RICERCA ITALIANA     

Aspetti spaziotemporali nella fisiologia e patologia cellulare dei segnali mediati dai secondi messaggeri

Università degli Studi di Padova

Abstract

Il progetto è presentato da un gruppo di ricercatori che condividono l’interesse nei meccanismi di segnale controllati da secondi messaggeri, in particolare Ca2+ e nucleotidi ciclici. Le Unità condividono molti approcci metodologici e utilizzano diversi modelli sperimentali. Gli obiettivi specifici sono coordinati e mirati ad una migliore comprensione di un problema chiave nella biologia cellulare (regolazione e bersagli dei secondi messaggeri), con potenziali applicazioni terapeutiche. Il progetto è coordinato dall’Unità I, che si occuperà in primo luogo di sviluppare nuove sonde fluorescenti per indagare l’eterogeneità subcellulare dei livelli dei secondi messaggeri in cellule vive. Saranno create nuove sonde indirizzate alla membrana mitocondriale esterna (per Ca2+ e cAMP) e al lume dei perossisomi (per il Ca2+), per acquisire una migliore comprensione dei ruoli funzionali che i microdomini di questi secondi messaggeri ricoprono nella fisiologia degli organelli. Gli esperimenti dell’Unità saranno anche focalizzati sullo studio del ruolo dell’eterogeneità dei secondi messaggeri nella fisiopatologia di due sistemi modello, miociti cardiaci e neuroni sensoriali olfattivi in coltura.

L’Unità II continuerà la collaborazione con l’Unita I nello sviluppo di nuovi hardware e software per l’analisi dei segnali fluorescenti nelle cellule vive. L’Unità ha sviluppato un prototipo funzionante di una nuova piattaforma di formazione di immagini confocali. L’Unità II proseguirà altresì la ricerca nel suo obiettivo di lunga data, la comprensione del segnale mediato da secondi messaggeri nella fisiopatologia dell’orecchio interno, con l’obiettivo di fornire nuovi approcci per il trattamento della sordità genetiche. I modelli sperimentali utilizzati saranno sia cellule in coltura che esprimono le connessine Cx26 e Cx30, mutanti e wild type, sia culture organotipiche di coclea. Ci si ripromette di ottenere risultati sulle proprietà funzionali dei canali gap junction in una situazione modello che assomiglia da vicino a quella dei pazienti. Infine, l’Unità II studierà i meccanismi di propagazione dell’onda di Ca2+ nell’orecchio interno, usando modelli murini knock out e wild type (ad esempio, topi knock out per Cx26 o di Cx30, per Px1 o P2X7R o topi con difetti nella sintesi di PtdIns(4,5)P2, knock out per PIPK1g).

Il progetto dell’Unità III mira a identificare nuove molecole e/o vie di segnale che possano diventare bersagli di strategie antitumorali, indagando la relazione tra NO, Ca2+ e ceramide in termini di crescita delle cellule tumorali. L’obiettivo finale di questa Unità è di ottenere informazioni generali sull’interazione tra sfingomielinasi acida/NO/GMP e il segnale Ca2+ nella tumorigenesi e di identificare proteine o passaggi critici che regolano l’attivazione e/o l’inattivazione della sfingomielinasi acida che possano diventare dei candidati per terapie antitumorali. Questo obiettivo sarà perseguito attraverso esperimenti in vitro e in vivo e trarrà vantaggio dall’utilizzo di topi sia wild type che knock out per la sfingomielinasi acida e/o dal sistema cellulare modello B16 di melanoma murino, wild type o trattate in modo da silenziare la NO sintasi e la sfingomielinasi acida.

All’interno di questo progetto, l’Unità IV si dedicherà a due obiettivi principali: da una parte, lo studio dei meccanismi molecolari e cellulari che portano all’incremento citosolico di NAADP, concentrandosi su cellule di origine neuronale, e, dall’altra, l’identificazione dei bersagli del NAADP (e di altri segnali di mobilizzazione del Ca2+) nella migrazione neuronale, in particolare il ruolo della calcineurina. Riguardo al primo problema, è stato dimostrato che il NAADP può essere trasportato attraverso la membrana plasmatica. In questo progetto l’Unità IV si propone di caratterizzare ulteriormente questo processo e di tentare di capire il suo significato fisiologico. Riguardo alla calcineurina, lo scopo sarà indagare il suo ruolo nel controllo dei programmi di trascrizione che regolano la migrazione neuronale (a sostegno del quale sono già state ottenute indicazioni preliminari).

