RICERCA ITALIANA     

Studio delle basi molecolari e cellulari della risposta alla terapia mirata con inibitori delle tirosin-kinasi per l'ottimizzazione del trattamento delle leucemia Philadelphia positive

Università degli Studi di Napoli "Federico II"

Abstract

I progressi nella comprensione a livello molecolare dei meccanismi di leucemogenesi hanno portato allo sviluppo di una nuova generazione di farmaci, detti farmaci a bersaglio molecolare o “biologici”. Il capostipite di questi nuovi farmaci è l’imatinib (IM), un farmaco in grado di inibire l’attività tirosin chinasi del gene di fusione BCR-ABL che ritroviamo nella leucemia mieloide cronica (LMC) e nel 20-30% delle leucemie linfoblastiche acute (LLA). L'IM, che rappresenta ormai il "gold standard" della terapia della LMC, . è risultato attivo anche nella crisi blastica di LMC e nelle LLA BCR-ABL+, tuttavia con una minor frequenza di risposte e un elevato grado di ricadute. Le ricadute, che possono essere osservate anche nella LMC, sono dovute dalla comparsa di cloni che acquisiscono alterazioni aggiuntive e rappresentano un rilevante problema terapeutico. Le mutazioni di BCR-ABL rappresentano il meccanismo più comune di resistenza nei pazienti ricaduti sin qui identificato ma si trovano però a bassa frequenza in pazienti refrattari a IM, suggerendo pertanto l’esistenza di diversi meccanismi di resistenza. In questi casi, anomalie secondarie possono attivare vie alternative indipendenti da BCR-ABL in grado di sostenere la proliferazione o la resistenza all'apoptosi, diminuendo l'efficacia della terapia con IM. Un ulteriore problema che altera l'efficacia finale della terapia con IM nella LMC è che IM non elimina completamente le cellule maligne. Infatti solo il 5-10% di questi pazienti diventano PCR negativi, e nella maggior parte dei pazienti in remissione completa è possibile evidenziare un limitato numero di cellule Ph+ che probabilmente corrispondono ad una popolazione residua di cellule staminali quiescenti nel midollo dei pazienti. Tutto ciò rappresenta una grande preoccupazione che getta un ombra sull'efficacia a lungo termine della terapia con IM e sulla possibilità di ottenere la eradicazione della malattia ed di poter interrompere quindi il trattamento. Nuovi farmaci ad attività di inibizione delle TK, più potenti dell’imatinib ed attivi anche sulle forme mutate della proteina oncogenica BCR/ABL, sono in sperimentazione clinica, ma i dati preclinici indicano che anche questi farmaci non sembrerebbero in grado di indurre apoptosi sulla componente staminale Ph+.
Obbiettivo finale del progetto di ricerca è l’ottimizzazione della terapia molecolare con gli inibitori delle TK nella LMC e nelle LLA Ph+. Per raggiungere questo obiettivo il progetto sarà indirizzato a:
1. Caratterizzazione dei meccanismi molecolari responsabili della resistenza primaria ed acquisita a IM e ad altri inibitori di TK nella CML e nelle ALL Ph-+ e valutazione preclinica, su linee cellulari e su campioni da pazienti, dell'efficacia di nuovi inibitori per TK di BCR-ABL e della terapia di combinazione con diversi composti che inibiscono l'attività delle TK ed altre vie molecolari che cooperano con BCR-ABL nella trasformazione cellulare;
2. Studio dei meccanismi che portano all'attivazione della via anti-apoptotica che coinvolge NF-kB e dei problemi legati al trasporto nucleare di BCR-ABL, potenzialmente responsabili per la diminuita sensibilità alla terapia con IM in una percentuale variabile della popolazione cellulare leucemica;
3. Identificazione e sviluppo di possibili approcci di immunoterapia diretti ad eradicare la "persistenza" di piccole quantità di malattia minima residua nella maggior parte dei pazienti di CML che ottenengono una risposta citogenetica completa con IM;
4. Isolamento e caratterizzazione a livello molecolare delle CD34+ Ph+ dei pazienti in remissione citogenetica completa e valutazione in vitro ed in vivo della sensibilità di queste cellule al trattamento combinato o sequenziale ai tre principali farmaci inibitori di TK disponibili in clinica, l’imatinib, il dasatinib ed il nilotinib;
5. Studio della regolazione dell’espressione del gene di fusione BCR/ABL nei precursori e nelle cellule staminali Ph+;
6. Sviluppo di studi clinici di fase I-II e di fase III nella CML e nelle ALL-Ph+, diretti a stabilire la risposta citogenetica e molecolare a nuovi inibitori di TK già disponibili per studi clinici, a alte dosi di IM ed a terapie di combinazione con chemioterapia e con altri approcci di "targeted therapy".
