RICERCA ITALIANA     

Ruolo dell'FGFR2 e di altri cofattori nell'etiopatogenesi di tumori epiteliali.

Università degli Studi di Roma "La Sapienza"

Abstract

Il presente progetto prende in esame alcuni dei potenziali fattori coinvolti nella patogenesi di patologie tumorali della cute e più in generale dei tessuti epiteliali. In particolare, sarà oggetto di approfondimento il ruolo svolto da un gruppo di proteine, normalmente coinvolte nel mantenimento dell’omeostasi tissutale e delle comunicazioni tra derma ed epidermide, la cui alterata regolazione può contribuire allo sviluppo di patologie proliferative. Da questo punto di vista un ruolo centrale viene assunto dal Keratinocyte Growth Factor Receptor (KGFR), noto anche come FGFR2-IIIb. KGFR appartiene alla famiglia di recettori dei Fibroblast Growth Factors (FGFRs) composta da quattro geni correlati (FGFR1-4). Il KGFR è un’isoforma dell’FGFR2, risultato dello splicing alternativo che include l’esone IIIb. Le cellule epiteliali esprimono esclusivamente l’isoforma KGFR mentre i fibroblasti esprimono esclusivamente il recettore FGFR2-IIIc. L’alterazione nella regolazione dell’espressione di questi trascritti alternativamente e finemente regolati potrebbe rappresentare un meccanismo attraverso cui si attua la perdita del controllo della regolazione della proliferazione cellulare. Recentemente è stato riportato che l’alterazione dell’espressione dell’isoforma FGFR2-IIIc provocherebbe una transizione epitelio-mesenchimale durante la progressione del carcinoma prostatico, determinandone la prognosi infausta. Tuttavia nessuno dei recenti studi menzionati, ha definitivamente chiarito il ruolo del FGFR2-IIIb.
Allo scopo di verificare il potenziale coinvolgimento di FGFR2 nella patogenesi di disordini proliferativi della cute, nel progetto saranno analizzati numerosi aspetti del recettore e dei fattori di crescita correlati al fine di comprendere meglio il suo ruolo nell’insorgenza e progressione di malattie caratterizzate da disordini proliferativi e tumori epiteliali. In particolare, intendiamo studiare i livelli di espressione delle due isoforme in malattie dermatologiche come il dermatofibroma, il Sarcoma di Kaposi classico (C-KS) e il carcinoma baso e spino-cellulare. Dati preliminari ottenuti da alcune Unità del presente progetto mostrano come in effetti ci sia una deregolazione nell’espressione delle due isoforme del FGFR-2 nei campioni bioptici ottenuti da soggetti affetti da queste patologie. Intendiamo qui validare ed approfondire queste indagini al fine di aggiungere un contributo alla patogenesi delle patologie oggetto dello studio. In particolare, il modello del C-KS ci fornirà lo spunto per indagare le complesse interazioni che si stabiliscono tra fattori di natura cellulare, virale ed immunitaria per lo sviluppo di patologie a carattere proliferativo. Saranno infatti analizzate le alterazioni che si stabiliscono in vitro a seguito dell’infezione da parte di HHV-8, prendendo in esame in particolare l’espressione di FGFR2 e dei ligandi ad esso correlati. Inoltre sarà oggetto d’indagine il ruolo del sistema immune cellula mediato per verificare se, anche nel modello C-KS, possa essere identificata una possibile alterazione nella risposta immune cellulo mediata. Saranno a tal fine analizzate le capacità di processare gli antigeni da parte delle cellule dendritiche nei pazienti affetti da C-KS, nonché l’attività delle sottopopolazioni linfocitarie.
Uno dei punti cardine del progetto sarà inoltre quello di analizzare le modificazioni a livello fenotipico delle cellule epiteliali attraverso la tecnica del silenziamento genico (siRNA) dell’FGFR2. In questo modo sarà valutata l’eventuale alterazione a carico delle proteine appartenenti al sistema di traduzione del segnale, attivate in seguito al legame dell’FGFR2 con i suoi ligandi specifici. A tale scopo, sarà investigata l’inibizione dell’espressione del KGFR (attraverso il silenziamento dell’isoforma FGFR2-IIIb) in linee di cellule epiteliali e dell’FGFR2 in cellule mesenchimali (attraverso il silenziamento dell’isoforma FGFR2-IIIc). Un ulteriore aspetto riguarda studi recenti che suggeriscono che il KGF possa essere in grado di causare la ridotta efficienza al trattamento con 5-fluorouracile (FU) nei soggetti affetti da patologie neoplastiche di origine epiteliale. Intendiamo verificare se l’inibizione dell’espressione di KGFR in linee cellulari derivate da tumori epiteliali (mammella, colon e prostata) sia in grado di ripristinare la capacità del FU di controllare la proliferazione cellulare. Questa parte dello studio è rivolta a dare un contribuito non soltanto alla comprensione del ruolo del KGFR e dei suoi ligandi specifici nella resistenza ai farmaci, ma anche nella formulazione di nuove strategie terapeutiche per il trattamento di tumori a larga diffusione come i carcinomi della mammella, colon e prostata. Infine allo scopo di testare e validare biomarcatori associati al cancro saranno analizzati campioni di tumori epiteliali inclusi in paraffina con una nuova metodica di microarray DASL (cDNA-mediated Annealing, Selection, extension and Ligation). <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Cinzia Marchese Università degli Studi di ROMA "La Sapienza"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Ancora largamente ignoti sono i meccanismi che sottendono allo sviluppo delle patologie di natura proliferativa della cute e più in generale di origine epiteliale. Diversi fattori cellulari, immunitari e infettivi sono verosimilmente coinvolti e l’acquisizione di maggiori conoscenze circa il ruolo svolto da ciascuno di questi elementi potrà portare utili contributi alla comprensione dei processi che sono alla base dello sviluppo di queste malattie. Il presente progetto prevede appunto di focalizzare le indagini su alcune di queste patologie a carattere proliferativo della cute, quali il sarcoma di Kaposi (KS), il dermatofibroma, i carcinomi spino- e baso-cellulari, nonché alcuni carcinomi ad alta incidenza, quali quelli a carico della mammella, del colon e della prostata. In particolare, l’attenzione sarà centrata sul ruolo del FGFR-2 e dei fattori di crescita ad esso correlati.
