RICERCA ITALIANA     

Ereditarietà, cancerogenesi e progressione tumorale del carcinoma gastrico

Università degli Studi di Siena

Abstract

Il carcinoma gastrico (CG) rappresenta una delle cause principale di morte per neoplasia nel mondo, nonostante nelle decadi recenti si abbia registrato un declino di incidenza e di mortalità. La regione Toscana, in particolar modo l’area senese, è considerata una zona ad alto rischio con un’incidenza di 100 nuovi casi/anno per 100,000 abitanti. Al momento della diagnosi, la maggior parte dei pazienti affetti da CG presentano uno stadio avanzato della malattia neoplastica con un elevato rischio di recidiva tumorale dopo trattamento chirurgico radicale. Molteplici approcci terapeutici sono stati proposti per migliorare la prognosi, ma la maggior parte di essi non presentano una efficacia reale sulla sopravvivenza a distanza. La bassa curabilità e l’elevata richiesta di indagini e terapie del paziente affetto da CG causa un impatto notevole sulle risorse di cura della malattia neoplastica stessa. L’obiettivo generale di questo progetto è l’identificazione di nuovi marcatori bio-molecolari nella prognosi precoce e nell’evoluzione clinica dei pazienti affetti da CG.
Molteplici fattori genetici sono responsabili dell’insorgenza del CG, come la caderina-E e l’instabilita dei microsatelliti (MSI) nel CG familiare. Tuttavia, fattori ambientali esercitano un ruolo importante sulla progressione tumorale; i polimorfismi genetici e l’infezione sostenuta da Helicobacter pylori sono possibili fattori predittivi nello sviluppo del CG. D'altra parte, i microRNA e gli acidi nucleici circolanti rappresentano il modello ideale nella prognosi del CG.
Questo gruppo di ricerca multicentrico ha raccolto circa 900 campioni di cancro gastrico (CG). I campioni di CG e le informazioni cliniche complete sono state archiviate in un databse unificato (Università di Siena, Padova, Roma e Verona). Tutti i casi dei pazienti affetti da CG sono stati sottoposti ad intervento chirurgico radicale standardizzato secondo classificazione e stadiazione Giapponese.
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Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Franco Roviello Università degli Studi di SIENA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il presente progetto si propone di raggiungere i seguenti obiettivi multidisciplinari:
1. Caratterizzazione completa della cascata EGFR nel CG e correlazione con il gene caderina-E;
a) Chiarire il significato prognostico e l’espressione della cascata EGFR in circa 500 casi di pazienti affetti da CG.
b) Effettuare uno screening genetico su EGFR sulla linea somatica e amplificazione del gene.
c) Determinare la correlazione tra deregolazione della caderina-E con l’attività di EGFR.
d) Correlare i dati molecolari con i dati clinico-patologici usando un adeguato modello statistico.
2. Analisi genotipica di polimorfismi genetici in 50 pazienti con cancro dello stomaco e del cardias e correlazione con il trattamento chemio- radio-terapico neoadiuvante;
a) Per la via metabolica del 5-fluorauracile si esamineranno MTHFR C677T e A1298C, TYMS 5’UTR VNTR e G-C), TYMS 3’UTR (6bp ins/del), UMPS G638C e MTR A2756G.
b) Per la via metabolica del Cisplatino si analizzeranno MDR1 G2677T e C3435T, GSTP1 Ile105Val (A1578G) e Ala114Val (C2293T) , MPO T764C.
c) Per la via metabolica del Docetaxel si analizzeranno il già citato MDR1 C1236T e C3435T, MPR1 G2168A, CYP3A4 A(-290)G.
d) Per le vie di riparo del danno al DNA si analizzeranno XRCC1 Arg399Gln (G28152A), XPD Lys751Gln (A35931C), ERCC1 C118T, XRCC3 Thr241Met (C18067T), XPC PATins/del (insertione 83 pb).
3.Infezione da Helicobacter Pylori e rischio in 180 pazienti con CG;
a) Individuare marker proteici sierologici dell’infezione da H pylori in grado di caratterizzare i pazienti con fenotipo di gastrite a rischio per le neoplasie gastriche, quale la gastrite atrofica del corpo-fondo.
b) Valutare l’utilità dello staging e del grading della gastrite quale fattore di predizione per lo sviluppo di neoplasie gastriche nel lungo termine nella gastrite atrofica del corpo-fondo.
c) Verificare nei familiari di 1° grado di pazienti affetti da gastrite atrofica del corpo-fondo la presenza di fattori di rischio per le neoplasie gastriche, ed in particolare la prevalenza del fenotipo di gastrite a rischio neoplastico.
4. Instabilità genomica, microRNA e acidi nucleici circolanti come fattori prognostici-diagnostici in 100 campioni di CG:
a) Analisi dell’instabilità genomica nel tumore primario (considerando la rilevanza dell’instabilità dei microsatelliti)
b) Espressione di un pannello di geni nel tumore primario (inclusi i microRNA di rilevanza oncologica, p.e. gli oncosoppressori “oncomiRs”).
c) Presenza di cellule tumorali circolanti nel sangue periferico di pazienti con CG. <<<