Elementi di novità e punti di forza del progetto sono quindi lo studio delle cellule staminali Ph+, che rappresentano il serbatoio potenzialmente in grado di dare la recidiva della malattia e la stretta interconnessione tra gli studi di tipo biologico-traslazionale con quelli clinici, con la sperimentazione clinica che fornirà il materiale per gli studi biologici, i cui risultati a loro volta permetteranno di indirizzare la sperimentazione clinica verso strategie sequenziali o combinatorie in grado di ottimizzare la terapia della LMC e delle altre leucemia Ph+. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Fabrizio Pane Università degli Studi di NAPOLI "Federico II"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Questo progetto di ricerca integrato e traslazionale ha lo scopo di ottimizzare la terapia mirata con inibitori di tirosin-kinasi (TK) in tumori ematologici, caratterizzati dalla presenza di oncogeni con attività tirosin-chinasica. Negli ultimi anni, sono stati sviluppati diversi farmaci antitumorali specificamente diretti contro oncogeni che presentano una deregolata attività tirosin-chinasica. Il farmaco capostipite in questo campo è stato l'imatinib, in grado di inibire BCR-ABL e altri oncogeni come KIT e PDGFR alfa e beta. L' IM è notevolmente efficace nel trattamento della leucemia mieloide cronica fino a divenire il farmaco di prima scelta per i pazienti affetti da questa leucemia, ma la resistenza al farmaco sta emergendo come un problema significativo. Dall'esperienza maturata con l'impiego di imatinib nelle leucemie BCR-ABL positive,
vogliamo estrapolare alcuni principi generali sull'impiego degli inibitori delle TK che possano avere un'applicabilità più generale nella cosiddetta "targeted therapy" di altri tumori ematologici. È chiaro infatti che non solo l'identificazione dei bersagli molecolari appropriati, ma anche la definizione delle vie molecolari attivate da BCR/ABL rappresenta una fase essenziale per l'ottimizzazione della terapia.
Il progetto ha come oggetto di studio due diversi tipi di tumori: a) la leucemia mieloide cronica (CML) caratterizzate dall'attivazione di un oncogene molto studiato quale BCR-ABL e nelle quali la terapia mirata con inibitori delle TK come imatinib rappresenta già la terapia standard e nelle quali un alto grado di esperienza clinica accumulata negli ultimi anni permette di identificare una serie di problemi che dovranno essere risolti per ottimizzare la risposta ed il risultato finale di questo tipo di terapia innovativa; b) e la leucemia linfatica acuta Ph-positiva, che presenta una risposta del tutto insoddisfacente alla chemoterapia convenzionale ed in cui l’efficacia e gli schemi di terapia con farmaci inibitori di tirosino chinasi è ancora in evoluzione.
Gli obbiettivi che si è posto il progetto sono, da un lato, la definizione di importanti aspetti molecolari e cellulari che sono alla base della resistenza al trattamento delle leucemie Ph+ con farmaci inibitori di tirosin chinasi, dall’altro, la esplorazione e la fase preclinica di sviluppo di immunoterapia mirata al minimo numero di cellule leucemiche che residuano al trattamento di “debulky” con farmaci inibitori di TK, che potrebbero quindi essere inseriti in protocolli di trattamento innovativi per queste patologie, con lo scopo finale di ottimizzare ed affinare l’efficacia del trattamento.
In particolare gli obbiettivi finali saranno:
1. caratterizzazione dei meccanismi molecolari responsabili della resistenza primaria ed acquisita ad imatinib e ad altri inibitori di TK nella CML e nelle ALL Ph+ e valutazione preclinica, su linee cellulari e su campioni da pazienti, dell'efficacia di nuovi inibitori per TK di BCR-ABL e della terapia di combinazione con diversi composti che inibiscono l'attività delle TK ed altre vie molecolari che cooperano con BCR-ABL nella trasformazione cellulare;
2. definizione dei meccanismi che portano all'attivazione della via anti-apoptotica che coinvolge NF-kB e dei problemi legati al trasporto nucleare di BCR-ABL,, potenzialmente responsabili per la diminuita sensibilità alla terapia con imatinib in una percentuale variabile della popolazione cellulare leucemica;
3. identificazione e sviluppo di possibili approcci di immunoterapia diretti ad eradicare la "persistenza" di piccole quantità di malattia minima residua nella maggior parte dei pazienti di CML che ottenengono una risposta citogenetica completa con imatinib;
4. Isolamento, definizione delle caratteristiche molecolari delle CD34+ Ph+ dei pazienti in remissione citogenetica completa e della loro sensibilità in vitro ed in vivo al trattamento combinato o sequenziale ai tre principali farmaci inibitori di TK disponibili in clinica, l’imatinib, il dasatinib ed il nilotinib;
5. Studio della regolazione dell’espressione del gene di fusione BCR/ABL nei precursori e nelle cellule staminali Ph+;
6. Sviluppo e valutazione di studi clinici di fase I-II e di fase III nella CML e nelle ALL-Ph-positive, che utilizzano le esperienze ed i risultati ottenuti nell’ambito del progetto di ricerca dalle unità coinvolte ed sono volti a stabilire la risposta citogenetica e molecolare ai nuovi inibitori di TK già disponibili per studi clinici, a alte dosi di imatinib ed a terapie di combinazione con immunoterapia e con altri approcci di "targeted therapy". <<<

