RICERCA ITALIANA     

Neurobiologia della sindrome del cromosoma X fragile: meccanismi coinvolti nell'ipereccitabilita' neuronale

Università degli Studi di Roma "La Sapienza"

Abstract

La sindrome del cromosoma X fragile (FXS) è una malattia genetica che causa gravi deficit cognitivi. La causa di tale malattia è stata identificata in una mutazione inattivante il gene FMR1 sul cromosoma X. La mutazione abolisce la sintesi della proteina FMRP (fragile X-mental retardation protein), la quale regola il trasporto di vari RNA messaggeri in dendriti e assoni, nonché la loro traduzione proteica. In assenza di FMRP, la sintesi proteica legata agli RNA messaggeri bersaglio della proteina è incrementata o, in ogni caso, disregolata. Studi neuroanatomici hanno dimostrato la presenza di varie alterazioni strutturali, come l’incremento volumetrico dell’ippocampo e la riduzione del lobo temporale, oltre a quelle rilevabili nel cervelletto, caudato e talamo. La morfologia neuronale è pure alterata in questi pazienti, nei quali le spine dendritiche sono allungate e assottigliate. Utilizzando un modello murino di FXS, il topo FRM1-knockout (FMR1-KO), sono state riprodotte alcune delle caratteristiche cliniche principali, come le crisi convulsive. Alla base delle crisi epilettiche osservate potrebbero esservi le alterazioni recentemente dimostrate nei principali sistemi neurotrasmettitoriali, sia di tipo eccitatorio sia inibitori. Infatti, la subunità GluR1 dei recettori AMPA ed il recettore metabotropo di tipo 5 del glutammato sono aumentati nei topi FMR1-KO. Inoltre, è stata riscontrata un’alterazione dei livelli di mRNA per i canali voltaggio-dipendenti del calcio (VGCC) di tipo L nella corteccia frontale, dove i segnali di calcio a livello dei dendriti e delle spine sono pure modificati. Studi neurofisiologici hanno dimostrato una riduzione nelle correnti inibitorie, mediate dall’acido gamma-amminobutirrico (GABA), nei topi FMR1-KO, nei quali si osserva una riduzione delle subunità beta e delta del recettore GABA-A.
Il progetto qui proposto ambisce ad analizzare le complesse alterazioni nel bilancio fra sistemi eccitatori ed inibitori nei topi FMR1-KO, nonché il contributo di tali alterazioni all’ipereccitabilità delle reti neuronali corticali ed all’instaurarsi di una condizione epilettica. In particolare, ci proponiamo di identificare:

- le aree neuroanatomiche coinvolte nella genesi delle crisi epilettiche, studiando l’espressione delle proteine c-Fos e FosB in topi FMR1-KO epilettici (percentuale attesa: 50%), non epilettici e in topi di controllo wild type (WT);
- le possibili alterazioni nell’espressione funzionale dei VGCC e, dunque, nel flusso di ioni calcio in topi FMR1-KO in funzione della maturazione cerebrale, studiando: i) l’ampiezza delle correnti macroscopiche attraverso i VGCC; ii) il contributo dei differenti tipi di VGCC alla corrente totale; iii) le loro proprietà biofisiche. Infine studi di biologia molecolare ed immunocitochimica consentiranno di evidenziare eventuali modificazioni dei livelli di espressione dei diversi VGCC.
- le variazioni nelle correnti inibitori fasiche e toniche mediate dai recettori GABA-A, durante lo sviluppo cerebrale, nel subiculum dei topi FMR1-KO confrontati con controlli WT, utilizzando tecniche di patch-clamp in presenza di agonisti/antagonisti recettoriali specifici;
- il ruolo delle correnti inibitorie mediate dai recettori GABA-A nel controllare l’eccitabilità delle reti neuronali limbiche (in particolare quelle localizzate nel subiculum), mediante lo studio dei potenziali di campo ippocampali e paraippocampali. Inoltre, sarà analizzato l’impatto delle variate funzioni subicolari sull’attività sincrona epilettiforme nel topo FMR1-KO;
- alterazioni nell’espressione e sintesi delle subunità alfa5 e delta del recettore GABA-A, selettivamente negli animali epilettici e, in particolare, nelle aree in cui più si manifesta l’attività epilettica, utilizzando tecniche di studio degli RNA messaggeri con real-time RT-PCR e delle rispettive proteine con immunoblotting, nonché le variazioni nella localizzazione delle subunità alfa5 e delta nelle sedi sinaptica ed extrasinaptica del recettore GABA-A, accoppiando tecniche di immunoistochimica con particelle d’oro a studi ultrastrutturali.