L’indagine si propone di raggiungere diversi obiettivi:
1. Determinare le alterazioni dell’espressione di FGFR-2 e il suo potenziale coinvolgimento nella patogenesi di diverse patologie proliferative.
L’analisi verrà effettuata mediante caratterizzazione su prelievi bioptici ottenuti da pazienti affetti dalle patologie oggetto d’indagine. L’espressione delle due isoforme del FGFR-2, la -IIIb espressa di norma su cellule epiteliali e la -IIIc espressa viceversa sulle cellule mesenchimali, sarà valutata sia a livello proteico mediante immunoistochimica che a livello di RNA mediante la determinazione quantitativa consentita dalla real-time PCR. I risultati ottenuti forniranno la necessaria base per poter meglio orientare le successive indagini.
2. Indagare le conseguenze dell’inattivazione di FGFR-2 su cellule sane e tumorali.
L’eventuale ruolo dell’alterata regolazione dell’espressione delle isoforme di FGFR-2 nelle patologie studiate, sarà anche approcciato mediante l’impiego della tecnica del silenziamento genico condotta su linee cellulari epiteliali di natura tumorale e successivamente su colture primarie di cheratinociti e fibroblasti. In questa indagine saranno prese in esame le modificazioni del fenotipo delle cellule testate, con particolare riguardo alle capacità di proliferazione, differenziamento, migrazione.
3. Studiare le conseguenze a livello molecolare del silenziamento del FGFR-2.
Saranno condotti studi per evidenziare mediante impiego della tecnica DASL le conseguenze a livello molecolare dello spegnimento della via di signaling cellulare mediata da FGFR-2 e degli specifici ligandi. Questo approccio ci consentirà di chiarire gli eventi che fanno seguito al legame di FGFR-2, in particolare l’isoforma -IIIb, con il KGF e FGF-10, i due più specifici ligandi. Allo stesso tempo, l’indagine potrebbe portare all’identificazione di partner proteici non ancora noti e pertanto contribuire ad una miglior comprensione degli eventi che fanno seguito all’attivazione del KGFR.
4. Verificare il coinvolgimento del KGF ed il KGFR nel fenomeno della farmaco-resistenza in soggetti affetti da patologie tumorali epiteliali.
Prendendo spunto dalle osservazioni di alcuni autori che hanno suggerito un ruolo del KGF nel determinare il fenomeno della resistenza all’azione del tamoxifene e del 5-Fluorouracile in soggetti affetti da patologie neoplastiche a carico della mammella e della prostata, intendiamo in questo progetto indagare l’effettiva implicazione dell’FGFR-2 nella farmaco resistenza riscontrata nei soggetti analizzati. Questo studio si avvarrà di due fasi: la prima, in vitro, sarà effettuata su linee cellulari derivate dai sopra menzionati tumori, nelle quali avremo ottenuto il silenziamento genico di FGFR-2, ci permetterà di apprezzare il contributo specifico del sistema di signaling KGF/KGFR al fenomeno della farmaco resistenza. La seconda fase, in vivo, prevede l’analisi delle variazioni di espressione di specifici geni correlati al signaling di KGF/KGFR che intervengono negli individui che sviluppano resistenza all’azione dei farmaci chemioterapici. I risultati ottenuti saranno correlati con quelli dell’indagine in vitro per poter meglio comprendere le alterazioni che si verificano nei soggetti affetti.
5. Determinare il ruolo di co-fattori cellulari ed immunitari in grado di contribuire con HHV-8 alla patogenesi del KS.
E’ ormai acquisito il ruolo svolto da HHV-8 come fattore necessario allo sviluppo del KS. Tuttavia altri eventi sono necessari e tra questi particolare riguardo sembra assumere le alterazioni della risposta immune cellula mediata. Intendiamo in questa sede proseguire le indagini precedentemente attivate volte a verificare come una ridotta capacità di risposta da parte del sistema immune possa contribuire allo sviluppo di questa patologia. Sarà oggetto d’indagine la capacità delle cellule dendritiche di soggetti affetti da KS classico nello stimolare la risposta T mediata. Parimenti saranno indagate la capacità delle diverse sottopopolazioni linfocitarie per analizzare ogni possibile carattere distintivo dei pazienti KS.
Altro aspetto che sarà preso in esame è quello delle alterazioni nell’espressione di proteine chiave per il controllo della crescita e differenziamento cellulare che si stabiliscono a seguito dell’infezione de novo da parte di HHV-8. Si procederà pertanto a effettuare esperimenti di infezione in vitro di colture di linee cellulari già note per essere suscettibili all’infezione da parte di HHV-8, quali ad esempio i cheratinociti e i fibroblasti. Sarà analizzata di seguito l’espressione di fattori di crescita e loro recettori, nonchè di citochine, avendo cura di studiare in modo particolare le proteine coinvolte nell’omeostasi tra derma ed epidermide. <<<