Risultati parziali attesi

I principali risultati attesi sono:
1. Caratterizzazione dei meccanismi molecolari responsabili della resistenza primaria ed acquisita a IM e ad altri inibitori di TK nella CML e nelle ALL Ph+. Per spiegare l'insorgenza di resistenza a IM sono stati chiamati in causa diversi meccanismi, ma quello più frequente è rappresentato dalle mutazioni puntiformi a livello di regioni critiche del dominio tirosin-chinasico di ABL, che riducono la possibilità di legame del IM al sito catalitico del proteina oncogenica. Inoltre, numerose evidenze sperimentali mostrano l’esistenza di meccanismi alternativi di farmacoresistenza che potrebbero compensare l'inibizione di BCR/ABL da parte di IM attraverso l'attivazione di vie alternative di trasduzione del segnale mediate da altre tirosino-chinasi. Pertanto in seguito al lavoro sperimentale proposto, i risultati attesi saranno:
A. La conoscenza dei meccanismi molecolari responsabili della resistenza primaria ed acquisita a IM e ad altri inibitori di TK nella CML e nelle ALL Ph-positive;
B. La comprensione dei meccanismi che portano all'attivazione della via anti-apoptotica che coinvolge NF-kB e dei problemi legati al trasporto nucleare di BCR-ABL, potenzialmente responsabili della diminuita efficacia clinica dell’IM in una percentuale variabile della popolazione cellulare leucemica;
Tali acquisizioni consentiranno di sviluppare le seguenti applicazioni:
- valutazione preclinica, su linee cellulari e su campioni da pazienti, dell'efficacia di nuovi inibitori per TK di BCR-ABL e della terapia di combinazione con diversi composti che inibiscono l'attività delle TK ed delle altre proteine che cooperano con BCR-ABL nella trasformazione cellulare;
- Identificazione e sviluppo di nuovi approcci di terapia mirata nei tumori ematologici caratterizzati dall'attivazione di oncogeni TK;
- Sviluppo di studi clinici di fase I-II e di fase III nella CML e nelle ALL-Ph+, diretti a stabilire la risposta citogenetica e molecolare nei pazienti trattati con nuovi inibitori di TK, già disponibili per studi clinici, o con alte dosi di IM, oppure con terapie di combinazione (chemioterapia e terapia specifica per i difetti molecolari analizzati).

