione a specifiche mutazioni di RET. Per il raggiungimento di questo obiettivo saranno perseguiti i seguenti scopi.
a) studio del ruolo delle mutazioni somatiche e dei polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) di RET come fattori prognostici in un gruppo di casi di CMT con lungo follw-up;
b) Analisi dell’associazione tra mutazioni di RET e malformazioni renali in pazienti con CMT ereditario e, come controllo, con CMT sporadico;
c) Studio dei profili di espressione delle glicoproteine nel siero e nel tessuto tumorale di pazienti con CMT ed associazione con la presenza assenza delle mutazioni di RET.
• OBIETTIVO 3 Identificazione di terapie mirate per il CMT avanzato
Dal momento che quei pazienti che non guariscono in seguito al primo intervento chirurgico non rispondono alle terapie convenzionali, nuove strategie terapeutiche sono necessarie per curare questi pazienti. Scopo di questo progetto è di studiare nuove strategie terapeutiche basate sul controllo della proliferazione cellulare delle cellule di CMT, interferendo con gli stimoli ormonali di crescita. In questa parte del progetto verranno valutati, sia in vitro che in vivo, trattamenti alterantivi.
Gli scopi di questo obiettivo sono i seguenti:
a) studiare, in vitro, gli effetti di inibitori di COX-2 sulla crescita di linee cellulari derivate da CMT ed in particolare valutare la capacità di queste sostanze di potenziare gli effetti di farmaci come la vinorelbina nel trattamento del CMT;
b) dimostrare gli effetti antiproliferativi di una serie di molecole, derivanti da pirazol-pirimidina, che agiscono come inibenti delle proteine con attività tirosino chinasica coinvolte nella traduzione del segnale o nella modulazione della proliferazione cellulare delle cellule di CMT;
c) valutare gli effetti sinergici del trattamento combinato degli inibitori tirosino chinasici e di farmaci antineoplastici;
d) valutare in vitro la risposta delle cellule di CMT agli inibitori tirosino chinasici in realzione al via metabolica di Notch;
e) valutare l’efficacia terapeutica e gli effetti clinici di alcuni inibitori tirosino chinasici in protocollo clinici sperimentali. <<<

Risultati parziali attesi

Lo scopo principale di questa proposta di progetto è lo studio di alcuni aspetti molecolari del carcinoma midollare della tiroide (MTC) che dovrebbe permettere la scoperta di meccanismi di trasformazione tumorale alternativi e l’identificazione di nuovi marcatori utili alla diagnosi e prognosi di questa malattia molto rara. Verranno anche studiate nuove terapie, poiché questa malattia è letale nel caso in cui sia ad uno stadio avanzato e metastatico. Pensiamo che questo progetto porterà al raggiungimento di importanti risultati e grandi benefici clinici. La forza del progetto risiede nella rete di queste 5 unità che, pur con interessi diversi, sono tutte coinvolte nella ricerca sul MTC. Inoltre, poiché il MTC è una malattia molto rara (0,05-0,1% di tutti i tumori umani) solo la collaborazione tra centri di riferimento, come quelli che partecipano a questo progetto, può garantire un numero relativamente alto sia di tessuti tumorali che di pazienti da includere nei diversi aspetti della ricerca. I risultati che pensiamo di ottenere si possono dividere secondo i 3 diversi obiettivi che vorremmo raggiungere. Qui di seguito si riportano i dettagli dei risultati previsti e dei benefici clinici che possono derivare da essi.

OBIETTIVO 1 Analisi delle caratteristiche molecolari del MTC ed identificazione di meccanismi di trasformazione tumorale alternativi. In questo obiettivo ci aspettiamo di identificare le caratteristiche molecolari del MTC e di chiarire meccanismi di trasformazione tumorale alternativi. In particolare, il 50-60% degli MTC sporadici ed l’1-2% degli MTC ereditari sono privi di alterazioni genetiche note. Nei casi RET negativi non è stato dimostrato il coinvolgimento né delle mutazioni di RET, né di altri oncogeni noti, come p53, BRAF, RAS ecc. E’ probabile che nella trasformazione tumorale di questo gruppo di MTC siano coinvolti altri oncogeni o altri geni oncosoppressori e/o altri meccanismi di alterazione di RET. In questo contesto ci aspettiamo:

a) di trovare nuove mutazioni di RET, specialmente in quelle parti del gene analizzate meno frequentemente e di dimostrare la loro attività funzionale e trasformante.