Risultati parziali attesi

L’obiettivo generale di questo progetto è l’identificazione di nuovi marcatori bio-molecolari nella prognosi precoce e nell’evoluzione clinica dei pazienti affetti da CG.
CASCATA DI EGFR ED INTERAZIONE CON LA CADERINA-E
Dal lavoro proposto, ci aspettiamo di comprendere i meccanismi sconosciuti riguardo la perdita della caderina-E durante la carcinogenesi e l’attivazione della cascata dell’EGFR. In particolare, ci aspettiamo di valutare il ruolo dell’interazione caderina-E/EGFR e di utilizzare questi risultati per individuare biomarcatori molecolari (partner della caderina-E) per una gestione clinica dei pazienti con CG. Tuttavia, ci aspettiamo che la capacità di questo progetto sia di creare la base per lo sviluppo di nuovi farmaci nel controllo clinico della progressione del CG.
Il lavoro in corso dovrà essere periodicamente discusso con collaboratori e colleghi. I risultati ottenuti dovranno essere presentati a seminari ed incontri scientifici. I risultati importanti dovranno essere pubblicati su riviste revisionate per ottenere la massima divulgazione.
Lo scopo della ricerca è valutare la frequenza e il tipo di alterazioni genetiche dell’EGFR. A tal fine, dovremmo individuare mutazioni, incremento di espressione ed amplificazione genica nei tumori primari. L’amplificazione genica dovrà essere effettuata solo nei casi che presentano incremento di espressione, con ciò è stato dimostrato una significativa associazione tra amplificazione genica e incremento di espressione di EGFR. L’amplificazione genica di EGFR è di solito associata a iper-espressione proteica di EGFR, anche se è stata descritta iper-espressione proteica in assenza di amplificazione genica. Nel carcinoma mammario, iper-espressione di EGFR è associata ad amplificazione genica in oltre il 90% dei casi. Questi risultati ci indicano a considerare la iper-espressione proteica come una metodica preliminare per identificare casi putativi con amplificazione. Altro meccanismo di conversione oncogenica dell’EGFR nel cancro comprende le mutazioni attivanti. Il cluster di mutazioni nel dominio TK di EGFR dovrà essere analizzato. Le mutazioni di EGFR occorrono nel dominio TK di EGFR (esoni 18-21) causando un’attivazione del recettore ligando-indipendente. Nel carcinoma polmonare non a piccole cellule questo tipo di mutazioni dell’EGFR sono altamente correlate con la risposta clinica agli inibitori della tirosin kinasi. Nel CG il significato prognostico e terapeutico rimane del tutto sconosciuto.
Lo scopo di questo progetto è valutare l’attivazione della cascata EGFR comparando i livelli di espressione di EGFR totale e delle sue varianti fosforilate così come dei suoi effettori pMAPK e pAKT. Queste ricerche saranno effettuate nei casi di adenocarcinoma gastrico con alterazioni di EGFR o con deregolazione della caderina-E. Questo punto è fondamentale nel progetto per comprendere se le cellule tumorali che esprimono perdita di funzione della caderina-E o alterazioni di EGFR nei tumori primari hanno una simile comportamento di segnale, come è stato riscontrato in vitro. Ci aspettiamo che questa evidenza sperimentale ci porti a comprendere quali neoplasie possono beneficiare usando gli inibitori TK (EGFR) nei pazienti con CG. Tuttavia, questo effetto cellulare causato da perdita della caderina-E era inibito in vitro da trattamento farmacologico mirato su EGFR (Tyrphostin AG 1478). Tutti i casi dovranno essere analizzati per alterazioni della caderina-E (mutazioni, ipermetilazione e delezioni). L’ipermetilazione della regione del promotore del gene CDH1 è l’evento più frequente che causa perdita della caderina-E nel CG; il nostro interesse è focalizzato sulla natura reversibile della metilazione. In accordo con la letteratura e con nostri risultati preliminari ottenuti da uno studio pilota condotto su una piccola serie di CG primari, circa il 60% di CG diffuso e 30% di CG intestinale presentano in attivazione della caderina-E dovuta ad ipermetilazione. Ci aspettiamo di confermare questi risultati su una serie vasta si pazienti con CG (500). Come sopraccitato, lo scopo di questo studio è determinare l’attivazione e il significato prognostico dei segnali-cascata dell’EGFR nel CG. I nostri risultati preliminari suggeriscono che le alterazioni strutturali dell’EGFR sono infrequenti nel carcinoma gastrico, ma qualora presenti, favoriscono la progressione tumorale. A tal proposito, noi consideriamo che la ricerca di alterazioni dell’EGFR nel CG è importante clinicamente in quanto seleziona pazienti suscettibili agli inibitori tirosin kinasi. La combinazione dei risultati di RT-PCR quantitativa, IHC, mutazioni somatiche e FISH dovrebbe essere utilizzata per determinare l’importanza delle alterazioni dell’EGFR come fattore prognostico e come marcatori di recidiva precoce nei casi sottoposti ad intervento chirurgico.

