RICERCA ITALIANA     

"Targeting" di RNA e microRNA con acidi peptido nucleici (PNA) e loro analoghi

Università degli Studi di Parma

Abstract

L'RNA è il target di numerosi studi indirizzati alla ricerca di molecole capaci di bloccare in maniera selettiva l'espressione genica mediante strategie antisenso. Nel corso degli ultimi anni i progressi della biologia molecolare hanno permesso l'individuazione di un numero elevato di geni che codificano per piccole molecole di RNA, i microRNA (miRNA), sequenze nucleotidiche di lunghezza variabile da 21 a 25 nucleobasi, che sono coinvolte nella regolazione post-transcrizionale dell'espressione genica in piante e animali. L'alterazione dei livelli di alcuni miRNA è stata associata alla presenza di forme tumorali e miRNA sono coinvolti nel meccanismo di regolazione di geni promotori di tumori. Oligonucleotidi sintetici, che agiscono come competitori legando specificatamente miRNA, sono stati proposti come potenziali nuovi farmaci.
Inoltre, molecole in grado di mimare l'attività di small interfering RNA (siRNA), avendo come target precursori di RNA nucleare, possono essere di alto valore terapeutico per malattie come la talassemia, il cancro e le malattie neurodegenerative.
E' pure crescente l'interesse diagnostico verso agenti patogeni costituti da virus a RNA veicolati da alimenti, quali ad esempio il norovirus, la cui corretta identificazione è difficile sia in campioni umani che in alimenti.
Risulta pertanto di particolare interesse individuare molecole capaci di riconoscere specificatamente target a RNA sia per scopo diagnostico che terapeutico.
I PNA (acidi peptido nucleici) sono analoghi di oligonucleotidi di tipo poliammidico molto promettenti per il riconoscimento di RNA poiché possiedono una maggiore affinità per l'RNA rispetto ad analoghe sequenze a DNA, sono più specifici e risultano stabili all'azione delle nucleasi. Il loro potenziale utilizzo terapeutico ne fa candidati ideali per lo sviluppo di nuovi farmaci.
Il presente progetto ha l'obiettivo di progettare e sintetizzare nuovi acidi peptido nucleici (PNA) specificamente destinati alla complessazione dell'RNA, per essere utilizzati in diagnostica e come nuovi strumenti terapeutici.

Il progetto si articola nelle seguenti fasi:

1. Progettazione di nuovi monomeri ed oligomeri di PNA. La progettazione sarà basata sui dati
strutturali e sulla modellistica molecolare di duplex PNA-RNA, ai fini di migliorarne la stabilità e la selettività del riconoscimento. Verranno studiate specifiche modifiche dello scheletro, con particolare riguardo all'appropriata stereochimica (PNA chirali), all’introduzione di nuovi monomeri a base di idrazinoetilglicina (hyd-PNA) e ammminoetilazaglicina (aza-PNA) e saranno valutate modifiche funzionali delle nucleobasi in modo che possano dare non solo legami tipo Watson-Crick ma anche di tipo Hoogsteen per aumentare la forza e la selettività del binding.
Saranno progettati PNA aventi come sequenze bersaglio micro-RNA e mRNA o che mimino l’attività di miRNA o di siRNA.

2. Messa a punto di nuove strategie sintetiche su fase solida per la preparazione di nuovi PNA.
In particolare saranno sintetizzati PNA chirali, progettati secondo i requisiti evidenziati nei punti precedenti, con metodi che salvaguardino la purezza ottica del composto, e che possano essere modulati a seconda delle condizioni acide o basiche richieste.
Saranno sintetizzati PNA contenenti nuovi monomeri di tipo (hyd-PNA) e (aza-PNA) e nucleobasi modificate.
Saranno inoltre preparati PNA coniugati con diversi gruppi in modo da essere utilizzati a scopo diagnostico o terapeutico: a) con fluorofori (Light Up Probes, Molecular Beacons); b) con complessi di renio; c) con nanoparticelle di ferro; e) chimere PNA-DNA e PNA-peptidi.

3. Le capacità complessanti dei nuovi PNA sintetizzati per l' RNA a singolo e doppio filamento verranno valutate in soluzione mediante spettrofotometria UV-Vis, dicroismo circolare, spettrometria di massa ESI, esperimenti di gel shift e NMR, e allo stato solido mediante cristallizzazione e analisi ai raggi X.