b) di identificare negli MTC RET negativi meccanismi di attivazione di RET alternativi, come l’iper-espressione del mRNA di RET e/o l’amplificazione del gene. Entrambi i meccanismi possono portare all’attivazione del gene RET indipendentemente dalla presenza o assenza delle più note mutazioni puntiformi attivanti.
c) di verificare se l’attivazione della via delle MAP chinasi giochi un ruolo anche nella trasformazione tumorale degli MTC RET negativi. I livelli di fosforilazione delle proteine a valle come ERK rivelerà definitivamente se la via delle MAP chinasi è attivata anche in assenza delle mutazioni di RET. In questo caso verranno studiate le diverse modalità di attivazione della cascata delle MAP chinasi ( per esempio alterazioni genetiche di altre tirosino chinasi, l’iper-espressione dell’mRNA di RET o l’amplificazione del gene RET).
d) di identificare mutazioni in geni di tirosino chinasi diverse da RET che possano comunque essere coinvolte nella patogenesi del MTC, specialmente in quei casi dove è evidente l’attivazione della via delle MAP chinasi, ma non è presente alcuna mutazione di RET né somatica né germinale.
e) di trovare alterazioni in vie metaboliche intracellulari diverse dalla via delle MAP chinasi. In particolare ci aspettiamo di trovare alcuni cambiamenti nella via di Notch, sia a livello dei suoi componenti, sia a livello dei suoi geni bersaglio.

Siamo convinti che al momento la ricerca sul MTC stia progredendo molto lentamente. Dopo il riconoscimento della presenza delle mutazioni di RET come causa delle forme ereditarie di MTC, non sono stati cercati altri oncogeni nei casi privi di mutazioni di RET. I risultati che ci aspettiamo di ottenere con il raggiungimento di questo primo obiettivo del progetto porteranno ad un miglioramento delle nostre conoscenze sulla patogenesi di questo tumore raro ma aggressivo. Dal punto di vista pratico, la conoscenza di meccanismi alternativi che conducano alla trasformazione tumorale nei casi di MTC negativi per RET permetterà anche di sviluppare nuovi farmaci e nuove strategie terapeutiche volte ad inattivare questi meccanismi alterati.

OBIETTIVO 2 Identificazione di nuovi fattori prognostici e nuovi bio-marcatori di malattia. Lo sviluppo di questa parte del progetto dovrebbe portare alla definizione delle mutazioni ed i polimorfismi (SNP) del gene RET come fattori prognostici dell’andamento della malattia. Una migliore definizione del coinvolgimento di altre malattie, come le malformazioni renali nelle sindromi neoplastiche multiple e la loro correlazione con specifiche mutazioni di RET è uno dei risultati attesi di questo obiettivo. Infine, ci aspettiamo anche di scoprire nuove proteine da utilizzare sia per la diagnosi precoce che per la previsione dell’aggressività e di conseguenza dell’andamento della malattia. In particolare ci aspettiamo:
a) di chiarire la correlazione esistente tra le diverse mutazioni di RET e le caratteristiche cliniche e patologiche, così come l’andamento dei pazienti affetti da MTC.
b) di confermare il ruolo delle mutazioni di RET come fattori prognostici, paragonando l’andamento ed il tasso di sopravvivenza di un grande gruppo di pazienti con MTC positivi per RET ed un gruppo confrontabile con MTC negativi per RET.
c) di identificare definitivamente il ruolo di uno o più SNP come fattori predisponesti allo sviluppo del tumore e/o come indicatori dell’aggressività e/o l’andamento del MTC.
d) di verificare se le malformazioni renali possano essere parte della sindrome neoplastica endocrina multipla (MEN) e se la loro frequenza è simile nei pazienti con MTC ereditario paragonata a quella nei pazienti con MTC sporadico.
e) di trovare nuovi bio-marcatori sierici in grado di suggerire la presenza di MTC più precocemente possibile. Nei pazienti con MTC potrebbe essere identificato un tipo specifico di espressione di proteine sieriche in grado di distinguere questi soggetti da altri affetti da tumori tiroidei di altro tipo (cioè carcinomi tiroidei papillari o follicolari).
f) di identificare specifici bio-marcatori tissutali significativamente diversi nei tessuti normali e tumorali. L’analisi proteomica del tessuto normale e quello tumorale potrebbe portare all’identificazione delle proteine espresse in modo specifico nel tumore. Allo stesso modo il confronto tra i casi RET negativi e positivi mediante l’analisi proteomica potrebbe permettere l’identificazione di tipi specifici di espressione proteica.