2. Studio dei meccanismi molecolari che portano all'attivazione della via anti-apoptotica di NF-kB come meccanismo di ridotta sensibilità ad IM.
Numerose evidenze sperimentali hanno recentemente dimostrato che NF-KB, un fattore trascrizionale che induce l’espressione di numerosi geni a funzione ad attività anti-apoptotica, è attivato nelle cellule dei pazienti con LMC in crisi blastica e potrebbe mediare alcuni dei meccanismi di resistenza ad IM. Pertanto in seguito al lavoro sperimentale proposto, i risultati attesi permetteranno la conoscenza:
- dei meccanismi inibitori esercitati dalla proteina oncogenica BCR/ABL sul fattore NF-KB esercitata mediante l’attività di IkB.
- Della veridicità dell’ipotesi che lo shuttle citoplasma/nucleo di BCR/ABL possa avere un ruolo nei meccanismi di sopravvivenza cellulare legati a NF-KB.

3. Isolamento e caratterizzazione a livello molecolare delle CD34+ Ph+ dei pazienti in remissione citogenetica completa e valutazione in vitro ed in vivo della sensibilità di queste cellule al trattamento combinato o sequenziale ai tre principali farmaci inibitori di TK;
I risultati attesi del lavoro sperimentale proposto, permetteranno:
- La conoscenza della sensibilità delle cellule staminali all'azione degli inibitori delle tirosino-chinasi da soli e in sequenza.
- La comprensione dei meccanismi di resistenza a IM diversi dalle mutazioni puntiformi nel dominio tirosino-chinasico di Abl e indipendenti dalla presenza della proteina oncogenica BCR/ABL, come ad esempio, resistenza mediata dalla attività di trasportatori di membrana (hOCT1, ABCB1, ABCG2)
- la definizione del tasso di mutazioni nelle cellule Ph+ rispetto a cellule CD34+ normali mediante analisi di "whole-genome sequencing" (Sequenom Mass Array).

4. Studio della regolazione dell’espressione del gene di fusione BCR/ABL nei precursori e nelle cellule staminali Ph+;
Alcune recenti evidenze sperimentali indicano che la relativa farmaco-resistenza delle cellule staminali leucemiche Ph+ può essere attribuita agli elevati livelli di espressione di BCR-ABL. Lo studio dei meccanismi coinvolti nella trascrizione di BCR-ABL e la alterazione dei meccanismi generali della trascrizione genica appare dunque cruciale per la comprensione degli eventi che sottendono la risposta all'IM (o ad altri inibitori delle TK) e per l'individuazione di bersagli farmacologici addizionali rilevanti per il miglior controllo della malattia.
Pertanto in seguito al lavoro sperimentale proposto, i risultati attesi saranno la definizione:
- del controllo trascrizionale mediato dalle code istoniche, associato all'attività TK di p210 BCR-ABL .
- delle interazioni di p210 BCR-ABL con le chinasi Aurora (AK), nuovo potenziale bersaglio terapeutico grazie all’introduzione nella pratica clinica dello specifico inibitore MK-0457 (VX-670).
- Delle modificazioni covalenti della cromatina coinvolte nella regolazione trascrizionale nei progenitori ematopoietici staminali derivanti da pazienti affetti da LMC.
5. Identificazione e sviluppo di possibili approcci di immunoterapia diretti ad eradicare la "persistenza" di piccole quantità di malattia minima residua;
Questa parte del lavoro sperimentale è dedicata a verificare la possibilità di sviluppo di una metodologia per la immunoterapia delle cellule Ph+ che residuano nei pazienti in remissione clinica e citogenetica dopo il trattamento con farmaci inibitori di TK.
In particolare il lavoro sperimentale consentirà di approfondire le seguenti conoscenze:
- Espressione di uno specifico TAA (PRAME) in pazienti affetti da LMC e possibile regolazione mediante agenti demetilanti.
- Sviluppo di specifici protocolli per la generazione e l’espansione ex vivo di CTL specificamente diretti a riconoscere peptidi derivanti dalla proteina Prame e ristretti al HLA-A2.