4. Sviluppo di nuovi metodi diagnostici per il riconoscimento di sequenze di RNA.
a) Verranno sviluppate strategie per l'amplificazione isoterma dell'RNA per il riconoscimento di virus a RNA, in particolare virus alimentari (norovirus).
b) Piattaforme avanzate, come microarrays, light up probes, beacons e dispositivi microfluidici basati sulla SPRI (Surface Plasmon Resonance Imaging), verranno usate in combinazione con specifiche sonde a PNA.

5. Applicazioni biomediche
I PNA modificati che avranno offerto le migliori proprietà di binding e di selettività per l’RNA saranno valutati in esperimenti a livello cellulare, in particolare PNA: (a) aventi come bersaglio i microRNA o in grado di riprodurre l’attività dei microRNA; (b) mimanti l'attività di siRNA e aventi come bersaglio precursori di RNA nucleare; (c) mimanti l’attività di siRNA e che hanno come bersaglio RNA maturi, inclusi mRNA virali, mRNA anti-apoptotici e mRNA che codificano per fattori di trascrizione. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Rosangela Marchelli Università degli Studi di PARMA

Obiettivo del Programma di Ricerca

L’obiettivo generale del presente progetto è quello di individuare molecole a base di PNA capaci di riconoscere specificatamente RNA come bersaglio molecolare sia per scopo diagnostico che terapeutico. Nel corso degli ultimi anni sono stati individuati i microRNA (miRNA), piccole molecole di RNA non codificante, coinvolti nella regolazione dell’espressione genica, che sono implicati nei processi di infezione virale, sono associati con l’oncogenesi e sono inibitori di apoptosi. E’ pertanto di particolare interesse inibire questi RNA o addirittura mimarne l’attività.

I PNA (acidi peptido nucleici) sono molecole ideali per riconoscere l’RNA, in quanto hanno una maggiore affinità per l’RNA che per il DNA, sono stabili chimicamente e sono resistenti alle nucleasi e alle proteasi.
Gli obiettivi specifici sono i seguenti:

OBIETTIVO 1. PROGETTAZIONE DEI PNA.

1.1 Individuazione dei requisiti sterici che fanno del PNA un ottimo agente di binding per l’RNA.
Mediante una progettazione basata sui dati strutturali e sulla modellistica molecolare di duplex PNA-RNA, ci si propone di individuare i requisiti strutturali e sterici per migliorare l’affinità e la selettività del PNA per l’RNA. La progettazione sarà eseguita dall’UO di Napoli con tecniche di "computer modelling" e di minimizzazione di energia utilizzando e/o sviluppando opportuni campi di forza "ab inizio”.

1.2 Selezione delle sequenze target di RNA e progettazione dei PNA
Saranno selezionate sequenze di mRNA e micro-RNA di interesse diagnostico e biomedico sulla base delle esperienze dell’Unità di Ferrara. Saranno quindi progettati PNA: (a) aventi come bersaglio i microRNA o in grado di riprodurre l’attività dei microRNA; (b) mimanti l'attività di siRNA e aventi come bersaglio precursori di RNA nucleare (bersagli: RNA non processato in modo corretto; RNA processato in modo alternativo); (c) mimanti l’attività siRNA e che hanno come bersaglio RNA maturi, inclusi mRNA virali, mRNA anti-apoptotici e mRNA codificanti per fattori di trascrizione.

OBIETTIVO 2. SINTESI DI NUOVI PNA

2.1 Modificazione dello scheletro del PNA.
Verranno realizzate specifiche modifiche dello scheletro del PNA, secondo diverse tipologie.
In particolare:
i) inserimento di centri stereogenici appropriati per ottimizzare le proprietà di binding all’RNA. Nuove strategie sintetiche (submonomeriche e non) su fase solida saranno utilizzate per la preparazione di PNA chirali, che salvaguardino la purezza ottica del composto, e che possano essere modulate a seconda delle condizioni acide o basiche utilizzate (UO Parma);
ii) variazione della catena pseudo-peptidica utilizzando monomeri a struttura idrazinoetilglicinica (hyd-PNA) e amminoetilazaglicinica (aza-PNA) per migliorare la solubilità e l’internalizzazione cellulare (UO Milano).

2.2 Modificazione delle nucleobasi.
Saranno inoltre valutate modifiche funzionali delle nucleobasi in modo che possano dare legami tipo Watson-Crick e tipo Hoogsteen al fine di aumentare la stabilità di binding, o contenenti gruppi funzionali catalitici per realizzare nuove “nucleasi artificiali” (UO Parma).