I risultati che ci attendiamo di ottenere dal raggiungimento di questo secondo obiettivo del progetto avranno, a nostro parere, un grande e benefico impatto clinico per diverse ragioni. Prima di tutto, saranno di aiuto nella gestione clinica dei pazienti con MTC, poiché i fattori prognostici aiuteranno lo staff medico ad avere un’idea chiara dell’aggressività della malattia e quindi a scegliere e pianificare la strategia terapeutica più appropriata. I casi con fattori prognostici negativi verranno trattati in modo più aggressivo e sottoposti a controlli clinici più frequenti durante il loro follow up. L’identificazione di altre malattie da includere definitivamente nella sindrome MEN indicherà ai medici l’opportunità di valutare anche quegli organi che potrebbero essere coinvolti, come per esempio i reni ed il tratto urinario. In secondo luogo, l’identificazione di bio-marcatori sierici e tissutali mediante analisi proteomica permetterà di diagnosticare facilmente l’MTC in modo specifico, utilizzando soltanto pochi millilitri di sangue o poche cellule estratte dal tessuto tumorale mediante agoaspirato. Al momento queste sono solo applicazioni futuristiche, ma speriamo che i risultati positivi attesi da questa ricerca possano contribuire allo sviluppo di questo tipo di applicazioni diagnostiche.

OBIETTIVO 3 Identificazione di terapie mirate per l’MTC metastatico. Con il raggiungimento di questo obiettivo ci aspettiamo di identificare nuovi farmaci o nuove strategie terapeutiche alternative per migliorare il trattamento del MTC, specialmente nei casi con prognosi negativa. L’MTC di stadio avanzato e metastatico è al momento incurabile e c’è un urgente bisogno di altre opzioni terapeutiche per questi pazienti. Prima di tutto ci aspettiamo di provare che le nuove molecole inibitrici delle tirosino chinasi siano efficaci in vivo. Nel frattempo verranno esplorate altre strategia più convenzionali e ci aspettiamo di trovare il modo di migliorare i risultati delle terapie convenzionali mediante l’impiego di farmaci adiuvanti. Infine, potrebbero portare benefici clinici anche farmaci alternativi diretti contro altre vie metaboliche intracellulari come quella di Notch1, specialmente nei casi in cui l’ alterazione della via delle MAP chinasi non sia il meccanismo che porta alla trasformazione tumorale. In questo contesto ci aspettiamo:
a) di dimostrare il beneficio clinico (per esempio la stabilizzazione della malattia o, ancora meglio, la parziale remissione della malattia) degli inibitori delle tirosino chinasi, specialmente di quelli chiaramente diretti contro RET. Questi farmaci sono già stati provati in vitro con risultati molto buoni e promettenti. Probabilmente funzioneranno anche sui pazienti.
b) di scoprire che alcune molecole, come i derivati delle pirazolo-pirimidine, possano agire come inibitori delle tirosino chinasi coinvolte nella traduzione del segnale o nella modulazione della proliferazione cellulare in cellule di MTC. Verranno studiate sia la via delle MAP chinasi, sia la via di Notch1 con l’intento di dimostrare l’inibizione di almeno una delle due.
c) di dimostrare in vitro che gli inibitori di COX-2, utilizzati abitualmente per il trattamento dell’artrite e del dolore neoplastico, possano aumentare l’attività di farmaci come la vinorelbina, che viene utilizzata per il trattamento del MTC progressivo in alternativa alla doxorubicina assai meno efficiente, come è stato dimostrato. Un aumento della percentuale di pazienti con stabilizzazione di malattia dal 30% al 50-60% sarebbe di rilevanza clinica.
d) di dimostrare che la combinazione degli inibitori delle tirosino chinasi con farmaci antineoplastici noti possa avere un effetto sinergico e possa essere più efficace nel controllo della malattia.