Lo scopo di questo progetto è, quindi, quello di ottenere una serie di prove coerenti dell’esistenza di una relazione fra sbilanciamento nell’equilibrio fra sistemi eccitatori ed inibitori e la predisposizione a sviluppare crisi epilettiche in un modello di malattia umana in cui, sino ad ora, sono state ottenute solo evidenze indirette e frammentarie di questo rapporto. L’impatto dei possibili risultati di questo studio travalica i limiti della sindrome del cromosoma X fragile e si estende ad altre sindromi epilettiche, in cui il rapporto fra correnti inibitorie mediate dal recettore GABA-A e epilettogenesi è correntemente oggetto di studio e approfondimento. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Massimo Avoli Università degli Studi di ROMA "La Sapienza"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Lo scopo di questo progetto è quello di caratterizzare, in un modello murino (topo FMR1-KO), i meccanismi alla base del fenotipo neurologico della sindrome del cromosoma X fragile (FXS).
Obiettivo #1. Identificare le reti neuronali coinvolte nelle crisi epilettiche causate dalla stimolazione acustica nei topi FMR1-KO, utilizzando il sistema di rivelazione basato sull’espressione dei geni a risposta rapida (c-Fos e FosB).
I topi FMR1-KO presentano crisi convulsive audiogene in funzione del loro stato di maturazione cerebrale (Chen e Toth 2001, Musumeci et al 2007). Neuroni c-Fos-positivi sono stati notati (ma non quantificati) anche nella corteccia acustica e nell’ippocampo (Chen e Toth 2001). Un aspetto non chiarito è con quali reti neuronali si diffondano le crisi. È stata descritta l’attivazione di neuroni localizzati all’interno delle aree deputate a trasmettere l’informazione acustica (Chen e Toth 2001), ma questi circuiti non corrispondono a quelli generalmente coinvolti nella generalizzazione delle crisi epilettiche. Inoltre, altri studi condotti in vitro hanno dimostrato la presenza di foci epilettogeni in aree ippocampali (Chuang et al 2005) e paraippocampali (D’Antuono et al 2003). Ci poniamo perciò l’obiettivo di approfondire dati già pubblicati che suggeriscono una preminenza delle reti neuronali corticali nei FMR1-KO (D’Antuono et al 2003).
Obiettivo #2. Determinare le caratteristiche delle correnti inibitorie fasiche e toniche mediate dal recettore GABA-A nel subiculum di topi FMR1-KO e dei rispettivi controlli (wild type, WT).
Dati preliminari indicano che le correnti inibitorie postsinaptiche spontanee (sIPSC) presentano ampiezza ridotta e, forse, minor frequenza di comparsa nelle cellule piramidali subicolari del topo FMR1-KO. Inoltre, la componente tonica appare essere di minor ampiezza nei topi FMR1-KO, come dimostrato misurando la deviazione della corrente durante somministrazione di picrotossina. Intendiamo confermare questi dati preliminari eseguendo esperimenti con agonisti/antagonisti specifici per le subunità che compongono i recettori GABA-A.
Obiettivo #3. Identificare il ruolo della corrente inibitoria fasica e tonica nel controllare l’eccitabilità delle reti neuronali nei topi WT o FMR1-KO.
Utilizzando la registrazione di potenziali di campo in fettine di tessuto cerebrale prelevato da topi FMR1-KO e WT di un mese di età, abbiamo visto un effetto proconvulsivante della gabazina, a basso dosaggio, principalmente nelle fettine di topo WT; questi dati sono stati confermati utilizzando la picrotossina, suggerendo che i recettori GABA-A siano ipoespressi nei topi FMR1-KO. Utilizzando procedure di disconnessione delle varie aree anatomiche contenute nella fettina ippocampo-entorinale (Avoli et al 2004), verificheremo la risposta dell’ippocampo, subiculum e corteccia entorinale a dosi incrementali di gabazina e picrotossina, come pure all’antagonista della subunità alfa5 L-655,708 (50 microM, Scimeni et al 2005), in funzione della maturazione delle reti neuronali.
Obiettivo #4. Dimostrare che nei topi FMR1-KO sensibili all’induzione di crisi epilettiche sia selettivamente alterata l’espressione di alcune subunità del recettore GABA-A.
È stato dimostrato che le subunità beta (El Idrissi et al 2005) e delta del recettore GABA-A (Gantois et al 2006) sono ipoespresse nell’ippocampo e nella corteccia dei topi FMR1-KO. Questi dati sono stati confermati da D’Hulst et al. (2006). Tuttavia, non sono state effettuate analisi di correlazione fra le variazioni osservate nell’espressione delle subunità GABAergiche e la presenza o l’assenza di risposta alla stimolazione acustica; inoltre, gli studi di RT-PCR non sono stati effettuati utilizzando aree critiche per l’insorgenza dell’attività epilettica. Intendiamo dimostrare che le variazioni nella composizione dei recettori GABA-A avvengono selettivamente nelle aree epilettogene dei topi FMR1-KO.
Obiettivo #5. Caratterizzare la localizzazione dei fenomeni regolatori delle subunità componenti i recettori GABA-A in rapporto alla distribuzione sinaptica o extrasinaptica di tali recettori.
I recettori GABA-A localizzati in sede sinaptica evocano una risposta inibitoria di tipo fasico, mentre i recettori localizzati in sede perisinaptica o extrasinaptica hanno un effetto inibitorio di tipo tonico (Mohler 2006, Nusser e Mody 2002, Jia et al 2005). I nostri dati preliminari fanno supporre che le subunità alfa5 e delta siano ipoespresse nel subiculum dei topi FMR1-KO. Pensiamo che la riduzione dell’espressione della subunità delta potrebbe addizionarsi alla riduzione dell’alfa5 nel causare una diminuzione dei recettori GABA-A extrasinaptici e, verosimilmente, delle correnti inibitorie di tipo tonico per le quali sono deputate.
Obiettivo #6. Comprendere in che modo una funzionalità anomala delle reti subicolari possa indurre un’attività sincrona epilettiforme nel topo FMR1-KO.
I neuroni subicolari, in alcune fettine di topi FMR1-KO, generano un’attività ritmica di base che viene ad essere modulata dalla gabazina. Per approfondire le alterazioni nella composizione del recettore GABA-A, nonché le eventuali ripercussioni sulla sincronizzazione delle reti neuronali, useremo farmaci proconvulsivanti che non interferiscano con la trasmissione inibitoria come la 4-aminopiridina (4AP, Perreault e Avoli 1991). Questo modello dimostra che i neuroni subicolari di topo FMR1-KO hanno la capacità di generare scariche epilettiformi che: (i) persistono anche dopo il blocco dei recettori NMDA; (ii) sono abolite da antagonisti dei recettori del glutammato non NMDA; (iii) sono paradossalmente diminuite dalla gabazina a basso dosaggio o dal THIP, agonista del GABA-A (Liang et al 2004). Dovremo, quindi, caratterizzare la sensibilità di questi eventi a farmaci che interferiscano con le risposte fasiche e toniche mediate dai recettori GABA-A.
Obiettivo #7. Valutare se vi sia un'alterazione della funzione e/o espressione dei canali voltaggio-dipendenti del calcio (VGCC) ed in particolare dare risposta ai seguenti quesiti: 1) si riscontra una modificazione dell’ampiezza delle correnti macroscopiche del Ca2+? 2) il contributo dei diversi tipi di VGCC alla corrente totale risulta modificato? 3) vi sono alterazioni nelle proprietà biofisiche dei diversi VGCC? 4) si modifica l’espressione delle diverse subunità alfa1 dei VGCC?
Nella FXS si osservano alterazioni morfologiche e funzionali in aree corticali (Musumeci et al 1994, Castren et al 2003) dove è ampiamente documentata l’espressione di canali voltaggio-dipendenti del calcio (VGCC) che mediano l’ipereccitabilità e l’epilettogenesi (canali di tipo T, E/R-, P/Q, L) (Petzold et al 2005). L’espressione dei VGCC può essere regolata dal GABA stesso, come dimostrato in un modello di epilessia (Kim et al 2006). Proponiamo di studiare le possibili alterazioni dei segnali di calcio VGCC-mediati in rapporto alle variazioni delle correnti inibitorie GABA-mediate in topi FMR1-KO durante la maturazione dei circuiti neuronali. Infatti, ad oggi non esistono dati che forniscano una caratterizzazione elettrofisiologica dettagliata ed una analisi a livello molecolare relativa all’espressione funzionale dei VGCC nel modello animale di FXS. <<<