IDENTIFICAZIONE DI MARKERS PREDITTIVI AL TRATTAMENTO NEL CANCRO DELLO STOMACO E DEL CARDIAS
Obiettivo della presente proposta è:
-Identificare markers predittivi di risposta al trattamento Chemio Radioterapico preoperatorio in pazienti affetti da cancro gastrico usando l’analisi del DNA con microarray.
-Esaminare l’impatto di numerose associazioni plausibile fra polimorfismi di singoli nucleotidi e resistenza/ risposta alla terapia e prognosi a distanza.
-Individuare un panel di polimorfismi genetici che possa consentire di selezionare i pazienti che possono giovarsi di un trattamento combinato neoadiuvante.

HELICOBACTER PYLORI E RISCHIO DI CG
Obiettivi generali:
-Identificare nel siero di pazienti con GAC marker antigenici dell’infezione da H pylori specifici e verificare se tali markers risultano riscontrabili anche in pazienti con adenocarcinoma gastrico.
-Verificare se l’utilità dello staging e del grading nella valutazione del rischio neoplastico sia utile nel management dei pazienti con la condizione precancerosa e possa rappresentare un modello predittivo da applicare in futuri studi clinici.
-Verificare se la popolazione di familiari sia a rischio per neoplasie gastriche e necessiti di eventuale sorveglianza endoscopica/istologica.