Con questo terzo obiettivo del progetto ci aspettiamo di migliorare il campo delle strategie terapeutiche per i pazienti affetti da MTC. E’ noto che i casi con malattia avanzata e metastatica sono senza dubbio privi di ogni possibilità di sopravvivenza. Sono insensibili alle terapie convenzionali e solo in pochi casi possiamo ottenere una stabilizzazione della malattia (20-20% dei casi) con l’utilizzo della chemioterapia: un prezzo molto alto in cambio di un basso beneficio. I risultati che ci aspettiamo da questa parte della ricerca sono molto ambiziosi, ma non impossibili da ottenere. Negli ultimi anni sono stati sviluppati con successo nuovi farmaci per altri tumori umani che venivano prima considerati privi di ogni possibilità di cura. Pensiamo che almeno alcuni dei risultati attesi di questo obiettivo possano migliorare molto la gestione clinica di questi pazienti. Un prolungamento del tempo di sopravvivenza, se non la cura definitiva, non è un obiettivo impossibile e questa ricerca può contribuire ad ottenerlo. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il carcinoma midollare della tiroide (CMT) è un tumore tiroideo ben differenziato che origina dalle cellule C parafollicolari deputate alla produzione di calcitonina (CT). Il CMT è una neoplasia maligna molto rara di cui non si conosce l’incidenza e con una prevalenza del 10% tra i tumori tiroidei, che sono i più frequenti tumori endocrini e rappresentano circa l’1% dei tumori umani. L’importanza clinica del CMT risiede nell’elevata mortalità che è del 50% dopo 10 anni ed aumenta al 90% quando metastasi linfonodali e a distanza sono presenti alla diagnosi. La possibilità di curare definitivamente un paziente affetto da CMT è compromessa dalla presenza di invasione extratiroidea e/o di metastasi linfonodali e/o a distanza al primo intervento chirurgico.
La Calcitonina (CT) è il marcatore specifico e sensibile del MTC sia a livello sierico che tissutale. La CT sierica dovrebbe essere misurata nei pazienti con noduli tiroidei allo scopo di diagnosticare precocemente il tumore. Tale marcatore può anche essere utilizzato durante il follow up allo scopo di monitorare la malattia metastatica. La CT può essere anche cercata mediante immunoistochimica sul tessuto tumorale per la conferma della diagnosi. Ci sono pochi dati sul ruolo della CT sierica come fattore prognostico. Non sono state descritte differenze tra i valori di CT sierica tra i casi RET positivi e RET negativi. Poiché la CT sierica è un fattore importante per la diagnosi del MTC, non sono stati caratterizzati altri bio-marcatori. Per scoprire nuovi marcatori, in grado di rivelare la presenza della malattia o anticipare la prognosi e la risposta alla terapia, possono essere utilizzati nuovi strumenti, come la proteomica.
Nel 25% dei casi il CMT è una patologia ereditaria caratterizzata dall’associazione con altre neoplasie endocrine (MEN 2). Nel 1993, 2 gruppi indipendenti scoprirono che mutazioni germinali del gene RET, localizzato sul cromosoma 10, erano associate con CMT ereditario. Dopo questi primi studi, sono state identificate numerose mutazioni germinali di RET situate negli esoni 10, 11 e 13-16 le quali sono risultate associate al 99% delle sindromi MEN 2.