Risultati parziali attesi

Il presente progetto si prefigura di raggiungere diversi obiettivi che possono essere sintetizzati come di seguito descritto.

1. Mettere in evidenza in contributo del FGFR2 nell’eziopatogenesi di patologie cutanee a carattere proliferativo.
Per raggiungere questo obiettivo sarà importante effettuare uno screening di un campione statisticamente significativo di pazienti affetti dalle patologie cutanee oggetto della presente indagine. In questo senso, i dati preliminari ottenuti da alcune Unità circa l’espressione delle due isoforme del FGFR2 nel DF e nel KS forniranno un utile base di partenza per queste indagini.

2. Mettere a punto un sistema per ottenere il silenziamento dell’espressione di FGFR2.
Per ottenere questo risultato si partirà da dati preliminari promettenti che hanno consentito di ottenere la riduzione dell’espressione di entrambe le isoforme di FGFR2 in cheratinociti e fibroblasti. Intendiamo ora attivare un sistema che selettivamente possa spegnere l’espressione di una delle due isoforme, lasciando inalterata l’altra. In caso di successo, questo approccio ci consentirà, tra gli altri risultati, quello di poter pianificare una fase successiva di studi in vivo su modelli animali. In questo caso infatti, l’uso di appositi vettori ci potrebbe consentire di spegnere selettivamente l’espressione dell’una o l’altra delle due isoforme di FGFR2 e valutarne le conseguenze in vivo, soprattutto in rapporto ad eventuali modelli tumorali.