2.3 PNA coniugati.
I PNA saranno coniugati con altre molecole ai fini diagnostici o terapeutici. In particolare:
2.3.1 PNA coniugati a fluorofori (switch on probes) o a fluorofori e quenchers (Beacons) da utilizzare per la diagnostica sia biomedica che alimentare (norovirus)(UO Parma).
2.3.2 Monomeri ed oligomeri di PNA coniugati a complessi del renio, che possono fungere sia da sonde fluorescenti (applicazione in diagnostica) che da emettitori di radiazioni beta (applicazione in terapia)(UO Milano);
2.3.4 PNA coniugati con DNA e peptidi per ottenere reagenti da utilizzare in terapia genica, con migliori proprietà di interazione con le molecole bersaglio (proteine, RNA), di stabilità e di trasporto. I coniugati PNA-peptidi saranno sintetizzati utilizzando peptidi anfipatici per incrementare l'uptake cellulare di PNA. Per la sintesi dei coniugati di PNA, saranno testate due strategie: sintesi “on line” e assemblaggio di due frammenti sintetizzati separatamente (UO Napoli).


OBIETTIVO 3. VALUTAZIONE DELLE CAPACITA’ COMPLESSANTI DEI PNA

3.1 Le capacità complessanti dei nuovi PNA sintetizzati dall’Unità di Parma, dall'Unità di Milano e di Napoli per l' RNA a singolo e doppio filamento verranno valutate mediante spettrofotometria UV-Vis, dicroismo circolare, spettrometria di massa ESI, esperimenti di gel shift (Unità di Parma) e NMR (Unità di Napoli).

3.2 La caratterizzazione strutturale dei complessi PNA:RNA sarà eseguita allo stato solido effettuando esperimenti di cristallizzazione delle molecole di PNA e dei complessi PNA-DNA e PNA-RNA, in condizioni controllate di pH e di temperatura in vari sistemi tampone. Una volta ottenuti cristalli adatti, saranno eseguite raccolte di dati di diffrazione di raggi-X anche a bassa temperatura, utilizzando un diffrattometro anodo rotante con image plate (UO Napoli).


OBIETTIVO 4. APPLICAZIONI BIOMEDICHE

L’attività biologica dei PNA sarà valutata mediante sistemi cellulari disponibili presso l’Unità di Ferrara.
In particolare gli obiettivi specifici sono i seguenti:

4.1 valutare l’attività biologica di molecole basate sui PNA aventi come bersaglio i microRNA o che mimano l’attività dei microRNA coinvolti nel differenziamento eritroide o per inibire microRNA implicati nelle patologie tumorali;

4.2 valutare l’attività biologica delle molecole basate sui PNA sviluppate per mimare l’attività siRNA e aventi come bersaglio i precursori nucleari di RNA (preRNA con splicing aberrante o alternativo), per interferire e modificare lo splicing di RNA eucariotici. Lo scopo è quello di inibire selettivamente RNA prodotto da splicing aberrante in modo da incrementare la traduzione di mRNA maturati in modo corretto;

4.3 valutare l’attività di molecole basate sui PNA che mimano l’attività siRNA e che hanno come bersaglio mRNA maturi: a) mRNA virali; b) mRNA Runx-2, per alterare l’espressione del gene umano per il recettore degli estrogeni, al fine di diminuire il potenziale metastatico nel cancro al seno; c) mRNA anti-apoptotici per indurre l’apoptosi al fine di sviluppare nuove strategie terapeutiche nell’osteoporosi, artrite reumatoide e metastasi ossee.

OBIETTIVO 5. MESSA A PUNTO DI NUOVE PIATTAFORME DIAGNOSTICHE PER IL RICONOSCIMENTO DI SEQUENZE DI RNA.

5.1 Verranno sviluppate strategie per l'amplificazione isoterma dell'RNA per il riconoscimento di virus , in particolare virus alimentari (norovirus), o per studiare l'RNA proveniente da microorganismi patogeni, in modo da distinguere quelli ancora vitali (UO Parma).

5.2 Rivelazione di RNA mediante sonde a PNA.
In abbinamento con i metodi di amplificazione riportati al punto precedente, verranno prodotte sonde a PNA, che saranno utilizzate per la rivelazione di RNA in combinazione con le seguenti tecnologie: i) tecnologia microarray, disponibile presso l’UO di Parma; ii) sonde in grado di dare un segnale di fluorescenza per interazione con RNA complementare, in particolare “Light-Up probes” e PNA beacons (UO Parma).