MEN2 e’ caratterizzata dalla presenza di tumori in tessuti derivati dalle creste neurali e mostra tre differenti varianti cliniche, MEN2A, MEN2B e Carcinoma Midollare della Tiroide Familiare (FMTC). In particolare, tutte e tre le forme presentano Carcinoma Midollare della Tiroide (MTC); segni aggiuntivi sono presenti in pazienti MEN2A (feocromocitoma e adenoma delle paratiroidi) e MEN2B (feocromocitoma, neuroma delle mucose e ganglioneuroma dell’intestino). Fino ad oggi nessuna altra malattia è stata associata alle già note neoplasie endocrine incluse nella MEN2, comunque è noto che il proto-oncogene RET ed il suo ligando GDNF possono giocare un ruolo essenziale nella morfogenesi renale. Durante lo sviluppo fetale, il recettore tirosin-chinasico codificato dal proto-oncogene RET è espresso in diversi tessuti, inclusi il sistema nervoso centrale e periferico (ad esempio, nei neuroblasti del sistema nervoso enterico), le cellule derivate dagli archi branchiali (incluse le paratiroidi), le cellule derivate dalle creste neurali (incluse le cellule C della tiroide ed il medullosurrene) ed i tessuti del sistema urogenitale. Sia i topi knock out per GDNF che quelli per RET mostrano avanzate anomalie renali (agenesia o grave disgenesia) e mancano di neuroni enterici secondo un quadro che ricorda la HSCR umana. Nonostante queste osservazioni, solo pochi casi di agenesia renale sono stati segnalati in pazienti con HSCR e, fino al 1998, nessun caso di malformazione renale è stata descritta in pazienti con FTMC. Nel 1998 è stata descritta una famiglia con mutazione germinale RET, nella quale la FMTC si associa con l’agenesia renale e la HSCR. Questa associazione suggerisce che anche nella specie umana, come nel topo e nel ratto, le mutazioni RET possono portare a malformazioni renali. Non è noto se alterazioni minori renali, asintomatiche, possano essere presenti a più alta frequenza nei pazienti con MTC ereditario, dato che in questi pazienti non sono mai stati effettuati screening sistematici a proposito delle malformazioni renali.
Piu’ del 90% dei portatori di MEN2 mostrano mutazioni puntiformi del gene RET codificante per un Recettore Tirosin Chinasico. La posizione della mutazione lungo la sequenza di RET correla con i tre differenti fenotipi di MEN2. La maggior parte delle mutazioni MEN2A e FMTC colpisce uno dei residui di cisteina extracellulari (C609, C611, C618, C620, C630, C634); i pazienti MEN2B portano due mutazioni localizzate nel dominio intracellulare e consistenti nel 93% dei casi nella sostituzione M918T e solo nel 3% dei casi della sostituzione A883F. Il FMTC e’ anche associato a mutazioni del dominio tirosin chinasico (E768D, L790F, Y791F, V804L, V804M, S891A). L’amplificazione degli alleli mutanti o la perdita dell’allele di RET wild type possono avvenire come secondo hit nei campioni MEN2. Le sostituzioni somatiche M918T e E768D sono trovate frequentemente anche negli MTC sporadici con una frequenza intorno al 40%. Inoltre, gli MTC RET-positivi sembrano essere caratterizzati da un comportamento clinico piu’ aggressivo in confronto agli MTC RET-negativi. Le basi molecolari di questa diversita’ sono poco comprese, dal momento che sono poco noti i cambiamenti genetici che sono presenti negli MTC RET-negativi.
In letteratura sono presenti dati contrastanti, ottenuti su casistiche limitate e con un breve follow-up, sul significato prognostico delle mutazioni somatiche di RET. Per confermare il ruolo della mutazione somatica di RET come indicatore prognostico sfavorevole occorrerebbero studi su casistiche di tumori con follow-up abbastanza lunghi, al momento non disponibili. Un’informazione di questo tipo sarebbe di notevole impatto clinico dal momento che, con l’eccezione dell’invasione extratiroidea e della presenza di metastasi, non ci sono altri indicatori prognostici. Se escludiamo l’oncogene RET, non sono stati identificati altri oncogeni associati a CMT. Comunque, con l’eccezione di un diverso esito della malattia, i due gruppi di CMT con e senza mutazione di RET non sembrano mostrare sostanziali differenze epidemiologiche e patologiche.
Le mutazioni RET/MEN2 hanno un effetto di acquisizione di funzione. La chinasi diventa attiva costitutivamente con meccanismi differenti, in dipendenza del sito con il cambio aminoacidico. I mutanti extracellulari mostrano una attivita’ chinasica costitutiva conseguente alla dimerizzazione ligando-indipendente. Il meccanismo di attivazione di RET dalle mutazioni intracellulari e’ meno chiaro. Probabilmente esse modificano la struttura della chinasi attivando costitutivamente la funzione enzimatica. Inoltre, per il mutante M918T e’ stato dimostrato un cambio di specificita’ per il substrato. Al di la’ di queste mutazioni frequenti, varianti rare di RET sono state identificate nei carriers MEN2, e per alcune di queste e’ stato dimostrato un effetto d’acquisizione di funzione. Nonostante cio,’ non e’ sempre ovvio se e come queste mutazioni possano indurre l’attivazione di RET. Come la maggior parte dei Recettori Tirosin Chinasico, RET accende i pathways di trasduzione RAS/MAPK e PI3K/AKT, che sono coinvolti nel mediare la proliferazione, la sopravvivenza e la trasformazione RET-dipendente. Ad oggi, non è noto se CMT RET negativi siano comunque da mettere in relazione con una diversa attivazione delle MAP-K. Per risolvere questo quesito sarebbe interessante studiare la fosforilazione di proteine come ad esempio la chinasi ERK. Inoltre, se la MAP-K risultasse attivata anche nei casi RET negativi, dovrebbero essere valutati meccanismi di attivazione come l’amplificazione genica o l’iperespressione dell’mRNA di RET.