3. Capacità di caratterizzare in modo completo la via di trasmissione mediata dal legame tra FGFR2 e relativi ligandi.
In questo caso, l’approccio attraverso la metodica DASL potrebbe tornare utile per mettere in evidenza le modificazioni nell’espressione genica che conseguono all’attivazione della via di segnale di FGFR2. Questo studio, si avvarrà in modo decisivo della metodica precedentemente descritta del silenziamento di FGFR2. Infatti, attraverso la comparazione dell’espressione di mRNA da cellule silenziate e non, sarà possibile fare luce pressoché completa sugli eventi che conseguono il legame dei fattori di crescita della famiglia degli FGF che sono in grado di legarsi con FGFR2. Questa parte di studio, oltre a ben documentare ciò che accade in condizioni fisiologiche nelle cellule che ricevono corretti stimoli proliferativi, ci permetterà anche di evidenziare le conseguenze della deregolazione dell’espressione di FGFR2 come da noi documentata in alcune patologie a carattere tumorale.

4. Determinare il possibile contribuito di FGFR2 nella resistenza ai farmaci chemioterapici nei pazienti affetti da patologie tumorali della mammella, colon e prostata.
Vari studi precedenti hanno suggerito un ruolo del KGF nel contribuire alla resistenza all’azione citotossica del tamoxifene e del fluorouracile in pazienti affetti da patologie tumorali a carico dei sopra menzionati tumori. L’uso della metodica del silenziamento genico in linee cellulari derivate da questi processi neoplastici potrà consentirci di approcciare in modo definitivo il possibile coinvolgimento della via di trasmissione KGF/KGFR. Infatti l’inattivazione funzionale di tale via dovrebbe consentire il ripristino della normale efficienza della funzione di farmaci quali tamoxifene, fluorouracile, generalmente usati nel trattamento di suddetti tumori.

5. Ruolo di co-fattori cellulari e immunitari nell’eziopatogenesi del sarcoma di Kaposi.
Gli studi basati sull’infezione in vitro di linee cellulari suscettibili all’infezione da parte di HHV-8 potrebbero portare ad identificare le alterazioni a livello dell’espressione genica che intervengono dopo lo stabilirsi dell’infezione. Queste alterazioni e l’espressione di citochine, fattori di crescita e relativi recettori potrebbero costituire un utile elemento per meglio comprendere gli eventi di natura cellulare e locale che favoriscono lo sviluppo del KS.
Al contempo l’analisi delle alterazioni della risposta immune cellulo-mediata, già parzialmente documentate da alcuni dati preliminari da parte di due Unità di questo progetto, potrebbe condurre a meglio comprendere come anche il sistema immune possa giocare un ruolo nello sviluppo del sarcoma di Kaposi, variante classica.

6. Studi per determinare la trasmissione di HHV-8 attraverso la saliva.
Le modalità di trasmissione di questa infezione non sono completamente note. Intendiamo in questo progetto completare uno studio epidemiologico a livello molecolare volto a stabilire il rischio relativo di trasmissione attraverso la saliva. I dati di questo studio, non soltanto contribuiranno a fornire nuovi elementi circa la biologia di questa infezione virale relativamente frequente in Italia, ma permetteranno anche di definire i gruppi a rischio d’infezione, come per esempio sembrano essere i parenti di pazienti affetti da KS. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