INSTABILITA’ GENOMICA, MICRORNA E CELLULE CIRCOLANTI NEL CG
I risultati di questo progetto di ricerca traslazionale potrebbero permettere di identificare nuovi meccanismi di progressione del carcinoma gastrico che a loro volta rappresenterebbero sia nuovi target per lo sviluppo di terapie molecolari mirate sia nuovi marcatori biologici in grado di selezionare i pazienti a maggior rischio di recidiva dopo chirurgia apparentemente radicale (ovvero candidati a terapia adiuvante). <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

In Europa, il CG rappresenta la quarta causa di morte per neoplasia. In Italia, l’incidenza di questa neoplasia cambia significativamente a seconda delle regioni, la Toscana e, in particolare Siena e provincia, presenta un’incidenza sopra la media nazionale. La diagnosi precoce di recidiva neoplastica potrebbe permettere un trattamento tempestivo con una migliore gestione e con risultati a lungo termine favorevoli. Gli attuali protocolli sono insoddisfacenti nell’identificare pazienti operati ad elevato rischio di recidiva precoce. EGFR è un membro della famiglia dei recettori tirosin kinasi, che comprende: EGFR/HER1, erbB2/HER2, erbB3/HER3 e erbB4/HER4. Rappresenta una proteina transmembrana con dominio tirosin kinasi intracellulare. EGFR causa incremento della motilità cellulare in vitro nelle cellule che presentano mutazioni della caderina-E nella regione extracellulare. Le mutazioni extracellulari della caderina-E alterano la stabilità dell’eterodimero caderina-E/EGFR con conseguente incremento della quantità libera dell’EGFR utilizzata per l’attivazione. L’effetto dell’attivazione dell’EGFR sulla motilità cellulare manifesta reversibilità dopo trattamento con farmaci inibitori dell’EGFR.
I fattori ambientali rappresentano un ruolo importante nella carcinogenesi gastrica, come i polimorfismi genetici e l’infezione da Helicobacter Pylori.
Molti studi riportano dati a favore della capacità dei polimorfismi genetici di predire risposta e sopravvivenza dei pazienti effetti da vari tipi di tumore in seguito a trattamenti farmacologici e radioterapici. Nel caso dei tumori gastrici è stata suggerita una associazione tra i polimorfismi dei geni che codificano per le proteine di riparo del DNA o che modulano il metabolismo dei folati e il rischio insorgenza della patologia; polimorfismi del gene ECRG2 sono stati associati alla sopravvivenza. Altri studi sono stati condotti sulla relazione tra polimorfismi genici e risposta alla terapia neoadiuvante: promettenti si sono rivelati i risultati relativi ai geni coinvolti nel metabolismo e nella distribuzione dei farmaci somministrati, i geni che codificano per i bersagli
molecolari delle terapie e i geni responsabili del riparo dei danni provocati dai trattamenti nelle cellule tumorali. Il bersaglio principale del 5-FU è la timidilato sintetasi (TS) correlata all’azione della diidroropirimidine deidrogenasi (DPYD). Molti studi clinici hanno dimostrato un aumento di efficacia del 5-FU in presenza di bassi livelli di TS, mentre la tossicità è aumentata in presenza di deficit di DPYD. Polimorfismi in questi geni possono influenzare la risposta terapeutica. La risposta del tumore può dipendere anche dall’attività di altri enzimi coinvolti nel meccanismo di azione del 5FU [per esempio timidina fosforilasi (TP), timidina chinasi (TK), metilenetetraidrofolato reduttasi (MTHFR)
Cisplatino L’aumentata espressione degli excision repair cross complementing genes 1 and 2 (ERCC 1 and 2), coinvolti nei processi di riparazione del DNA, sembra correlarsi ad una resistenza al cisplatino.