L’Unità V concentrerà il suo programma sui segnali mediati dall’Acido Abscissico, ABA, una molecola extracellulare inizialmente descritta nelle piante superiori che, come ora è stato dimostrato, riveste un ruolo paracrino anche nelle cellule umane. La via di traduzione del segnale controllata dai recettori dell’ABA è stata caratterizzata solo parzialmente, ma si sa che coinvolge cADPR, Ca2+, cAMP e forse NAADP. Gli obiettivi finali dell’Unità V sono la caratterizzazione della natura molecolare del recettore dell’ABA in diverse cellule umane, della sequenza di eventi segnale mediata dal recettore dell’ABA e l’identificazione di farmaci in grado di interferire con le funzioni del recettore. Su quest’ultimo aspetto, si anticipa una collaborazione con l’Unità I nella ricerca di agonisti e antagonisti dei recettori di ABA. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Tullio Pozzan Università degli Studi di PADOVA

Obiettivo del Programma di Ricerca

L’obiettivo di questo progetto è riunire cinque gruppi per studiare in modo integrato alcuni processi chiave delle vie di segnale controllate dal Ca2+ (e quindi IP3, cADPR e NAADP), cAMP e cGMP (e quindi NO).
Per quanto riguarda l’Unità I, saranno perseguiti quattro obiettivi : i) identificare il meccanismo del rapido ingresso di Ca2+ nei mitocondri nelle cellule vive, affrontando in termini quantitativi la localizzazione e la grandezza dei microdomini ad alto Ca2+ responsabili del fenomeno; ii) sviluppare nuove sonde, ingegnerizzate a livello molecolare, per studiare in cellule vive il ruolo svolto dai perossisomi nell’omeostasi cellulare del Ca2+. Fino ad ora, si ignora se, e come, questi organelli partecipino al controllo del Ca2+ cellulare; iii) determinare il meccanismo attraverso il quale diversi agenti che influiscono sulla via del Ca2+ portano all’ipertrofia in cellule cardiache in coltura; saranno indagati il ruolo delle oscillazioni e degli sparks di Ca2+ nel controllo dell’ipertrofia; iv) determinare l’esistenza e l’importanza di gradienti subcellulari di cAMP, in particolare nella regolazione della forma e delle funzioni dei mitocondri e nella fisiologia dei neuroni olfattivi. L’Unità del coordinatore utilizza strumenti e tecniche che sono ben collaudate dal gruppo da parecchi anni e trarrà vantaggio da una stretta collaborazione con l’Unità II di questo progetto per l’indagine ad alta risoluzione della distribuzione subcellulare dei secondi messaggeri.

L’obiettivo dell’Unità II è progredire nella comprensione del ruolo delle vie di segnalazione nella fisiopatologia dell’orecchio interno. In particolare, visto che la misurazione veloce ed accurata delle dinamiche spazio-temporali dei secondi messaggeri è un fattore imprescindibile per il lavoro di tutte le Unità, l’Unità II, grazie alla lunga esperienza nel campo dell’ottica e dell’elettronica applicata alla biologia, si propone di completare lo sviluppo di nuovi hardware e software integrati per l’analisi quantitativa delle variazioni dinamiche dei segnali di fluorescenza (emessi dalle sonde sensibili ai secondi messaggeri) in cellule viventi. L’applicabilità biologica della strumentazione richiesta è al momento sotto verifica. Tale strumentazione è costituita da una piattaforma software e hardware dedicati capaci di integrare in tempo reale, mediante un sistema a funzionamento rapido (QNX) (usato nel campo della robotica), i segnali provenienti da una o più telecamere CCD e da differenti strumenti ad essa accoppiati. Il secondo obiettivo dell’Unità sarà quello di determinare, usando colture di linee cellulari trasfettate, le proprietà elettriche e di permeabilità dei canali eteromerici costituiti da connessina (Cx) 26 e 30, in paragone con i canali omomerici. Il terzo obiettivo principale sarà la determinazione dei determinanti molecolari responsabili della propagazione delle onde intercellulari di Ca2+ nel tessuto dell’orecchio interno. Modelli murini di sordità DFNB1, in cui manca Cx26 nell’Organo di Corti, o knock-out per Cx30, sono disponibili nel laboratorio nel contesto dell’FP6 Euro Hear Project. Analogamente, sono disponibili anche topi knock-out per Px1 o P2X7R grazie alla collaborazione con il Prof. Hannah Menier e il Prof. Francesco di Virgilio. Sono infine disponibili, a livello locale, topi con sintesi difettosa del PtdIns(4,5)P2 dovuta ad ablazione genetica di PIPK1 gamma, generati nel laboratorio del Prof. Pietro De Cavilli. Progettiamo di usare questi sistemi modello per chiarire i contributi relativi di canali e emicanali di connessina, pannexin 1, P2X7R (e il complesso di segnalazione di P2X7R/Px1), sintesi di IP3 e sua diffusione attraverso i canali delle giunzioni comunicanti, alla propagazione delle onde di Ca2+ generate da stimolazione meccanica o da agonisti extracellulari.