I meccanismi che sono alla base delle patologie proliferative a carico dell’epitelio e della cute sono largamente ignoti. Fattori di diversa natura, cellulare, immunitaria ed infettiva sono certamente coinvolti. Tra i fattori di natura cellulare, un ruolo centrale viene svolto dal KGF. Il KGF è sintetizzato dalle cellule mesenchimali ma non da quelle epiteliali ed agisce specificamente sulle cellule target attraverso il legame con il suo recettore ad alta affinità, il KGFR, noto anche come FGFR2-IIIb, la cui espressione è ristretta alle sole cellule di origine epiteliale. Il KGFR è un’isoforma del FGFR2 appartenente alla famiglia dei recettori degli FGFs (FGFRs) che è rappresentata da quattro geni correlati (FGFR1-4) codificanti per altrettanti recettori ad alta affinità che condividono un dominio tirosino-chinasico intracellulare omogeneo ed un dominio extracellulare che include tre domini immunoglobulino-simili. Per l’isoforma FGFR2, il terzo dominio Ig è codificato da tre esoni: l’esone IIIa che codifica per l’estremità N-terminale, mentre gli altri due esoni mutuamente esclusivi, IIIb e IIIc, codificano per l’estremità C-terminale. Lo splicing alternativo di IIIb e IIIc produce differenti trascritti che vengono tradotti in differenti affinità dei recettori per i ligandi FGFs. Le due isoforme prodotte con questo meccanismo sono note come KGFR o FGFR-IIIb e FGFR2-IIIc. La loro espressione è strettamente correlata con il tipo cellulare in modo tale che le due isoforme non si trovano mai coespresse nella stessa cellula. Le cellule epiteliali esprimono esclusivamente l’isoforma KGFR/FGFR2-IIIb mentre i fibroblasti esprimono esclusivamente il recettore FGFR2-IIIc. L’alterazione nella regolazione dell’espressione di questi trascritti alternativamente e finemente regolati potrebbe rappresentare un meccanismo attraverso cui si attua la perdita del controllo della regolazione della proliferazione cellulare. In particolare è stato recentemente riportato che l’espressione dell’isoforma FGFR2-IIIc, durante la progressione del carcinoma prostatico, porterebbe alla distruzione del carattere epiteliale di questi tumori rivelando un’inaspettata transizione epitelio-mesenchimale. Uno studio precedente ha riportato l’associazione della down-regolazione delle isoforme FGFR2-IIIb e -IIIc a progressione maligna del tumore prostatico ed a prognosi infausta. Tuttavia nessuno dei recenti studi menzionati ha definitivamente chiarito il ruolo del FGFR2-IIIb. In particolare, il dominante-negativo del recettore è stato dimostrato essere in grado di competere con tutti i recettori che condividono gli stessi ligandi (FGF1, KGF, FGF10, FGF22) del FGFR2-IIIb, allo stesso modo il knockout del gene KGF ha dimostrato la capacità di compensare l’attivazione da parte di altri ligandi alternativi come l’FGF10.
Allo scopo di verificare il potenziale coinvolgimento di FGFR2 nella patogenesi di disordini proliferativi della cute, abbiamo recentemente investigato l’espressione di FGFR2 in campioni di dermatofibroma correlandone l’espressione con la relativa estensione occupata dagli strati epiteliali e dal derma. I nostri risultati mostrano un’aumentata espressione generale di entrambe le isoforme rispetto alla cute normale, pertanto suggerendo che FGFR2 possa contribuire allo sviluppo di questa patologia. Analogamente in uno studio preliminare condotto in collaborazione con il gruppo del Prof. Angeloni e della Prof.ssa Cottoni abbiamo evidenziato un’aumentata espressione dell’isoforma FGFR2-IIIc nel derma di pazienti affetti da sarcoma di Kaposi classico (C-KS).
Un ulteriore aspetto centrale del presente progetto trae spunto dall’osservazione che il KGF possa essere coinvolto nel processo della farmaco resistenza a chemioterapici.