Condizione predisponente per l’adenocarcinoma di tipo intestinale è la gastrite atrofica del corpo-fondo (GAC). Alla base della GAC vi è spesso l’infezione da Hp,che si inserisce come fattore patogenetico iniziale nella cascata di eventi che porta dalla gastrite al CG,nota come “ipotesi di Correa”,che prevede anche il passaggio dall’atrofia e dalla metaplasia intestinale (MI) alla neoplasia. La MI della mucosa fundica aumenta di 6x il rischio di CG rispetto ai pazienti con interessamento antrale e l’estesa MI della mucosa fundica, esclusiva di GC, aumenta il rischio di 12 volte. Familiari di I° di pazienti con CG hanno maggiore prevalenza di GAC con ipocloridria che i soggetti senza familiarità di CG. L'ipocloridria della GAC determina la crescita di batteri producenti nitrosamine, potenziali carcinogeni. Le modificazioni del microambiente gastrico potrebbero essere un ulteriore fattore responsabile dell'aumentato rischio di CG nei pazienti con GAC. Per i pazienti con GAC è stato riportato un rischio a 10 anni per il CG dallo 0.9- 11%. E’ stato riportato che i pazienti con “panatrofia” hanno un RR di 27 per sviluppare una neoplasia in un follow-up di 7 anni in confronto a pazienti con sola atrofia del corpo, indicando nel concomitante danno atrofico della mucosa gastrica un criterio di rischio per il CG. Il rischio di CG correlato all’infezione da Hp si verifica quando la gastrite comporta un danno della mucosa fundica con atrofia e MI. Recentemente si e’ dimostato che nei pazienti con GAC Hp negativi con tecniche convenzionali esistono tracce sierologiche dell’infezione da Hp rilevabili con l’immunoblotting verso antigeni specifici (CagA o VacA). La caratterizzazione delle proteine antigeniche prodotte dai ceppi di Hp e la risposta umorale ad essi è utile al fine di identificare biomarker proteici che possono caratterizzare i pazienti a rischio di CG.
Fra i molteplici fattori biologici coinvolti nella progressione del carcinoma gastrico
la perdita della stabilità genomica rappresenta un evento chiave che avviene precocemente nella cancerogenesi gastrica e crea condizioni permissive all'accumulo di alterazioni genetiche ed epigenetiche che portano all'attivazione di oncogeni e all'inattivazione di geni tumore-soppressivi. La MSI è stata riportata in un sottogruppo di carcinomi gastrici sporadici che varia dal 25% al 50%. Si ritiene che i tumori gastrici MSI+ progrediscano attraverso mutazioni in geni coinvolti nella regolazione della proliferazione cellulare (e.g. TGFbRII, IGFIIR), dell'apoptosi (BAX, FAS, APAF1), e della riparazione del DNA (hMSH6, hMSH3, MED1, RAD50, BLM, ATR). La MSI sembra conferire specifiche caratteristiche clinico-patologiche. Infatti, rispetto ai i tumori gastrici MSI-, quelli MSI+ sono più spesso di tipo intestinale, a sede antrale e presentano meno frequentemente metastasi linfonodali. Non sorprende quindi che diversi autori abbiano osservato sopravvivenze migliori in pazienti portatori di tumori MSI+.
I microRNA sono corte sequenze di RNA che fungono da regolatori genici negativi e che controllano un ampio spettro di funzioni biologiche quali proliferazione cellulare, differenziazione e apoptosi.
Recenti evidenze indicano che i microRNA possono agire anche come geni soppressori tumorali (e.g. i microRNA del gruppo let-7, che regola negativamente gli oncogeni Ras) e come oncogeni (e.g. mir-155, mir-21, che giocano un ruolo chiave nello sviluppo e nella progressione tumorale). I microRNA cancro-correlati sono stati attivamente studiati nei processi di aggressività tumorale al fine di identificare nuovi fattori prognostici e di sviluppare nuove possibilità terapeutiche. Attualmente esistono solo due studi pubblicati sui microRNA nel cancro gastrico dell'uomo che dimostrano che let-7a è sottoregolato nel carcinoma gastrico e che mir155 è efficace nella terapia genetica degli xenotrapianti umani di carcinoma gastrico.
La identificazione di marcatori biologici di aggressività tumorale espressi dalle CTC potrebbe consentirci di individuare i meccanismi di progressione tumorale, selezionando i pazienti ad alto rischio di sviluppare ripresa di malattia.
La presenza di cellule tumorali circolanti (CTC) nel sangue periferico di pazienti con tumori solidi è un dato ormai conosciuto. Tuttavia il significato biologico delle CTC in termini di progressione tumorale è tuttora oggetto di discussione. <<<