L’obiettivo dell’Unità III è identificare i diversi passaggi nell’azione di ossido nitrico (NO), Ca2+ e sfingomielinasi acida (A-SMasi), relativi alla regolazione dei loro effetti di segnalazione in relazione alla crescita e alla morte cellulare. Lo scopo è identificare nuovi obiettivi per terapie antitumorali efficaci. Questo sarà promosso tramite i seguenti passaggi: 1) identificazione delle vie di segnale coinvolte nell’attivazione e negli spostamenti dell’A-SMasi, e loro regolazione da parte di NO e Ca2+; 2) identificazione degli eventi molecolari coinvolti nell’inibizione dell’attivazione dell’A-SMasi da parte dell’NO; e 3) studio del ruolo di A-SMasi, NO e loro interazioni nella sopravvivenza e crescita cellulare in vitro e in vivo usando anche topi knock-out per l’A-SMasi già disponibili in laboratorio.
Gli esperimenti in vitro, portati avanti in collaborazione con l’Unità I, dovrebbero portare all’identificazione delle vie di segnale coinvolte negli spostamenti intracellulari di A-SMasi, definendo la correlazione temporale tra l’attivazione e la localizzazione intracellulare dell’enzima e gli eventi molecolari coinvolti nelle interazioni tra le vie di segnale attivate da sfingolipidi, Ca2+ e NO, con particolare enfasi sui loro effetti sulla crescita cellulare e sull’apoptosi. Il ruolo patofisiologico degli eventi molecolari osservati sarà poi analizzato in modelli di tumorigenesi in vivo.

Il progetto proposto dall’Unità IV riguarda da una parte lo studio della cascata di segnalazione controllata (in particolar modo nei neuroni) da NAADP, e dall’altra dei bersagli del segnale Ca2+ nei neuroni, in particolare concentrandosi sul ruolo giocato dalla fosfatasi attivata dal Ca2+, calcineurina, nella migrazione neuronale. Per indagare il segnale NAADP ci avvarremo dell’esperienza delle Unità II e V sul ruolo delle connessine e dei trasportatori dei nucleosidi nel permettere il flusso dei secondi messaggeri, mentre obiettivi condivisi con l’Unità I sul ruolo della calcineurina nelle vie di segnalazione permetteranno scambio di expertise, materiali ed esperienza. Più specificamente, miriamo ad ottenere una migliore comprensione del trasporto di NAADP attraverso la membrana plasmatici a del suo significato fisiologico nei neuroni. Inoltre, ci proponiamo di indagare se un simile trasporto esista in organelli intracellulari. Per quanto riguarda i bersagli del Ca2+ nelle cellule neuronali, il ruolo della calcineurina nella modulazione della trascrizione durante lo sviluppo è ormai assodato. L’ obiettivo dell’Unità V all’interno di questo progetto è indagare sul ruolo della calcineurina nel controllo dei programmi trascrizionali che portano alla migrazione neuronale, per il quale abbiamo già evidenze preliminari. In questo progetto vorremmo estendere queste evidenze, includendo la rivelazione delle vie ridondanti che possono esistere nei neuroni per permettere la migrazione.

Il lavoro dell’Unità V sarà incentrato nella comprensione del modo di azione, e in particolare sulla cascata di segnali (cADPR, Ca2+ e cAMP) attivati dai recettori di un fitoormone recentemente scoperto, Acido Abscissico, (ABA), in differenti tipi di cellule di mammifero ABA sembra comportarsi come una nuova citochina pro-infiammatoria, che è prodotta da, e agisce su, differenti tipi di cellule uomane. Gli obiettivi specifici all’interno di questo progetto sono i seguenti: i) studiare il ruolo paracrino di ABA in diversi sistemi di cellule umane, per identificare il recettore dell’ABA e la sua via di segnale, in particolare i secondi messaggeri prodotti, ii)indagare in cellule umane infiammatorie i principali passaggi coinvolti nella biosintesi dell’ABA; iii) identificare le dinamiche dei secondi messaggeri prodotti in risposta all’ABA e identificare analoghi sintetici dell’ABA per un’attività anti-ABA. La collaborazione con le Unità I e IV di questo progetto sarà di importanza notevole in molti aspetti del progetto sperimentale (identificazione dei secondi messaggeri, determinazione della loro localizzazione subcellulare, screening delle linee cellulari e degli inibitori). <<<

Risultati parziali attesi

I risultati da ottenere all’interno di questo progetto sono stati descritti in dettaglio sia nelle applicazioni delle singole Unità sia negli altri paragrafi del progetto. Qui ci limiteremo ad un breve riassunto dei risultati che ci aspettiamo di ottenere e delle possibili applicazioni di alcuni di loro.
Per chiarezza, il riassunto dei risultati sarà descritto separatamente per ciascuna unità, ma è chiaro che, almeno per alcuni di loro, l’interazione tra le Unità è essenziale (come descritto sopra).

Unità I
1. Entro la fine del progetto prevediamo di generare i seguenti nuovi costrutti di cDNA:
a) Quattro nuovi indicatori fluorescenti per il Ca2+ con differenti affinità per il Ca2+, basati su dei cameleons modificati e indirizzati al lato citosolico della membrana mitocondriale esterna. Non esistono, al momento, sonde di questo tipo, che saranno di valore inestimabile per studiare nelle cellule la generazione di microdomini di Ca2+ vicino agli organelli, come anche per studiare la modificazione dinamica della membrana mitocondriale esterna nelle cellule.
b) Due nuovi indicatori fluorescenti per il Ca2+ con differenti affinità per questo ione indirizzati al lume dei perossisomi.
c) Due nuovi indicatori fluorescenti per cAMP indirizzati alla membrana mitocondriale esterna.
Stiamo considerando la possibilità di brevettare questi costrutti. Utilizzando questi strumenti ci aspettiamo di ottenere nuove informazioni sulla fisiopatologia della regolazione del Ca2+ da parte dei mitocondri e dei perossisomi e sul ruolo di cAMP nelle funzioni mitocondriali. E’ da sottolineare che strumenti di questo tipo non sono attualmente disponibili e che potranno essere distribuiti in primo luogo tra i membri della proposta e successivamente alla comunità scientifica. I mitocondri sono al centro di un rinnovato interesse sia nella fisiologia cellulare sia, in particolare, nella patologia (rivestono un ruolo fondamentale nella morte cellulare programmata) e, di conseguenza, ogni nuova informazione in questo campo può avere un considerevole impatto nella comunità scientifica.