5.3 Dispositivi microfluidici basati sulla SPRI (Surface Plasmon Resonance Imaging).
Saranno sviluppati nuovi metodi basati su SPRI utili alla rivelazione di target di RNA e microRNA (miRNA) mediante sonde a PNA. A tale scopo verranno utilizzati dispositivi microfluidici prodotti dalla UO di Catania e accoppiati a strategie basate su nanoparticelle per la rivelazione in parallelo di minime quantità di analita, anche al fine di rivelare RNA o DNA senza una preventiva amplificazione. <<<

Risultati parziali attesi

Questo progetto è molto innovativo rispetto allo stato dell’arte in quanto affronta temi nuovi di grande interesse sia a livello di conoscenze di base sia a livello applicativo.
Il riconoscimento dell’RNA , che è di grande attualità a livello biologico e biomedico, è stato scarsamente oggetto di studio da parte di Chimici, che si sono dedicati maggiormente allo studio del DNA.
Dalla ricerca qui proposta ci si attende quindi un grande avanzamento nel campo delle conoscenze di base sia per quanto riguarda l’individuazione delle caratteristiche strutturali che rendono i PNA capaci di legare selettivamente l’RNA o viceversa di comportarsi come l’RNA, sia a livello biologico per quanto attiene al ruolo di RNA in processi rilevanti a livello cellulare.
L’applicazione delle nuove molecole sintetizzate alla diagnostica e alla terapeutica biomedica appaiono molto promettenti per aprire nuovi settori di intervento potenzialmente anche a livello industriale, per la preparazione di nuovi kit diagnostici , per l’individuazione di nuove strategie terapeutiche e la proposta di nuovi farmaci.

In particolare, si possono prevedere i seguenti risultati :


1. OTTIMIZZAZIONE DEI PARAMETRI STRUTTURALI DEI PNA PER IL RICONOSCIMENTO DI RNA E INDIVIDUAZIONE DEI TARGET BIOLOGICI

1.1. Conoscenza delle caratteristiche strutturali dei PNA.
I dati strutturali e la modellistica molecolare permetteranno di individuare i requisiti strutturali e sterici per migliorare l’affinità e la selettività del PNA per l’RNA

1.2. Individuazione delle sequenze target di RNA.
L’individuazione delle sequenze di mRNA e micro-RNA di interesse diagnostico e biomedico permetterà di disegnare PNA adatti ad affrontare problematiche importanti quali: (a) riconoscimento selettivo di microRNA o riproduzione dell’attività dei microRNA; (b) competizione con l'attività di siRNA avendo come bersaglio precursori di RNA nucleare (bersagli: RNA non processato in modo corretto; RNA processato in modo alternativo); (c) competizione con l’ attività di siRNA avendo come bersaglio RNA maturi, inclusi mRNA virali, anti-apoptotici e mRNA per fattori di trascrizione.


2. DISPONIBILITÀ DI NUOVE MOLECOLE A BASE DI PNA PER LA DIAGNOSTICA E LA TERAPEUTICA
I risultati attesi riguardano la disponibilità di nuovi PNA biologicamente attivi nei riguardi di RNA.

2.1. PNA con scheletro modificato.
i) La disponibilità di PNA chirali aprirà nuove prospettive di carattere generale nel senso di proporre la chiralità come strumento e operatore di selettività, ad esempio per indurre elicità preferenziali che portino ad un riconoscimento selettivo di acidi nucleici naturali.
ii) L’individuazione di nuove strategie sintetiche (sub-monomeriche e non) su fase solida e in soluzione permetteranno di ottenere PNA chirali, salvaguardando la purezza ottica del composto, e saranno modulabili con opportuni gruppi protettori a seconda delle condizioni acide o basiche utilizzate.
iii)La disponibilità di monomeri a struttura idrazinoetilglicinica (hydPNA) e amminoetilazaglicinica (azaPNA) permetterà di migliorare la solubilità e l’internalizzazione cellulare dei PNA.

2.2. PNA con nucleobasi modificate.
La disponibilità di PNA con nucleobasi modificate in modo che possano dare non solo legami tipo Watson-Crick ma anche di tipo Hoogsteen permetterà di aumentare la stabilità di binding, o contenenti gruppi funzionali catalitici porteranno a realizzare nuove “nucleasi artificiali”.

2.3. PNA coniugati.
i) Disponibilità di PNA coniugati a fluorofori (switch on probes) o a fluorofori e quencher (beacons) da utilizzare per la diagnostica sia biomedica che alimentare (norovirus).
ii) Disponibilità di monomeri ed oligomeri di PNA coniugati a complessi di renio, che possono fungere sia da sonde fluorescenti (applicazione in diagnostica) che da emettitori di radiazioni beta (applicazione in terapia);
iii) Disponibilità di PNA coniugati con nanoparticelle magnetiche di ferro per applicazioni in diagnostica e terapia;
iv) Disponibilità di PNA coniugati con DNA e peptidi per ottenere reagenti da utilizzare in terapia genica, con migliori proprietà di interazione con le molecole bersaglio (proteine, RNA), di stabilità e di trasporto.