Risultati parziali attesi

Questo progetto potrebbe dimostrare che: (i) la trasmissione neuronale mediata dall’acido gamma-amminobutirrico (GABA) è alterata in stretto rapporto con la tendenza a sviluppare crisi epilettiche, nel modello murino di sindrome del cromosoma X fragile (FXS); (ii) la modificazione delle correnti inibitorie GABA-A-mediate è causata da un’alterata composizione in subunità recettoriali che, normalmente, sono espresse principalmente nei recettori GABA-A extrasinaptici; (iii) il deficit di neurotrasmissione GABAergica è localizzato nei circuiti cortico-ippocampali dei topi FMR1-KO e contribuisce alla diffusione dell’attività neuronale sincrona alle altre aree cerebrali; (iv) il deficit nella via GABAergica ha anche una componente presinaptica dovuta a variazioni delle correnti calciche mediatrici del rilascio di neurotrasmettitore. Questi esperimenti saranno effettuati in topi FMR1-KO e controlli wild type (WT) di diversa età: (i) gli animali giovani di 3-6 settimane di età forniranno risultati sullo stato dei parametri succitati in un periodo di maturazione delle reti neuronali antecedente la comparsa delle crisi epilettiche; (ii) gli animali adulti di 12-24 settimane di età forniranno risultati sulle reti neuronali che danno origine all’attività epilettica. Questi gruppi di topi FMR1-KO, confrontati con i controlli WT di pari età, produrranno risultati che ci permetteranno di identificare quali delle alterazioni presenti nei modello di FSX siano effettivamente correlate con la propensione all’attività epilettica.

1. Caratteristiche delle correnti inibitorie fasiche e toniche mediate dal recettore GABA-A nel subiculum di topi FMR1-KO e dei rispettivi controlli WT.