2. Prevediamo che si otterranno nuove informazioni circa il meccanismo dell’ipertrofia cardiaca in vitro, ed in particolare sul ruolo delle oscillazioni, dei picchi di Ca2+ e della via di segnale calcineurina-NFAT in questo processo. L’ipertrofia cardiaca e la fibrosi sono tra le più frequenti cause di morte nel mondo industrializzato, ma le vie di segnale che le controllano sono ancora in parte sconosciute. In particolare, mentre il ruolo del Ca2+ e della calcineurina nell’ipertrofia è largamente accettato, rimane da determinare come le cellule possano distinguere tra aumenti di Ca2+ “fisiologici”, che provocano la contrazione, ed aumenti di Ca2+ “patologici”, che causano ipertrofia.

3. Grazie all’uso di tutte le sonde descritte in precedenza e di altre già disponibili in laboratorio, prevediamo di ottenere nuove informazioni sul ruolo dei microdomini di cAMP nell’orientamento degli assoni e nel mantenimento della connessione nei neuroni sensoriali del sistema olfattivo, sia in coltura che in preparazioni “in situ”. Questa è una questione cruciale ed ancora non risolta nell’olfatto e che ha un potenziale significato fisiopatologico, non solo nell’ipo/anosmia ma anche in altre malattie neurodegenerative, come il Parkinson, dove i difetti dell’olfatto sono spesso sintomi precoci con un valore prognostico.

Unità II

1. Tecnologie per l’imaging. Ci si attende che l’unità II produca un prototipo funzionante di una nuova piattaforma confocale entro la fine del primo anno. Parte della tecnologia è già coperta da due brevetti, e almeno un altro brevetto sarà sottomesso a prototipo ultimato. Come si è detto precedentemente, l’hardware ed il software sviluppati dell’Unità II potranno essere duplicati a basso costo nei laboratori delle altre Unità, qualora se ne vedesse la necessità.

2. Stima della permeabilità di canali formati da connessine. Questi esperimenti sono volti a fornire nuove informazioni in merito alla permeabilità dei canali eteromerici di Cx26/Cx32. Saranno analizzati anche canali eteromerici nei quali una delle connessine reca una mutazione che causa sordità (Cx26V84L, Cx30T5M, ecc.), e le loro proprietà saranno confrontate con quelle dei canali wt. Mediante questo approccio sarà possibile attribuire un indice numerico quantitativo al difetto di permeabilità arrecato dalla mutazione.

3. Onde di Ca2+ nell’orecchio interno. I risultati di queste indagini saranno analizzati allo scopo di determinare la velocità e l’estensione delle onde in colture organotipiche provenienti topi KO per Cx26 o Cx30 in rapporto a topi wt. Saranno inoltre utilizzati topi KO per Px1 o P2X7R, e topi che presentano un difetto nella sintesi di IP3 a causa delle delezione di PIPK1gamma, allo scopo di determinare quale sia il ruolo di connessine, Px1, P2X7R, sintesi e diffusione di IP3 attraverso canali gap nella propagazione delle onde evocate da stress meccanico o dall’applicazione di agonisti extracellulari. Questi risultati contribuiranno a far luce sugli intricati meccanismi responsabili dell’omeostasi del potassio nella coclea, e sui difetti arrecati da mutazioni delle connessine.

Unità III
L’obiettivo complessivo dell' Unità III è lo studio delle relazioni intercorrenti tra NO Ca2+ e A-SMasi per identificare eventi e molecole rilevanti nella regolazione delle loro reciproche cascate trasduttive. Questi eventi e molecole potrebbero avere applicazioni importanti nella terapia dei tumori: evidenze molto concrete indicano che gli sfingolipidi generati dalla A-SMasi, soprattutto il ceramide, hanno un grande potenziale di sviluppo come agenti antitumorali. Il problema degli sfingolipidi è la loro molteplicità di azioni che ne ostacola l’utilizzo terapeutico.
1. Analizzando le relazioni reciproche tra NO Ca2+ e A-SMasi nella crescita tumorale ci aspettiamo di identificare nuovi bersagli con caratteristiche tali che possano permetterne il loro utilizzo in approcci terapeutici innovativi alla terapia antitumorale.