3. CONOSCENZA DELLE CAPACITA’ COMPLESSANTI DEI PNA
Le conoscenze delle capacità complessanti dei nuovi PNA sintetizzati per l' RNA a singolo e doppio filamento in soluzione e la caratterizzazione strutturale dei complessi PNA:RNA allo stato solido, ottenuta mediante esperimenti di cristallizzazione e di diffrazione di raggi-X permetteranno di modulare le caratteristiche strutturali migliori dei PNA (natura dello scheletro, nucleobasi, lunghezza, angoli di legame, ecc. ) e di adattarle al riconoscimento dei target biologici .


4. APPLICAZIONI BIOMEDICHE

4.1. Disponibiltà di molecole basate sui PNA capaci di legarsi ai microRNA o che mimino l’attività dei microRNA coinvolti nel differenziamento eritroide o per inibire microRNA implicati nelle patologie tumorali.

4.2. Disponibilità di molecole basate sui PNA che mimino l’attività siRNA e aventi come bersaglio i precursori di RNA nucleare (bersagli: RNA non processato in modo corretto; RNA multi-processato) per interferire e modificare lo splicing di RNA eucariotici. Il risultato atteso è quello di poter degradare selettivamente RNA prodotto da splicing aberrante in modo da incrementare la traduzione di mRNA maturati in modo corretto.

4.3. Disponibilità di molecole basate sui PNA che mimino l’attività siRNA e che abbiano come bersaglio mRNA maturi, inclusi a) mRNA virali; (b)m RNA Runx-2, per alterare l’espressione del gene umano per il recettore degli estrogeni, al fine di diminuire il potenziale metastatico nel cancro al seno; (c) m RNA anti-apoptotici per indurre l’apoptosi al fine di sviluppare nuove strategie terapeutiche nell’osteoporosi, artrite reumatoide e metastasi ossee.


5. IMPLEMENTAZIONE DI NUOVE PIATTAFORME DIAGNOSTICHE PER IL RICONOSCIMENTO DI RNA.

5.1 Disponibilità di un protocollo per l'amplificazione isoterma dell'RNA per il riconoscimento di virus a RNA, in particolare virus alimentari (norovirus), o di microorganismi patogeni, in modo da distinguere i vitali dai non vitali.

5.2 Implementazione di Piattaforme a base di sonde a PNA per la rivelazione di RNA, in particolare : i) tecnologia microarrays; ii) sonde in grado di dare un segnale di fluorescenza per interazione con RNA complementare, in particolare “Light Up probes” e PNA Beacons, da utilizzare per la diagnostica biomedica e alimentare.