1.1. Dati preliminari ottenuti nel nostro laboratorio indicano che le correnti inibitorie postsinaptiche spontanee (sIPSC) presentano ampiezza ridotta e, forse, minor frequenza di comparsa nelle cellule piramidali subicolari del topo FMR1-KO (Fig.1). Utilizzando la tecnica del patch-clamp in configurazione whole-cell per studiare l’ampiezza e la frequenza dei potenziali postsinaptici inibitori spontanei (sIPSP) nei neuroni subicolari di topi FMR1-KO di 1 o 6 mesi di vita, in presenza di antagonisti dei recettori glutammatergici e dei recettori GABA-B, saranno ulteriormente definiti i nostri risultati preliminari (Fig.1). Lo studio delle costanti di salita e decadimento degli sIPSP dovrebbero confermare i dati preliminari che abbiamo ottenuto da animali di età di un mese, i quali ci indicano una sostanziale omologia con i valori dei controlli. La registrazione dei potenziali in miniatura (m)IPSC in presenza di TTX (1 microM) dimostrerà con certezza che le differenze osservate nei sIPSC sono dovute a variazioni intrinseche nella composizione del recettore. Le caratteristiche dell’alterazioni negli sIPSP (e mIPSP) saranno dimostrate, per quel che riguarda la componente fasica, con l’applicazione dell’agonista GABAergico PTX (50-100 microM), della gabazina a basso dosaggio (1 microM) e del diazepam a basso dosaggio (0,5 microM). Questi studi daranno luogo alla formulazione di grafici del tipo input/voltage.


1.2. Per quel che riguarda la componente tonica, abbiamo osservato una riduzione dell’ampiezza della corrente inibitoria nei topi FMR1-KO, misurando la deviazione della corrente durante somministrazione di PTX (Fig.2). Ci attendiamo di consolidare questo risultato con un maggior numero di animali, definendo la presenza di variazioni in funzione dell’età dei topi studiati. I valori della corrente saranno espressi come deviazione dalla corrente a valore costante prima e dopo applicazione di bloccanti selettivi come il PTX (50-100 microM) o gabazina ad alto dosaggio (100 microM). Altri risultati saranno ottenuti negli studi con il bloccante del trasportatore del GABA NO711 (5 microM) che aumenterà la corrente tonica nei neuroni subicolari dei topi FMR1-KO (Fig.3). Inoltre potremo stabilire se la componente tonica residua sia da attribuire alla subunità alfa5 oppure alla delta, grazie all’uso di THDOC (10-100 nM, agonista selettivo della subunità delta) e muscimolo (25 nM), oppure L-655,708 (50 microM, antagonista selettivo per la subunità alfa5).


2. Riduzione delle subunità alfa5 e delta dei recettori GABA-A localizzati in sede extrasinaptica.
Le alterazioni delle caratteristiche delle correnti inibitorie GABA-A-mediate osservate nei topi FMR1-KO dipendono, verosimilmente, da una differente composizione in subunità dei recettori GABA-A, soprattutto quelli extrasinaptici. Infatti, abbiamo ottenuto dati preliminari di real-time RT-PCR che suggeriscono, oltre alla riduzione della subunità delta, una marcata variazione anche della subunità alfa5 nel subiculum del topo FMR1-KO (Fig.4). Questi dati sono stati confermati dallo studio dei livelli dei rispettivi prodotti proteici (Fig.5). Il cambiamento della composizione del recettore GABA-A nel subiculum deve però essere correlato a dati sperimentali che dimostrino il coinvolgimento di questa struttura nel generare crisi epilettiche in vivo. Inoltre, è necessario ottenere la dimostrazione che soltanto nei topi FMR1-KO in cui si sia accertata la predisposizione alle crisi siano presenti le modificazioni delle subunità GABA-A che abbiamo ottenuto preliminarmente. Infine, occorre localizzare anatomicamente la sede delle alterazioni dei recettori GABA-A per poter correlare tali modificazioni con le variazioni nelle correnti fasiche e toniche GABA-A-mediate.

2.1. Saranno confrontati topi di età superiore alle 10 settimane suddivisi in controlli, topi FMR1-KO resistenti all’induzione delle crisi, e topi FMR1-KO sensibili al test di stimolazione acustica. La propensione a sviluppare crisi epilettiche sarà identificata utilizzando il test di induzione con stimolazione acustica. Gli esperimenti di immunoistochimica indicheranno in quali aree neuroanatomiche sarà indotta attivazione neuronale durante le crisi; prevediamo di osservare neuroni positivi agli anticorpi per c-Fos o FosB, oltre che nel subiculum, in aree ippocampali e paraippocampali o extraippocampali in cui abbiamo già osservato, in precedenti esperimenti, una significativa induzione del segnale. Altre aree in cui sarà possibile riconoscere la presenza di neuroni attivati potranno essere la corteccia acustica, i collicoli ed il talamo posteriore. In ciascuna di queste regioni sarà possibile ottenere una quantificazione delle densità neuronali per le cellule positive agli antigeni oggetto di studio.
2.2. Utilizzando tecniche di studio dell’espressione genica (real-time RT-PCR) e dei rispettivi prodotti proteici (western blot, immunoistochimica) verranno ampliati i dati preliminari (Fig.4, 5) ottenuti nel subiculum dei topi FMR1-KO dimostrando la presenza di una ipoespressione delle subunità alfa5 e delta del recettore GABA-A selettivamente negli animali sensibili al test di induzione delle crisi audiogene. Inoltre, verrà dimostrato che le variazioni delle subunità alfa5 e delta sono osservate nelle aree in cui avremo osservato le variazioni più consistenti nell’immunoreattività per gli antigeni Fos.
2.3. Grazie a studi ultrastrutturali, effettuati con tecniche di immunogold e osservazioni di microscopia elettronica, otterremo una descrizione dettagliata delle variazioni nell’espressione delle subunità alfa5 e delta, in relazione alla localizzazione sinaptica o extrasinaptica del recettore GABA-A.