Pazienti con patologie iperproliferative e tumori apparentemente identici per istotipo e grado di atipia non sempre rispondono ugualmente allo stesso trattamento, dimostrando così la limitata capacità dei fattori prognostici attualmente disponibili nel predire la risposta alla terapia convenzionale. Attualmente la chemioterapia antineoplastica viene scelta sulla base dell'istologia e di alcuni marcatori biologici, non considerando la complessa base genetica che influenza lo sviluppo del tumore e condiziona la sua risposta alla terapia. E’ stato evidenziato, inoltre, come gli FGF abbiano un ruolo, interagendo con gli estrogeni, nella proliferazione delle cellule tumorali mammarie, anche se la loro implicazione nella patogenesi del cancro al seno, inclusa la loro interazione con i recettori per gli estrogeni stessi, è molto complessa e ancora poco chiara. Recenti osservazioni in vitro suggeriscono che vi sia un effetto inibitorio da parte di alcuni fattori di crescita epiteliali, tra cui il KGF, sull’apoptosi di linee cellulari di carcinoma mammario indotta dai farmaci chemioterapici comunemente utilizzati (i.e. Tamoxifene). Inoltre è stata riscontrata anche una associazione diretta tra un attività di chemioresistenza verso farmaci, come il Paclitaxel e il 5-Fluorouracile, con attività antiproliferativa e proapoptotica e l’espressione di FGF-2 in altri tumori solidi a carico del rene, cervello, collo, colon, ovaie e prostata.
Uno dei modelli di patologie che intendiamo prendere in esame nel presente progetto è rappresentato dal KS, in cui è noto che HHV-8 costituisca un fattore essenziale ma non sufficiente per lo sviluppo del tumore.
HHV-8 é l'ultimo membro della famiglia dei virus erpetici ed é stato identificato in biopsie prelevate da soggetti affetti da KS. Ad oggi é stato possibile dimostrare un'associazione tra l'infezione da parte di HHV-8 e il KS in tutte le quattro varianti in cui questa malattia è classificata: forma classica, in soggetti in età avanzata ed é frequente nell'area Mediterranea; forma endemica, colpisce individui in età più giovane e si riscontra prevalentemente in Africa; forma epidemica, associata all'AIDS; infine una variante che si manifesta nei soggetti che abbiano subito un trapianto.
Sono ancora oggi aperte alcune problematiche legate a questo virus: tra le altre, resta ancora da fare piena luce sulle modalità della trasmissione dell’infezione. La via di trasmissione sessuale,indicata nei primi studi epidemiologici, certamente non costituisce l'unica via di contagio. Sono, ad esempio, da dimostrare le modalità con cui HHV-8 è trasmesso ai bambini essendo stata osservata un'alta prevalenza di infezione in neonati ed adolescenti residenti in alcune aree geografiche a più alta diffusione dell'infezione virale. D'altra parte, la trasmissione verticale del virus da madre sieropositiva a figlio sembra un evento poco frequente e non completamente accertato. Peraltro sono sempre più numerosi gli studi che dimostrano la presenza di virus in grado di infettare linee cellulari in coltura sia nella saliva che nel sangue di soggetti sani sieropositivi. E' inoltre ancora oggetto di dibattito la possibilità che la trasfusione di sangue da un soggetto sieropositivo costituisca un effettivo fattore di rischio. Resta da rilevare come oggi sia ben accreditata l'ipotesi che la saliva possa rappresentare un mezzo per la trasmissione dell'infezione virale anche se non è chiaro come tale virus possa infettare un ospite sieronegativo.
Inoltre lo studio di altri co-fattori coinvolti è importante per meglio comprendere la patogenesi di questa malattia. Da questo punto di vista, varie indagini hanno sinora suggerito che un complesso gioco di stimoli di natura virale, cellulare ed extracellulare sia necessario per lo sviluppo del KS. Inoltre il coinvolgimento del sistema immune, ampiamente dimostrato nell’AIDS-KS e in quello post-trapianto, appare un possibile elemento da valutare anche nei soggetti affetti da C-KS. Linfociti T specifici nei confronti di HHV-8 e di alcune sue proteine latenti e litiche sono stati evidenziati in soggetti sieropositivi per il virus e ciò conferma l’esistenza di una risposta immune cellulare specifica anche nei confronti di questo virus. Come detto, HHV-8 è associato a patologie che insorgono prevalentemente in corso di immunodeficienza ma che riguardano anche soggetti che apparentemente sembrano non presentare importanti deficit del sistema immunitario, come è il caso del C-KS. Recentemente abbiamo avviato uno studio in cui si è evidenziata una riduzione della risposta immune cellulo-mediata nei soggetti affetti da C-KS. I dati ottenuti richiedono ulteriore approfondimento per correlare la compromissione del sistema immune con la stadiazione clinica del KS dal momento che, pur in presenza del comune denominatore di una ridotta risposta T mediata, si è evidenziata una differenza importante nella capacità di risposta tra i diversi soggetti analizzati. <<<