5.3 Dispositivi microfluidici basati sulla SPRI (Surface Plasmon Resonance Imaging).La disponibilità di nuovi metodi basati sul Surface Plasmon Resonance Imaging utili alla rivelazione in parallelo dell’ibridazione di target di RNA e microRNA (miRNA) da parte di probe di PNA, capaci di trasportare minime quantità di specie reagenti e di arrivare eventualmente alla rivelazione di RNA (o DNA) senza una preventiva amplificazione. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Da quando la terapia genica non-virale è stata sviluppata e introdotta come metodo utile per modificare l'espressione genica, l'RNA è stato considerato come un bersaglio molecolare di notevole importanza. Le sequenze di mRNA che codificano per oncoproteine o per proteine anti-apoptotiche rappresentano esempi di sequenze bersaglio per applicazioni terapeutiche, come lo sviluppo di una terapia anti-cancro.
Nel corso degli ultimi anni i progressi della biologia molecolare hanno permesso l'individuazione di un numero elevato di geni che codificano per piccole molecole di RNA, i microRNA (miRNA), molecole di RNA non codificante in grado di regolare l'espressione genica a livello della traduzione [1]. A causa del loro importante ruolo, le sequenze di miRNA sono altamente conservate dal punto di vista evolutivo. Risultati recentemente pubblicati suggeriscono infatti che i genomi dei vertebrati codificano per non meno di 1000 differenti miRNA, che sembrerebbero coinvolti nella regolazione dell'espressione di almeno il 30% dei geni.
In virtù delle loro azioni specifiche, i miRNA hanno dimostrato di essere:
a) importanti per lo sviluppo, b) espressi in modo differente nei tessuti (ad esempio i miRNA-221-222 sono associati con l'eritropoiesi), c)coinvolti nei processi di infezioni virali, d) associati con l'oncogenesi, e) inibitori di apoptosi.
Come gli mRNA, i microRNA sono trascritti come regioni di RNA lunghe più di 1000 nucleotidi, in grado di creare strutture secondarie. Queste molecole di RNA vengono trasformate nel nucleo in RNA hairpin di 70-100 nucleotidi, ad opera di una ribonucleasi Drosha specifica per RNA a doppio filamento. Gli RNA harpin vengono trasportati al citoplasma mediante un meccanismo esportina-5 dipendente, dove vengono digeriti da una seconda ribonucleasi specifica per RNA a doppio filamento, chiamata Dicer. I miRNA ottenuti di 19-23 nucleotidi sono legati ad un complesso simile al RISC (Complesso silenziante RNA-indotto) che è coinvolto nel sistema RNA interference (RNAi). Negli animali i miRNA a singolo filamento si legano a specifici mRNA attraverso sequenze che sono significativamente, ma non totalmente, complementari al mRNA. Attraverso un meccanismo che non è stato ancora completamente descritto, gli mRNA legati non vengono tradotti, causando una ridotta espressione del gene corrispondente. Un meccanismo d'azione simile si verifica con le sequenze di small interfering RNA (siRNA). Comunque tra siRNA e miRNAs esistono alcune differenze, tra cui il fatto che i siRNA hanno un'origine esogena (RNA doppio filamento, virus, molecole di sintesi chimica) e che l'espressione genica viene inibita mediante la degradazione dell'RNA bersaglio.
Per queste ragioni risulta di particolare interesse lo sviluppo di molecole capaci di riconoscere specificatamente target a RNA sia per scopo diagnostico che terapeutico. Finora sono stati utilizzati oligonucleotidi sintetici o analoghi che presentano però controindicazioni per quanto riguarda la veicolazione e la stabilità alle nucleasi, mentre strutture basate sugli acidi peptido nucleici (PNA) non sono ancora state prese in considerazione.

ACIDI PEPTIDO NUCLEICI (PNA).
I PNA sono analoghi del DNA in cui lo scheletro zucchero-fosfato è stato sostituito con unità di N-(2-amminoetil)glicina [2]. Queste molecole sono in grado di ibridizzare efficacemente con DNA e RNA complementari, formando doppie eliche attraverso legami di Watson-Crick. Inoltre, i PNA formano triple eliche con DNA a doppio filamento e causano "strand invasion". Per questi motivi i PNA sono stati proposti nelle strategie antisenso e anti-gene in molti studi [3]. I PNA sono molto promettenti per il riconoscimento di RNA poiché possiedono una maggiore affinità per l'RNA rispetto ad analoghe sequenze di DNA, una maggiore specificità e risultano inoltre resistenti alle DNasi e proteasi.
Numerose modifiche allo scheletro del PNA sono state proposte per migliorarne l'affinità e la specificità di legame con il DNA[4].

PNA chirali.
I requisiti stereochimici che conferiscono ai PNA l’alta affinità di binding per il DNA sono stati molto studiati dall’Unità di Parma, mediante l'inserimento di centri stereogenici sul monomero sia in posizione C2 che C5 [5]. La stabilità del duplex DNA:PNA risulta dipendente dalla stereochimica: PNA contenenti un monomero con un centro stereogenico D- in posizione C2 legano il DNA complementare con un'affinità più alta rispetto al corrispondente PNA contenente un monomero con un centro stereogenico L- nella stessa posizione. L'affinità dei PNA chirali per DNA complementari appare quindi dovuta a diversi fattori: interazione elettrostatica, ingombro sterico ed enantioselettività. La prima struttura cristallina di un duplex PNA:DNA, nella quale erano presenti tre monomeri chirali adiacenti basati su 2D-lisina ("chiral box"), è stata ottenuta mediante diffrazione ai raggi X da una collaborazione tra l’Unità di Parma e di Napoli. Questa struttura mostra che l’eteroduplex chirale di PNA-DNA derivato dalla D-lisina adotta la cosiddetta conformazione di tipo elica P (P-helix), con parametri dell'elica significativamente diversi da quelli delle forme canoniche elicoidali assunte dal DNA. La P-helix è caratterizzata da un piccolo angolo di twist, un grosso valore del parametro di “x-displacement” e un solco maggiore profondo ed ampio [6]. I PNA "chiral box" costituiti da 2D-lisina presentano inoltre un'aumentata selettività di sequenza, sia in termini di controllo della direzione di binding che in termini di riconoscimento di mutazioni puntiformi; in particolare quest'ultima caratteristica ne fa uno strumento diagnostico potenzialmente interessante per rilevare singole mutazioni in geni di interesse biomedico ed alimentare. Recentemente è stato verificato dall’UO di Parma che lo stereocentro del monomero di PNA più vincolante per il riconoscimento del DNA è al carbonio in posizione 5 (configurazione preferenziale L) e che la miglior configurazione del PNA è ottenuta mediante l’inserimento di un monomero con due centri chirali nelle posizioni 2 (D) e 5 (L).
I requisiti sterici per un'ottimale complessazione dell'RNA non sono stati molto studiati finora .