3. Identificazione del ruolo della corrente inibitoria GABAergica (fasica e tonica) nel controllare l’eccitabilità delle reti neuronali nei topi WT o FMR1-KO.
3.1. Utilizzando la registrazione di potenziali di campo in fettine di tessuto cerebrale prelevato da topi FMR1-KO e WT di un mese di età, abbiamo dimostrato un effetto proconvulsivante della gabazina (che dovrebbe bloccare solo la corrente inibitoria fasica), applicata a basso dosaggio, principalmente nelle fettine di topo WT; questi dati sono stati confermati utilizzando PTX, il quale abolisce sia la componente fasica sia quella tonica (Fig.6). Replicando tali esperimenti in topi WT e FMR1-KO di 6 mesi di vita, potremo evidenziare la presenza di tali alterazioni (o le loro modificazioni) in animali propensi a sviluppare crisi epilettiche; inoltre, replicheremo questi esperimenti utilizzando procedure di disconnessione delle varie aree anatomiche contenute nella fettina ippocampo-entorinale per verificare la risposta dell’ippocampo, subiculum e corteccia entorinale a dosi incrementali di gabazina e PTX, come pure all’antagonista della subunità alfa5 L-655,708 (50 microM).


3.2. Un altro gruppo si esperimenti ci consentirà di identificare le alterazioni della trasmissione GABAergica che compariranno in seguito a trattamento con un farmaco proconvulsivante che non interferisce con la trasmissione inibitoria, la 4-aminopiridina (4AP). Infatti, in seguito a stimolazione con 4AP (Fig.7), la registrazione di potenziali di campo ha dimostrato che i neuroni subicolari di topo FMR1-KO hanno la capacità di generare scariche epilettiformi che: (i) persistono anche dopo il blocco dei recettori NMDA; (ii) sono abolite da antagonisti dei recettori del glutammato non NMDA; (iii) sono paradossalmente diminuite dalla gabazina a basso dosaggio o dal THIP, agonista del GABA-A. Il completamento di questi esperimenti ci consentirà di dimostrare che le reti neuronali del subiculum nei topi FMR1-KO sono ipereccitabili anche in assenza di trasmissione NMDA-mediata. Inoltre, si potrà desumere che i meccanismi di sincronizzazione neuronale sono dipendenti dall’interazione fra correnti inibitorie fasiche GABA-A-mediate e recettori glutammatergici non-NMDA, a condizione di ridotta inibizione tonica. Questi risultati saranno ottenuti confrontando topi FMR1-KO e WT di 1 e 6 mesi di età, caratterizzando le proprietà elettrofisiologiche degli eventi descritti mediante registrazioni intracellulari. Dovremo, inoltre, caratterizzare la sensibilità di questi eventi a farmaci che interferiscano con le risposte fasiche e toniche mediate dai recettori GABA-A.

4. Identificazione delle modalità con cui il funzionamento anomalo delle reti subicolari induce attività sincrona epilettiforme nel topo FMR1-KO.
Questi esperimenti chiariranno le caratteristiche elettrografiche delle crisi epilettiche nel topo FMR1-KO. Secondo dati preliminari ottenuti studiando il subiculum di fettine di topi FMR1-KO giovani, le reti subicolari generano un’attività ritmica di base che viene ad essere modulata dalla gabazina (Fig.8). Questi risultati devono essere approfonditi per identificare in modo preciso la frequenza di tali eventi a 1 e 6 mesi dalla nascita, le loro caratteristiche farmacologiche, la loro modalità di diffusione alle altre regioni limbiche. In tal modo, otterremo registrazioni di potenziali di campo e registrazioni intracellulari delle oscillazioni del potenziale di membrana nei neuroni subicolari. Inizialmente, effettueremo registrazioni di potenziali di campo simultaneamente dall’ippocampo, subiculum e corteccia entorinale in fettine ippocampo-entorinali tenute in un mezzo di controllo (liquido cerebrospinale artificiale), per identificare la presenza di eventi sincroni in topi FMR1-KO e WT di 1 e 6 mesi di età. Ci attendiamo di osservare la comparsa di attività oscillatorie nel subiculum, in accordo ai dati preliminari che abbiamo descritto, e la successiva evoluzione di tali attività in scariche epilettiforme prolungate, simili ai tracciati elettroencefalografici osservati durante le crisi epilettiche nella corteccia entorinale, una struttura della quale è nota l’epilettogenicità. Successivamente, identificheremo il sito di insorgenza di queste oscillazioni dei potenziali di campo (e di ogni altra possibile attività epilettiforme), analizzeremo il tempo di insorgenza di tale attività nelle varie area anatomiche registrate ed eseguiremo disconnessioni mirate ad isolare tali aree. In questi esperimenti, utilizzeremo anche antagonisti dei recettori NMDA e non-NMDA del glutammato e farmaci che interferiscono con le correnti GABA-A fasiche e toniche. Infine, utilizzando microelettrodi intracellulari, otterremo registrazioni da neuroni subicolari e della corteccia entorinale per identificare i correlati degli eventi epilettiformi dei potenziali di campo a livello di potenziali di membrana, nonché i potenziali di inversione, grazie all’impiego di microelettrodi caricati con QX-314 e QX-222.