2. Il secondo obiettivo di questa unità è altrettanto importante ed ha implicazioni ampie più per la ricerca di base, poiché mira a produrre informazioni rilevanti sulla regolazione fine del bilancio di due messaggeri (NO e Ca2+) e di una via metabolismo dei lipidi (l’idrolisi della sfingomielina) che sono importanti attori in svariati processi biologici. In particolare, ci aspettiamo di ottenere un avanzamento significativo della nostra comprensione dei processi di crescita cellulare ed apoptosi. Un aspetto specifico che ci pare importante sottolineare è l’attenzione che il programma di questa unità porta alla biologia dei mitocondri. Oggi si è compreso che questi organelli sono dotati di una dinamicità strutturale e di una complessità di azioni insospettate in passato, e evidenze solide indicano che essi sono al centro di funzioni cellulari cruciali, al di là dei noti ruoli nella respirazione e nel metabolismo energetico, specialmente nella generazione di segnali intracellulari specifici. Questi aspetti sono affascinanti ed aprono prospettive nuove nella biologia cellulare.

Unità IV
1) Determinare la natura molecolare dei trasportatori coinvolti nel trasporto di NAADP e valutarne il potenziale fisiologico nella trasduzione del segnale.

2) Determinare se è presente a livello di organelli intracellulari un sistema di rilascio e ricaptazione per derivati di nucleotidi piridinici (NAADP e cADPR) e se questo eventuale trasporto possa partecipare alla trasduzione del segnale.


4) In ultimo, questa Unità prevede di generare almeno due costrutti molecolari (con due diverse affinità per il Ca2+) per valutare i livelli di calcio in organelli acidi, sotto la guida dell’Unità I. Nel caso in cui i dati preliminari suggerissero l’impossibilità di misurare il calcio nel lumen degli organelli acidi (ad esempio, per instabilità del probe) si direzioneranno questi probe al lato citosolico degli organelli, per valutare il contributo quantitativo di questi organelli nei segnali di calcio indotti da NAADP.

Unità V
1- Caracterizazione del meccanismo d’azione dell’ ABA nelle cellule infiammatorie. La comprensione del ruolo dell’ABA quale segnale paracrino tra cellule infiammatorie (granulociti e monociti) e tra monociti e cellule vascolari muscolari lisce prevediamo porterà allo sviluppo di una nuova famiglia di farmaci anti-infiammatori ABA-antagonisti per la terapia e prevenzione di stati infiammatori cronici (malattie degenerative e autoimmuni, rigetto di trapianto, aterosclerosi, insulino-resistenza).

2- Sviluppo di agonisti ed antagonisti del recettore per l’ ABA. Le capacità tecniche di questa U.O. nella sintesi chimica, purificazione e caratterizzazione strutturale di analoghi sintetici dell’ABA, insieme alla possibilità di sviluppare test di screening rapidi e sensibili (in collaborazione con le altre U.O.) sono garanzia di successo per lo sviluppo di antagonisti dell’ABA per uso farmacologico al termine di questo progetto.

3- Identificazione della via biosintetica dell’ABA nelle cellule di mammifero. L’identificazione anche di un singolo enzima inibibile nella biosintesi dell’ABA potrà portare allo sviluppo di una nuova classe di farmaci anti-infiammatori. In alternativa, la dimostrazione che inibitori enzimatici già in uso in terapia (ad es. statine, acido acetilsalicilico) interferiscono anche nella sintesi di ABA potrà contribuire alla comprensione del loro meccanismo d’azione.