6. Sviluppo di studi clinici di fase I-II e di fase III nella CML e nelle ALL-Ph+, con uno stretto collegamento a
tutti gli studi di tipo traslazionale previsti nel progetto. Gli studi utilizzeranno sia l’IM che i nuovi inibitori di TK sia nella LMC che nella LLA-Ph+. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Le tirosino-chinasi (TK) comprendono un gruppo di circa 100 proteine che hanno un ruolo essenziale nel controllo di importanti funzioni cellulari, incluso il processo proliferativo e differenziativo. (1). Pertanto le alterazioni delle funzioni di TK sono tra le più frequenti anomalie molecolari ritrovate nelle neoplasie umane, il cui prototipo è costituito dalle leucemie Philadelphia-positive (Ph+). Le leucemie Ph+ sono un modello di studio unico per lo sviluppo di terapie mirate in quanto il fenotipo neoplastico è sostenuto da una singola specifica alterazione genetica (2). Quest'alterazione risulta dalla traslocazione reciproca fra i cromosomi 9 e 22, che crea un derivativo 9q+ e un derivativo 22q noto come cromosoma Ph. Per effetto della traslocazione t(9;22), il gene BCR (sul cromosoma 22) viene ad essere giustapposto al gene ABL (sul cromosoma 9) (3,4). c-ABL codifica per una tirosino-chinasi non recettoriale implicata in una vasta gamma di processi tra i quali la regolazione della crescita e della sopravvivenza cellulare, lo stress ossidativo, le risposte innescate da danni al DNA, la migrazione cellulare, la trasduzione delle informazioni provenienti dall'ambiente extracellulare. A seguito della traslocazione si forma una proteina ibrida BCR/ABL che mantiene l'intero dominio tirosino-chinasico di ABL, e che ha un sostanziale incremento dell'attività tirosino-chinasica, paragonato a quello di ABL normale, in grado di indurre e mantenere il fenotipo neoplastico (5). Ovviamente considerare BCR/ABL semplicemente una forma costitutivamente attivata di cABL sarebbe troppo semplicistico. La proteina BCR/ABL ha anche differenti funzioni rispetto alla controparte normale che rimangono in parte ignote. La proteina ibrida BCR-ABL altera diversi pathways molecolari a vari livelli, dalla membrana al nucleo: oltre la traduzione del segnale, in particolare la via di RAS e dei suoi effettori a valle, (6,7) MYC (8) e STATs (9) e l'adesione allo stroma delle cellule Ph positive (10,11). L'inibizione dell'apoptosi è recentemente emersa come un processo chiave nel processo di trasformazione indotto da BCR/ABL. Infatti, sebbene cABL normale gioca un ruolo importante nella risposta cellulare agli stress genotossici e probabilmente possiede un ruolo proapototico, BCR/ABL è un potente inibitore dell'apoptosi (12). Questo potrebbe in parte essere spiegato dal fatto che una delle maggiori differenze tra cABL normale e BCR/ABL è la sua differente localizzazione cellulare. La proteina c-ABL si ritrova sia nel nucleo che nel citoplasma e può traslocare tra questi due compartimenti per la presenza di domain di localizzazione nucleare e export nucleare. Al contrario, BCR-ABL è esclusivamente citoplasmatico e sembra essere incapace di entrare nel nucleo, dove c-ABL normale esercita la sua funzione proapoptotica (12). Alcuni aspetti di questo fenomeno, tuttavia, sono ancora ignoti e richiedono ulteriori studi come suggerito da questo progetto. BCR/ABL può inibire l'apoptosi anche attivando a livello citoplasmatico il pathway di PIK3/AKT (12), inoltre un altro importante pathway passa attraverso NF-kB/Rel che è attivato nelle LMC. Questo suggerisce l'importanza degli studi come quelli proposti nel progetto mirati a comprendere meglio il ruolo del pathway antiapoptotico e dell'attivazione di NF-kB nella patogenesi della malattia.