5. Caratterizzazione dell’espressione funzionale dei canali voltaggio-dipendenti del calcio (VGCC) nei topi FMR1-KO di 1 e 6 mesi di età. Questi esperimenti potranno descrivere: le modificazioni dell’ampiezza delle correnti macroscopiche del Ca2+; le modificazioni del contributo dei diversi tipi di VGCC alla corrente totale; le alterazioni nelle proprietà biofisiche dei diversi VGCC; i cambiamenti nell’espressione delle diverse subunità alfa 1 dei VGCC.

5.1. Le modificazioni dei flussi del Ca2+ saranno descritte dall’analisi dei transienti indotti dalla depolarizzazione di neuroni corticali caricati con la sonda fluorescente Fluo 4-AM. Saranno registrate le correnti macroscopiche del Ca2+ e la densità di corrente (pA/pF) sarà calcolata dividendo la ampiezza della corrente al picco per la capacità della membrana cellulare. Se il flusso di ioni Ca2+attraverso i VGCC risultasse modificato nei topi FMR1-KO rispetto ai topi di controllo, sia l’ampiezza dei transienti che le densità di corrente saranno differenti nei due gruppi di animali, accoppiati per età. Esperimenti preliminari condotti recentemente presso i nostri laboratori, hanno evidenziato che la densità di corrente è aumentata (~ 30%) nei topi FMR1-KO, supportando la nostra ipotesi che l’influsso di calcio attraverso i VGCC sia alterato nei topi FMR1-KO.

5.2. Il contributo relativo dei differenti tipi di VGCC alla corrente totale sarà descritto dai risultati ottenuti con l’utilizzo della tecnica del patch-clamp in configurazione whole-cell ed in presenza di bloccanti selettivi dei VGCC: nifedipina (5 microM, bloccante dei canali di tipo L), omega-conotossina GVIA (3,2 microM, bloccante dei canali di tipo N), omega-agatossina IVA (50-200 nM, bloccante dei canali di tipo P), e omega-conotossina MVIIC (1-3 microM, che blocca i canali P/Q-type ed N) SNX-482 (100 nM, bloccante dei canali di tipo R). L’eventuale modificazione dell’espressione dei differenti VGCC sarà quantificata esprimendo il contributo della corrente attraverso ciascun tipo di canale (isolato farmacologicamente) come percentuale della corrente totale (100%). Sarà inoltre misurata la densità di corrente relativa ai differenti tipi di VGCC così come le relative cinetiche di attivazione/inattivazione e la loro voltaggio dipendenza.

5.3. Le proprietà biofisiche dei differenti tipi di VGCC saranno descritte dalle registrazioni di singolo canale mediante la tecnica del patch-clamp in configurazione cell-attached. Saranno utilizzati diversi protocolli di stimolazione ed agenti farmacologici selettivi allo scopo di isolare le correnti relative a ciascun tipo di VGCC. Da questa serie di registrazioni saranno estrapolati i seguenti parametri biofisici: la probabilità di apertura, i tempi medi di apertura o di chiusura e la conduttanza.

5.4. Studi di real-time RT-PCR ed immunocitochimica integreranno gli studi funzionali sopra descritti fornendo informazioni circa l’eventuale differente espressione dei diversi VGCC a livello di mRNA e proteina nel modello animale di FXS.

In conclusione il progetto sopra descritto ha la potenzialità di aprire nuovi orizzonti nella comprensione dei meccanismi alla base della ipereccitabilità neuronale e della patologia epilettica nei pazienti affetti da sindrome del cromosoma X fragile. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La sindrome del cromosoma X fragile (FXS) è la seconda causa di ritardo mentale dopo la sindrome di Down. È una malattia genetica (1/4000 affetti di sesso maschile, 1/6000 di sesso femminile) causata dalla mutazione del gene FMR1 sul cromosoma X, nella banda cromosomica Xq27.3 (Oostra e Chiurazzi 2001). Normalmente il gene FMR1 contiene da 6 a 53 ripetizioni del codone CGG. Negli individui affetti da FXS, l'allele FMR1 ha più di 230 ripetizioni del codone CGG. A causa di tale grado di espansione, si verifica la metilazione delle citosine nel promotore del gene FMR1, con conseguente inattivazione dell'espressione del gene FMR1. La metilazione del locus FMR1 provoca, in quel punto, una costrizione con conseguente fragilità del cromosoma X, fenomeno che dà il nome alla sindrome. La mutazione e metilazione del gene FMR1 comporta l'abolizione della sintesi della FMRP (fragile X-mental retardation protein), una proteina legante gli RNA (RNA-binding protein) espressa soprattutto nelle gonadi e nel cervello, i tessuti più colpiti dalla sindrome. Si trova espressa in modo particolarmente elevato nei neuroni, dove funziona da regolatore negativo della traduzione, probabilmente fluttuando fra stati di attività e inattività in funzione del grado di fosforilazione (Antar e Bassell 2003). La proteina FMRP interagisce con più RNA messaggeri e altre proteine al contempo, spostandosi tra il nucleo e il citoplasma cellulare (Miyashiro et al 2003), regolando aspetti essenziali dei processi trascrizionali, il trasporto di RNA lungo i dendriti e gli assoni verso le sinapsi, nonché la loro traduzione in prodotto proteico. In assenza di FMRP, molti degli RNA messaggeri bersaglio di questa proteina sono disregolati, fenomeno al quale può conseguire una maggior sintesi di proteine specifiche.