Ad oggi non esistono terapie alternative per pazienti con CMT metastatici o avanzati. Infatti le terapie convenzionali sono inefficaci ed è quindi estremamente necessario individuare terapie alternative. Le terapie “mirate” rappresentano probabilmente il futuro per questi pazienti. Numerosi farmaci inibitori delle TK sono già stati testati su linee cellulari umane e ne è stato dimostrato l’effetto sulla riduzione della crescita cellulare. Studi clinici preliminari hanno inoltre dimostrato che inibitori di TK con affinità maggiore per RET hanno effetti positivi sull’andamento della malattia. Protocolli clinici sperimentali, che includano un numero maggiore di pazienti, saranno fondamentali per definire il possibile impiego terapeutico di questi farmaci. Dal momento che tutti gli studi in vitro che hanno utilizzato inibitori delle TK sono stati eseguiti su linee cellulari con RET attivato, sia per la presenza di riarrangiamenti RET/PTC [NIH-RET/PTC3] che di mutazioni puntiformi di RET [NIH-MEN2A, NIH-MEN2B], non è chiaro se anche i casi di CMT negativi per la mutazione di RET potrebbero trarre giovamento da questo trattamento.
Un possibile bersaglio delle nuove terapie molecolari per i pazienti affetti da MTC potrebbe essere la via del segnale di Notch. Recentemente è stato dimostrato che Notch1 inibisce la proliferazione cellulare e altera il fenotipo delle cellule di MTC. La famiglia dei recettori transmembrana Notch (Notch 1- 4), interviene attivamente nel controllo di una via di segnali intracellulari che regolano la differenziazione cellulare. L`interazione del recettore con specifici ligandi (famiglie Delta 1- 4 e Serrate/Jagged 1 e 2) induce il mantenimento di uno stato indifferenziato della cellula trasmettitrice e l`adozione di una via differenziativa alternativa della cellula che riceve tale segnale. Alterazioni della via di Notch sono state descritte in molte linee cellulari tumorali umane, con un duplice ruolo di oncogene od oncosoppressore. Una migliore comprensione del ruolo giocato da Notch1 nello sviluppo del MTC porterà alla possibilità di scoprire nuovi meccanismi di trasformazione tumorale e nuovi farmaci.
In attesa sia dei risultati dei protocolli sperimentali sugli effetti degli inibitori delle tirosino chinasi, sia di nuovi farmaci diretti contro altre vie metaboliche, è necessario esplorare altre strategie terapeutiche più convenzionali per i pazienti affetti da MTC che richiedono un trattamento immediato. Poiché è stato dimostrato che la doxorubicina non è efficace nel trattamento dei pazienti con MTC, sono state provati nuovi chemioterapici. La vinorelbina è uno dei farmaci alternativi utilizzati per i pazienti con MTC metastatico. La ragione principale di questa scelta è la dimostrazione, in studi clinici pilota, di alcuni benefici terapeutici (per esempio la stabilizzazione della malattia nel 30% dei casi) e di pochi e ben tollerati effetti collaterali. Si può ottenere un aumento dell’efficacia della vinorelbina associando questo farmaco ad altre terapie. E’ stato dimostrato recentemente che alcuni inibitori di COX-2 possono aumentare l’efficacia della doxorubicina, regolando l’espressione del gene MDR-1 (Multi Drug Resistence). Questi studi suggeriscono la possibilità di aumentare la sensibilità delle cellule di MTC, mediante l’impiego di inibitori di COX-2 che vengono attualmente utilizzati per il trattamento della osteoartropatia e del dolore neoplastico. <<<