4- Clonaggio del recettore per ABA e identificazione della via di segnalazione. L’identificazione del recettore dell’ABA consentirà il disegno di antagonisti sintetici dell’ABA attraverso computer modelling, grazie ad algoritmi recentemente sviluppati da Dompè Biotech per la predizione della conformazione di recettori accoppiati a G-proteine. L’identificazione dei secondi messaggeri dell’ABA prodotti da ADPRC consentirà di testare gli effetti di analoghi/antagonisti di cADPR e NAADP (già sviluppati da U.O di questo progetto e da laboratori in Europa e negli USA) nei diversi sistemi cellulari studiati. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Mentre nel corso dell’evoluzione la dimensione delle singole cellule non è cambiata significativamente in milioni di anni, quella degli organismi è aumentata di oltre 6 ordini di grandezza e i segnali che all’inizio dovevano essere scambiati su brevi distanze, negli organismi complessi si devono trasmettere a distanze di milioni di diametri cellulari. A questo scopo si sono evolute strutture specializzate come le fibre nervose e il sistema vascolare che distribuisce i nutrienti attraverso l’organismo e che è stato impiegato anche per il trasporto di messaggi specifici in forma di peptidi, ormoni, etc. Nella cellula recettrice i messaggi extracellulari arrivano su specifiche antenne, i recettori, per la gran parte situati sulla superficie esterna della membrana plasmatica, i quali a loro volta hanno la capacità di decodificare il segnale in un messaggio semplice che sarà trasmesso nella cellula e quindi modificherà l’attività di quest’ultima.
La complessità dei segnali extracellulari contrasta con la relativa semplicità dei principi di segnalazione intracellulare, mediati soprattutto o dalla generazione di alcune piccole molecole chiamate secondi messaggeri o dal controllo diretto di cascate enzimatiche (fosforilazione).
Le cellule inoltre scambiano secondi messaggeri attraverso strutture intercellulari specializzate, le così dette “gap junction”, ampi canali che connettono due cellule e sono permeabili a ioni e molecole sino ad alcune migliaia di Dalton (Sohl et al. 2005). Perciò le gap junction non solo sono essenziali nel collegare elettricamente cellule adiacenti, ma sono anche coinvolte nello scambio di secondi messaggeri tra cellule accoppiate (Sohl et al. 2005).
Uno dei problemi chiave nel campo dei secondi messaggeri è stato lo sviluppo di metodologie per monitorare direttamente e dinamicamente i loro livelli nelle cellule vive (Rudolf et al. 2004). I secondi messaggeri non solo sono presenti a concentrazioni molto basse nelle cellule, ma i loro livelli cambiano rapidamente e spesso in modo non omogeneo. Inoltre, ampi gradienti di questi messaggeri (in particolare Ca2+) esistono tra l’interno della cellula e il mezzo extracellulare e all’interno della cellula stessa (tra ER e il citoplasma, nella matrice mitocondriale, etc.) (Pozzan et al. 1994, Clapham 1995, Rizzuto and Pozzan 2004, Bootman et al. 2001, Rizzuto and Pozzan 2006).
Alterazioni nella segnalazione controllata dai secondi messaggeri sono molto comuni in patologia, ad esempio nel cancro, nelle malattie genetiche e nella morte cellulare programmata (Orrenius et al. 2003). Tra questi aspetti deve qui essere menzionato il fatto che molti dei farmaci comunemente usati sugli esseri umani (Ca2+ antagonisti, agonisti e antagonisti adrenergici, chemioterapici, per citarne alcuni), esercitano il loro effetto benefico modulando direttamente o indirettamente i livelli di secondi messaggeri.
Variazioni nella concentrazione dei secondi messaggeri possono essere ottenute attraverso varie vie (Pozzan et al. 1994, Rizzuto et al. 2004, Bootman et al. 2001, Pozzan and Rizzuto 2006). Per quanto riguarda il Ca2+, due vie principali sono impiegate per variare rapidamente il suo livello intracellulare: i) l’influsso di Ca2+ attraverso i canali della membrana plasmatica e ii) liberazione di Ca2+ dai depositi intracellulari. Quanto al primo meccanismo, decine di differenti isoforme di canali permeabili al Ca2+ sono espresse sulla membrana plasmatica di tutte le cellule. Lo specifico repertorio di canali Ca2+ della membrana plasmatica dipende dal tipo cellulare, dal livello di sviluppo e dal dominio subcellulare della membrana plasmatica (Catterall 2000, Liang et al. 2003).
Il meccanismo di rilascio del Ca2+ è altamente specializzato nei muscoli cardiaci e scheletrici (dipendende dai canali del Ca2+ chiamati recettori Rianodinici, RyR) mentre in altre cellule il principale meccanismo per la mobilizzazione del Ca2+ è innescato dall’attivazione della fosfolipasi C (PLC, differenti isoforme), che produce Inositolo 1,4,5 trifosfato (IP3) e diacilglirerolo. IP3 interagisce con i canali del Ca2+ localizzati nel RE e nell’apparato del Golgi, provocando la loro apertura e il rilascio del Ca2+ nel citosol. In molte cellule il recettore per l’ IP3 (IP3R) agisce sinergicamente ad altri canali intracellulari e secondi messaggeri, per esempio nicotidinamide adenindinucleotide (NAADP) che agisce su un bersaglio ancora sconosciuto (Galione 2002, Lee 2000, 2003) o ADP-ribosio ciclico (cADPr) che agisce su RyRs (Galione 2002, Lee 2000, 2003). Il rilascio del Ca2+ attraverso i recettori RyRs può