Idrazinoetilglicina-PNA (hyd-PNA) e amminoetilazaglicina-PNA (aza-PNA). Altri PNA modificati con monomeri hyd-PNA e aza-PNA sono stati recentemente sintetizzati dall'UO di Milano [7]. Tali monomeri potrebbero fornire agli oligomeri peculiari proprietà chimico-fisiche, quali una migliore solubilità in acqua, e una ridotta perdita di entropia nella formazione del duplex, grazie ad una maggiore rigidità della catena.

PNA con basi modificate.
Sono stati inoltre descritti PNA con nucleobasi modificate, in grado di formare legami idrogeno sia di tipo Watson-Crick che Hoogsteen, migliorandone ulteriormente l'affinità di legame per il DNA [8].

PNA coniugati a complessi organometallici.
La coniugazione di biomolecole a complessi metallici trova interessanti applicazioni in campo diagnostico e terapeutico [9]. Alcuni gruppi di ricerca, fra cui l’ Unità di Milano, hanno riportato la sintesi e caratterizzazione di monomeri ed oligomeri di PNA legati a complessi organometallici di Fe, Ru, Tc, Re, Zn. Le peculiari caratteristiche elettroniche, spettroscopiche e nucleari di tali complessi metallici si sono rivelate estremamente promettenti soprattutto per un'applicazione in campo diagnostico. Tali studi indicano che la presenza di un metallo non pregiudica le capacità di riconoscimento, da parte del PNA, di filamenti di DNA complementare. La veicolazione selettiva sugli organi bersaglio di un complesso metallico che, oltre ad agire da sonda, permetta la localizzazione della molecola nei differenti comparti cellulari e sia in grado di svolgere anche un'attività farmacologica, è un obiettivo molto importante nelle applicazioni biomediche dei PNA.
Complessi dotati di queste caratteristiche sono soprattutto quelli con metalli di transizione che possiedono radionuclidi in grado di emettere radiazioni sfruttabili in medicina nucleare. Promettente per questo tipo di applicazioni è il renio, un metallo di transizione del VII gruppo, 2 isotopi beta-emettitori con proprietà fisiche che ben si prestano ad applicazioni in radioterapia. Inoltre, a causa dell'analogia di comportamento chimico e di biodistribuzione con il tecnezio, che ha un isotopo gamma emettitore (99mTc) molto usato in radioimaging, l'uso in terapia dei radioisotopi di renio risulta perfettamente complementare a quello in diagnostica del 99mTc. Il secondo aspetto di interesse riguarda l'uso di complessi di renio dotati di proprietà fotoemettitrici, che possano quindi fungere da sonde fluorescenti per visualizzare specifici processi biologici. I complessi di renio possono offrire vari vantaggi, grazie ad alcune caratteristiche della loro fotoemissione (lungo tempo di vita, emissione polarizzata, elevato shift di Stoke).

PNA coniugati a nanoparticelle magnetiche di ferro.
Le nanoparticelle magnetiche funzionalizzate con molecole organiche offrono un elevato potenziale per molte applicazioni in campo biomedico, targeting di geni, trasporto di farmaci, risonanza magnetica per immagini (MRI) e ipertermia. Singoli filamenti di DNA o oligonucleotidi immobilizzati su nanoparticelle magnetiche sono stati usati con successo per analisi di ibridizzazione di DNA per identificare organismi e per analisi di polimorfismo. Tuttavia un solo esempio di PNA supportato su nanoparticelle magnetiche è stato riportato [10]. Tali particelle hanno dimensioni comprese tra 5 e 100 nm e sono tipicamente costituite da un monocristallo di ossido di ferro. Le composizioni più comuni sono Fe3O4 (magnetite), nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetiche (SPIONs) particolarmente efficienti come sonde per MRI e per veicolare farmaci attraverso un campo magnetico esterno, e gamma-Fe2O3 (maghemite). Le SPIONs hanno
trovato applicazione in terapia e diagnostica, in quanto è possibile seguire il loro ingresso e la loro distribuzione in vivo e in vitro attraverso i metodi MRI. Infine, è stato dimostrato che tali particelle sono altamente biocompatibili, aumentando solo di poco il naturale deposito di ferro dell'organismo ospite. Quindi questi nanosistemi potrebbero essere usati per lo studio della localizzazione e internalizzazione di ligandi, per l'analisi della loro distribuzione e lo studio dei meccanismi d'azione dei bersagli macromolecolari.