Il gene di fusione BCR/ABL che è associato al 100% dei casi di leucemia mieloide cronica (LMC), ma può essere presente anche in un consistente percentuale di leucemie linfoidi acute (LLA), soprattutto nei pazienti anziani (13). Nel caso della LLA, il 70% di pazienti presenta una proteina ibrida BCR/ABL più piccola (P190) rispetto alla P210 che si ritrova nella leucemia mieloide cronica, ma nel restante 30% dei casi la proteina è esattamente la uguale a quella della LMC (13). Pertanto la relazione che intercorre tra il tipo di TK BCR/ABL oncogenica e il fenotipo associato alla leucemia è una questione interessante che al momento resta irrisolta. I dati accumulati sul ruolo di BCR-ABL nella LMC indicano questa Tk oncogenica come attraente bersaglio per una terapia molecolare mirata. E'chiaro che Bcr/Abl è un bersaglio di intervento terapeutico ideale dal momento che ha un ruolo chiave nella patogenesi delle leucemie Ph+, e non è espressa dalle cellule normali.
Imatinib mesilato (IM) è stato il primo inibitore delle tirosino-chinasi ad essere usato per il trattamento delle leucemie Ph+. IM è una 2-fenilaminopirimidina in grado di legarsi al dominio di legame per l'ATP di Bcr-Abl bloccando la chinasi nella sua conformazione inattiva (14,15). IM agisce quindi spegnendo tutte le vie di traduzione del segnale innescate da BCR/ABL poiché ne impedisce sia l'autofosforilazione che la fosforilazione degli effettori a valle (16). Numerosi studi clinici (17-20), compresi studi condotti dai ricercatori di alcune delle unità operative del presente progetto nell'ambito del GIMEMA Working Party sulla LMC (originariamente Gruppo Cooperatore Italiano sulla LMC) (21-23) hanno dimostrato l'efficacia del trattamento nei pazienti con LMC in fase cronica precoce e la tollerabilità di IM; dati aggiornati a 60 mesi di follow-up dimostrano che tra i pazienti in fase cronica (FC) che vengono trattati in prima linea con IM, il 98% ha raggiunto una risposta ematologica completa, il 92% una risposta citogenetica maggiore, l'87% una risposta citogenetica completa (24). Tuttavia, nonostante IM si sia dimostrato il trattamento farmacologico di gran lunga più efficace per la LMC, due problemi permangono e gettano un'ombra sulla sua efficacia a lungo termine. Il primo problema è rappresentato dal fatto che nella maggioranza dei casi IM non è in grado di eradicare completamente la malattia. Saggi estremamente sensibili come la nested RT-PCR mostrano che nonostante i livelli di trascritto Bcr-Abl si riducano notevolmente nei pazienti che rispondono a IM, le remissioni complete a livello molecolare sono rare. IM non è in grado di eliminare completamente i progenitori Ph+ (25) e infatti cellule staminali Ph+ primitive, quiescenti prelevate da pazienti con LMC sono risultate insensibili all'esposizione in vitro a IM (26). I meccanismi che sottendono alla non completa eliminazione delle cellule staminali neoplastiche nei pazienti trattati con IM sono però ancora sconosciuti. Il secondo problema è che cloni Ph+ resistenti a IM possono emergere ed acquisire un vantaggio di crescita selettivo rispetto ai non resistenti, determinando la ricaduta del paziente. La resistenza appare più spesso e più rapidamente in pazienti con leucemia linfoblastica acuta (LLA) Ph+ e in pazienti con LMC in fase avanzata, ma si osserva anche in pazienti con LMC in FC che vengono trattati con IM in prima linea. Il meccanismo di resistenza di gran lunga più studiato è rappresentato dall'insorgenza di mutazioni puntiformi nel dominio tirosino-chinasico di Abl che compromettono il legame di IM (27). Tali mutazioni si osservano spesso in caso di LLA Ph+ e di LMC in fase avanzata, nonché in caso di ricaduta dopo un'iniziale risposta (28), mentre non è ancora ben chiaro ciò che principalmente contribuisce alla resistenza in FC e nei casi che non ottengono mai una risposta soddisfacente al trattamento con IM. Ora che alcuni inibitori di seconda generazione si stanno rendendo disponibili (29), è essenziale capire come impiegare al meglio le armi che abbiamo a disposizione. In particolare, focalizzarsi sulla comprensione dei meccanismi che permettono alle cellule staminali Ph+ di sopravvivere a IM, rappresentando così un pericoloso serbatoio di cloni resistenti che potrebbero espandersi e portare alla ricaduta. In parallelo, sperimentare in ambito clinico, in pazienti con LMC di nuova diagnosi, l'efficacia di una strategia terapeutica che preveda l'utilizzo sequenziale di inibitori diversi, dal momento che questo campo è ancora inesplorato.

Bibliografia
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