A parte il deficit cognitivo, di grado variabile da severo a moderato, altre evidenti caratteristiche della sindrome sono la presenza di deficit dell’attenzione e iperattività, ansia ed instabilità dell’umore, disturbi ossessivi-compulsivi, comportamento autistico dismorfismo facciale (faccia allungata e stretta, con orecchie grandi e protrudenti), macrorchidismo, ipotonia muscolare e lassità articolare, scarsa coordinazione motoria ed aumentata incidenza di crisi epilettiche. Studi di neuroimaging hanno dimostrato la presenza di alterazioni neuroanatomiche caratterizzate da ipotrofia del verme cerebellare, incremento volumetrico progressivo dell’ippocampo, riduzione volumetrica del lobo temporale ed ampliamento del caudato e del talamo (Kates et al 2002). Inoltre, anche la morfologia neuronale è alterata in questi pazienti, nei quali le spine dendritiche appaiono allungate e scarsamente differenziate (Irwin et al 2001). Utilizzando un modello murino di FXS, il topo FRM1-knockout (FMR1-KO), sono state riprodotte alcune delle caratteristiche cliniche principali, tra le quali le crisi convulsive. Come nel caso della patologia umana, i topi FMR1-KO sono affetti da macrorchidismo e aumentata attività locomotoria; inoltre, i topi FMR1-KO presentano ridotta estinzione nel test dell’open field ed aumentata suscettibilità alle crisi epilettiche (Bakker e Oostra 2003). Nei topi FMR1-KO si osservano anche le stesse anomalie strutturali presenti nei pazienti, ovvero l’allungamento ed assottigliamento delle spine dendritiche e la loro mancata maturazione (Galvez et al 2005). Alle alterazioni strutturali corrispondono anomalie nella trasmissione neuronale, solo in parte identificate, nonché deficit di apprendimento (Kooy 2003).

È noto che l’eziologia e la patogenesi di diverse forme di epilessia si associano ad alterazione di proteine-canale tra cui i recettori dell’acido gamma-amminobutirrico (GABA) di tipo A (GABA-A), ma altrettanto documentato è il ruolo dei canali del calcio voltaggio-dipendenti (VGCC) (Khosravani e Zamponi 2006). I VGCC di tipo T modulano l’attivazione dei neuroni talamici e la comparsa di oscillazioni nei circuiti talamici si associa all’insorgenza della forma generalizzata di epilessia (Labate et al 2005). Un recente studio dimostra che in modelli animali, così come nel bambino affetto da epilessia-assenza, si osserva un aumento sia della corrente di calcio attraverso il canale di tipo T sia dell’espressione di RNA messaggero della subunità Cav3.2 (Vitko et al. 2007). Inoltre una serie di studi attribuisce ai canali VGCC di tipo E/R (Cav2.3) e P/Q-type (Cav2.1) un ruolo cruciale nella patogenesi di diverse forme di epilessia. In particolare è stato dimostrato che nei neuroni piramidali della regione CA1 dell’ippocampo le correnti del Ca2+ attraverso i canali E/R sono coinvolte nell’insorgenza delle oscillazioni indotte da carbacolo che mimano l’attività epilettica (Williams e Kauer, 1997). Nei topi FMR1-KO è stata osservata una riduzione dei livelli di RNA messaggero per il canale del Ca2+ di tipo L (Chen et al 2003) ed uno studio più recente riporta che, nel medesimo modello sperimentale, nella corteccia prefrontale vi è una alterazione dei segnali di Ca2+ a livello di dendriti e spine (Meredith et al 2007). Sebbene quest’ultimo studio rappresenti la prima dimostrazione di una correlazione tra alterazione funzionale dei VGCC e patologia FXS, tuttavia ad oggi non esistono dati che forniscano una caratterizzazione elettrofisiologica dettagliata ed una analisi a livello molecolare relativa all’espressione funzionale dei VGCC nel modello animale di FXS. Inoltre, un’alterata funzione dei VGCC potrebbe influenzare l’attività di altri sistemi neurotrasmettitoriali, tra questi quello GABAergico che è modulato da specifici VGCC (Bhaukaurally et al 2006, Zaitsev et al 2007).