essere direttamente innescato dallo stesso Ca2+ o l’ IP3 può essere prodotto via cAMP e PLCe (Schmidt et al. 2001). Il rilascio del Ca2+ dai depositi è spesso accompagnato dall’influsso di Ca2+ attraverso i canali della membrana plasmatica, il cui meccanismo di apertura è ancora discusso (Montell 2001, 2002). Il segnale del Ca2+ è terminato da attività combinate dei meccanismi di estrusione del Ca2+ (Ca2+ ATP-asi della membrana plasmatica e gli scambiatori Na+/Ca2+ e Na+/Ca2+-K+) o dalle Ca2+ ATP-asi del reticolo sarco-endoplasmatico (SERCA) e la pompa SPCA dell’apparato del Golgi che immagazzina i cationi nel lume dell’organello (Carafoli and Brini 2000, Guerini et al., 1998, Philipson and Nicoll 2000). Tutti questi meccanismi sono a loro volta regolati da altri secondi messaggeri, come NO, cAMP and cGMP.
Il segnale Ca2+ mediato da entrambi i recettori InsP3R e RyRs è estremamente versatile in termini di velocità, ampiezza e carartteristiche spazio-temporali (Cancela et al. 2002).
Indipendentemente dall’origine (mobilizzazione dai depositi intracellulari, l’influsso dal mezzo extracellulare, o entrambi) gli aumenti del Ca2+ citosolico portano all’attivazione di reazioni Ca2+ dipendenti. Fra questi, due classici esempi sono la contrazione dei miofilamenti e l’endo-esocitosi. Ultimo, ma non meno importante, il ruolo del controllo del Ca2+ mitocondriale è stato riconsiderato completamente negli ultimi anni ed ora è largamente accettato che questi organelli giocano un ruolo fondamentale nell’omeostasi del Ca2+ in molti tipi di cellule (Rizzuto et al. 1992, 1998, 2003, 2004, Bootman et al. 2001). Sorprendentemente, tuttavia a tutt’oggi praticamente non vi sono informazioni sul ruolo dei perossisomi nell’omeostasi del Ca2+ cellulare, nonostante il rinnovato interesse per questi orfanelli negli ultimi anni (Wanders et al. 2004).
Per molti anni, la complessità spazio-temporale della cascata di segnali del Ca2+ è stata ampiamene accettata; gli studiosi erano invece d’accordo sul fatto che altri secondi messaggeri, in particolare i nucleotidi ciclici, diffondessero rapidamente attraverso l’intera cellula e che il controllo della loro azione sia essenzialmente dovuto al loro livello citoplasmatico medio.
Questa situazione è ora cambiata grazie alla dimostrazione che gli effettori dei nucleotidi ciclici sono altamente e specificamente organizzati nelle cellule, ma anche al fatto che si è dimostrato sperimentalmente che la loro concentrazione citosolica è eterogenea (Zaccolo et al., 2002b). Esiste una complessa relazione tra il Ca2+, il cAMP e il cGMP; per esempio, molte isoforme di ciclasi e fosfodiesterasi che producono e degradano cAMP sono modulate dagli ioni Ca2+ (Mons et al. 1998, Fagan et al. 1998, Fergusone Storm 2004). Similmente, il cAMP può influenzare le attività delle pompe del Ca2+ e dei canali del Ca2+ e la via più classica, anche se non l’unica, di attivazione della guanilato ciclasi è tramite la produzione di ossido nitrico (NO) da parte della NO sintetasi Ca2+ dipendente. Alternativamente, l’omeostasi del Ca2+ è regolata da eventi di segnalazione cGMP dipendenti (Clementi e Meldolesi, 1997).
Oltre all’IP3, si pensa che altri messaggeri siano coinvolti nel rilascio di Ca2+ dai depositi intracellulari. Il significato di questa ridondanza probabilmente sta nel fatto che in questo modo le cellule possono codificare specifici segnali in termini di dimensioni spazio-temporali più specifiche.
Due dei messaggeri che sono stati proposti per agire accanto all’IP3, sono il cADPR e il NAADP, due nucleosidi piridinici derivati rispettivamente dal NAD e dal NADP. Il cADPR si pensa agisca, direttamente o indirettamente, sul recettore rianodinico, mentre il NAADP probabilmente agisce o su un canale non identificato o anche sul RyR. Indipendentemente dal loro target intracellulare, il cADPR e il NAADP sono in grado di rilasciare il Ca2+ in una grande varietà di tipi cellulari, dalle piante ai tessuti dei mammiferi. L' NAADP possiede molte caratteristiche uniche, se comparato al cADPR e all’IP3 quali la sua capacità di rilasciare il Ca2+ da due distinti pool (probabilmente dagli organelli acidi) e la sua insensibilità al fenomeno del Ca2+ indotto dal rilascio di Ca2+.
Il livello di entrambi i messaggeri si è visto aumentare in seguito all’applicazione di specifici stimoli extra-cellulari ed è stata dimostrata l’esistenza di specifici siti di legame. Sorprendentemente, la famiglia di enzimi responsabili della produzione di cADPR, conosciuti come ADP-ribosil ciclasi, (ADPRCs), sono gli unici enzimi riportati in grado di generare NAADP. Infatti, molti ADPRCs dei mammiferi (compreso l’ectoenzima CD38) sono enzimi multifunzionali i quali presentano sia attività di idrolisi del cADPR (quindi convertono cADPR nel metabolita ADPR, che permette l’apertura del canale TRPM2), sia la capacità di sintetizzare dimeri di ADPR e di tre diversi omodinucleotidi diadenosinici. Il sito catalitico di ADPRC è prevalentemente localizzato extracelluarmente, generando un paradosso topologico (l’apparente compartimentalizzazione dell’enzima confrontata al substrato e il recettore sul quale il prodotto può agire) che è stato fin’ora solo parzialmente chiarito (Galione 2002, Lee 2000, 2003).
Come accennato sopra, il Ca2+ non è solo coinvolto nelle vie di segnalazione che controllano processi fisiologici, ma può contribuire considerevolmente a eventi fisiopatologici, compresa la morte cellulare. Sta progressivamente emergendo il fatto che diversi stimoli apoptotici richiedono alterazioni nell’omeostasi del Ca2+ e molte proteine pro- e anti-apoptotiche (Bcl-2, Bax, Bak) possono esercitare le loro funzioni, almeno in parte alterando l’omeostasi del Ca2+ (Pinton et al. 2000, 2001, Duchen , 2000, Scorrano et al. 2003, Oakes et al. 2005, come review vedere Orrenius et al. 2003, Rizzuto et al. 2003). Il ruolo degli altri secondi messaggeri nei processi di morte cellulare programmata è molto meno chiaro. In particolare, nel panorama delle conoscenze è particolarmente interessante l’intercomunicazione tra Ca2+ e NO. Un meccanismo importante con cui NO esercita la sua funzione regolatoria è attraverso la modulazione dell’ apoptosi in modo inibitorio. Gli eventi di segnalazione intracellulari responsabili dell’effetto antiapoptotico di NO sono stati investigati con attenzione. Assieme alla ben nota prevenzione della transizione di permeabilità mitrocondriale, l’inibizione delle caspasi e la regolazione dei membri della famiglia di proteine Bcl-2 (Liu e Stamler, 1999), l’azione antiapoptotica di NO coinvolge anche l’inibizione della generazione del messaggero sfingolipidico ceramide. Questo è dovuto all’inibizione, ad opera di NO, dell’attività della A-SMasi (Clementi et al., 2003). Questo enzima svolge un ruolo importante nel mediare la morte indotta da agenti chemioterapici, inclusi la doxorubiicna, i retinoidi e le radiazioni (Herr et al., 1997; Herget et al., 2000; Sumitomo et al., 2002; Kolesnik and Fuks, 2003). A causa del ruolo cruciale della A-SMasi nel mediare la risposta ai farmaci anticancro, l’identificazione degli eventi molecolari coinvolti nella sua attivazione-inattivazione potrebbe non solo aiutare a comprendere le basi molecolari della morte cellulare, ma anche portare all’identificazione di nuovi potenziali bersagli terapeutici. L’attivazione della A-SMasi include il trasporto intracellulare da compartimenti intracellulari alla membrana plasmatica attraverso processi di eso- ed endo-citosi (Grassmè et al., 2001; Grassmè et al, 2002; Segui et al., 2001). Sia NO che Ca2+ regolano questi processi (Machado et al., 2000; Chieregatti e Meldolesi, 2005). La comprensione del rapporto e del meccanismo d’azione di NO e Ca2+ nell’ambito della segnalazione via sfingolipidi potrebbe perciò rivelare ruoli biologici precedentemente inattesi di questi messaggeri.
Si sad a molto tempo che I secondi messaggeri Ca+ e cAMP gocano un ruolo importante nelle cellule infiammatoriee farmaci che influenzano I livelli dei seondi messaggeri sono ampiamente usati in terapia. Solo recentemente è diventato però chiaro che anche il cADPR e l’NAADP svolgono un ruolo importante nell’infiammazione. In questo progetto l’Unità V si occuperà di studiare il mecanismo dei segnali attivati dall’acido abscissico, ABA. Questa molecola fu identificata inizialmente nelle piante superiori dove controlla importanti funzioni (Nambara et al. 2005). L’Unità V ha recentemente dimostrato che a concentrazioni tra 0.1 to 10 microM l’ABA stimola la chemotassi, la fagocitosi e la produzione di radicali dell’ossigeno nei granulociti umani (Bruzzone et al. 2007), attraverso una via di segnalazione coinvolgente una G proteina sensibile alla tossina della pertosse, l’adenilato ciclasi, la fosforilazione del CD38 da parte della PKA con aumento infine di cADPR, NAADP e Ca2+ (Bruzzone et al 2007). L’ABA è prodotto sia dai granulociti stessi che da altre cellule infiammatorie e questo agente ha effetti importanti sulle cellule muscolari vascolari (VSMC). L’ABA perciò appare coinvolto in molti processi fisiopatologici e di conseguenza l’identificazione del suo recettore, di antagonisti ed agonisti potrebbe avere importanti utilizzi terapeutici nel futuro. Infine, come prima menzionato, questi secondi messaggeri possono passare da una cellula all’altra e anche questo processo è strettamente regolato.Dati recenti da parte di uno dei gruppi partecipanti a questo progetto ha recentemente misurato quantitativamente la permeabilità attraverso le gap juctions formati dalla contessina 26 di cAMP e IP3 (Hernandez et al. 2007), mentre pochissimo s sa della permeabilità delle gap junctions a cGMP, cADPR e NAADP (si sa invece che il Ca2+ esercita su alcune gap junctions un ruolo inibitorio) (Sohl et al. 2005). Un nuovo scenario, comunque, è stato recentemente svelato dalla scoperta che la permeabilità delle diverse gap junction al secondo messaggero che porta alla liberazione di Ca2+, l’ IP3, può non solo essere diversa tra le varie isoforme di gap junction ma, più importante, che alcune malattie genetiche possono colpire in modo specifico tale permeabilità (Bruzzone e Cohen-Salmon, 2005; Beltramello et al. 2005). Uno studio che affronti la determinazione quantitativa di tutti i secondi messaggeri appare pertanto estremamente necessario ed attuale.
Questo progetto raggruppa assieme cinque gruppi che hanno già collaborato con efficienza negli anni scorsi e che si occupano di vari aspetti delle vie di segnalazione dipendenti da secondi messaggeri. <<<