Nei topi FMR1-KO è stata dimostrata la presenza di alterazioni in alcuni sistemi neurotrasmettitoriali, sia di tipo eccitatorio sia inibitori, che possono modificare in modo significativo l’attività delle reti neuronali corticali. In particolare, si visto che è aumentata l’espressione della subunità GluR1 dei recettori AMPA del glutammato (Muddashetty et al 2007); così pure il recettore metabotropo del glutammato di tipo 5 (mGluR5) è prodotto in maggior quantità (Yan et al 2005). I recettori metabotropi della prima classe appaiono essere, in generale, iperattivi determinando un incremento della depressione sinaptica a lungo termine (Huber et al 2002). Inoltre, la stimolazione dei recettori metabotropi della prima classe determina la comparsa di attività epilettiforme in fettine del cervello di topo FRM1-KO (Chang et al 2005). È possibile che altre linee neurotrasmettitoriali siano alterate nel modello murino e nei pazienti affetti da FXS. In particolare, abbiamo recentemente pubblicato una modificazione nella risposta alla stimolazione colinergica nel subiculum del topo FMR1-KO (D’Antuono et al 2003), tale da riflettere un deficit nella neurotrasmissione inibitoria mediata dal GABA. Il subiculum è una struttura coinvolta nei processi di apprendimento ed è in grado di influenzare l’attività di aree limbiche ed extralimbiche, le stesse regioni in cui si possono propagare le crisi parossistiche che si osservano nell’epilessia mesiotemporale.

Le alterazioni osservate a carico della neurotrasmissione inibitoria mediata dal GABA dipendono verosimilmente da una variazione nella composizione del recettore GABA-A (D’Hulst e Kopy, 2007). I GABA-A sono i recettori ionotropi del GABA, presentano elevato permeabilità al cloro e, in minor misura, al bicarbonato. Avendo un potenziale di inversione negativo rispetto al potenziale di membrana a riposo, il GABA determina un potenziale postsinaptico inibitorio fasico che iperpolarizza il neurone postsinaptico, sopprimendo l’insorgenza del potenziale d’azione (Olsen e Avoli 1997). Questo effetto inibitorio è favorito da un notevole incremento nella conduttanza di membrana, a sua volta responsabile del cosiddetto effetto “shunt” del potenziale postsinaptico inibitorio; quindi, l’inibizione, ossia la ridotta probabilità del neurone di innescare un potenziale d’azione, può essere ottenuta senza determinare una pronunciata iperpolarizzazione. Oltre a questo tipo di inibizione, definita fasica, il recettore GABA può mediare un’inibizione di tipo tonico che è strettamente dipendente dai recettori extrasinaptici (Semyanov et al 2004). Inoltre, in condizioni particolari il GABA può comportarsi da neurotrasmettitore eccitatorio: se il potenziale di inversione per il cloro diviene positivo a valori di potenziale di membrana a riposo (generalmente a causa dell’inversione dei flussi di cloro e bicarbonato), il recettore GABA-A può depolarizzare il neurone. Questo fenomeno paradosso è piuttosto caratteristico del tessuto nervoso immaturo (Ben-Ari 2002), ma si può presentare anche successivamente alla maturazione in condizioni particolari: ad esempio, in corso di sincronizzazione epilettiforme sia nel roditore (Avoli et al 2002, Wong et al 2005) sia nel tessuto di pazienti epilettici (Cohen et al 2002).

Il recettore GABA-A è composto dall’assemblaggio di subunità appartenenti ad una famiglia di almeno 19 membri così denominati: alfa (6 isoforme classificate da 1 a 6), beta (isoforme 1-4), gamma (isoforme 1-3), delta, ipsilon, pi greco, rho (isoforme 1-3). Le varie subunità si assemblano dando origine a recettori che presentano un diverso profilo di attivazione farmacologica, i quali generano correnti inibitorie o di tipo fasico o di tipo tonico in funzione delle localizzazione, rispettivamente, sinaptica o extrasinaptica (Mohler 2006). I recettori GABA-A extrasinaptici, mediatori delle correnti di tipo tonico, sono contraddistinti da subunità alfa5 oppure, alternativamente, da subunità delta (Stell et al 2003, Carascois et al 2004, Mohler 2006). In modelli animali di epilessia del lobo temporale, è stato dimostrato che si ha una variazione nella composizione in subunità, distribuzione e funzione del recettore GABA-A con cambiamenti significativi nella risposta farmacologica in aree cerebrali in cui si osserva attività epilettica (Peng et al 2004, Nishimura et al 2005, Zhang et al 2007). Dati elettrofisiologici hanno inoltre suggerito una riduzione nelle correnti inibitorie mediate dal recettore GABA-A nei topi FMR1-KO (D’Antuono et al 2003). Si è poi visto che varie subunità del recettore GABA-A, inclusa la delta, sono ipoespresse nel modello murino di FXS (El Idrissi et al 2005, Gantois et al 2006, D’Hulst et al 2006). Inoltre, è stata anche osservata una riduzione degli interneuroni positivi alla parvalbumina nella corteccia dei topi FMR1-KO, prefigurando una ridotta attività dei sistemi inibitori (Selby et al 2007). Questi dati, nel complesso, suggeriscono che nel topo FMR1-KO siano presenti deficit multipli nei sistemi neuronali di controllo, tali da sbilanciare l’attività di rete nella direzione di una ipereccitabilità agli stimoli. Tuttavia deve essere chiarito quali aree neuroanatomiche e quali sistemi siano più di altri coinvolti nel generare l’ipereccitabilità neuronale presente in questa malattia genetica. <<<