PNA chimere.
Sono state dimostrate le possibili applicazioni dei PNA e delle chimere PNA-DNA nell'interferire con i fattori di trascrizione NF-kB e Sp1 [11]. A differenza dei PNA, le chimere PNA-DNA possono essere veicolate mediante l'impiego di liposomi e microsfere. Come i PNA, sono resistenti alle proteasi e DNasi e la loro resistenza alla degradazione enzimatica potrebbe essere aumentata ulteriormente mediante la formazione di complessi con i liposomi e le microsfere.

PIATTAFORME A PNA PER LA DETERMINAZIONE DI DNA
PNA-microarrays.
PNA microarrays sono già stati preparati legando covalentemente le sonde a PNA a superfici silicee opportunemante funzionalizzate. Questi PNA sono già stati utilizzati dall’UO di Parma soprattutto per la diagnostica in campo alimentare (rivelazione di DNA proveniente da GMO e da allergeni nascosti) [12].

PNA switch-on e PNA beacons.
Alcune sonde a PNA funzionalizzate con fluorofori che per interazione con il DNA complementare emettono un segnale di fluorescenza (light-up probes) sono state riportate in letteratura [13], come pure siono stati riportati PNA funzionalizzati con un fluoroforo ad un'estremità ed un gruppo spegnitore all'altra estremità, che si riaccendono in presenza di DNA complementare (PNA beacons) [14]. molecole di questo tipo non sono mai state utilizzate con RNA.

Surface Plasmon Resonance Imaging (SPRI)
L’SPR imaging [15] è recentemente emerso come metodo estremamente versatile per la rivelazione di interazioni con microarrays di biomolecole. Con questa tecnica sono state investigate interazioni con DNA, RNA, peptidi, proteine e carboidrati. Inoltre il suo accoppiamento con dispositivi microfluidici consente di operare secondo un approccio high-throughput, avendo anche la possibilità di far avvenire reazioni all’interfaccia solido-liquido in regioni spazialmente definite della superficie del sensore SPRI.
L’uso dell’SPRI per i saggi di genomica è limitato dalla ridotta sensibilità nella rivelazione della ibridazione di campioni di DNA o RNA. Un limite di rivelabilità di circa 1nM è in genere sufficiente per l’analisi di campioni amplificati con PCR, mentre un limite di rivelabilità di circa 1pM deve essere raggiunto per la rivelazione di DNA o RNA non amplificati. Facendo ricorso ad una varietà di strategie differenti, mirate ad amplificare la risposta SPRI conseguente alla reazione di ibridazione, si è recentemente dimostrato come sia possibile raggiungere i limiti summenzionati. In particolare, l’uso di nanoparticelle di oro (AuNPs) consente di migliorare la sensibilità dell’SPRI e di raggiungere limiti di rivelabilità dell’ordine del femtomolare (fM). E’ da sottolineare come con approcci simili sia stato possibile anche rivelare l’ibridazione di microRNAs facendo uso dell’SPRI [16].
Gli acidi peptido nucleici (PNA) sono in grado di migliorare la selettività e la sensibilità della ibridazione di sequenze di DNA e RNA complementari. Una varietà di biosensori basati su sonde di PNA sono già stati realizzati. La rivelazione delle ibridazioni con PNA è stata anche ottenuta facendo ricorso a metodi ottici basati sulla Surface Plasmon Resonance (SPR). L'SPR è in grado di monitorare variazioni causate dal flusso di oligonucleotidi complementari a sonde di PNA immobilizzate su superficie. In questo caso il limite di sensibilità nella rivelazione di campioni di DNA o RNA non amplificati è stato superato accoppiando l’SPR con tecniche elettrochimiche o ricorrendo ad una tecnica nota come Surface Plasmon Fluorescence Spectroscopy.
Solo recentemente una sonda PNA 15-mer è stata utilizzata per dimostrare un limite di sensibilità nell’ordine del pM nella rivelazione di ssDNA non amplificato. Il segnale SPRI è stato amplificato mediante l'ibridazione selettiva tra AuNPS modificate con il ssDNA target e la sonda a PNA.

[1] Berkhout B, Jeang KT, J Biol Chem, 2007, 282, 26641-26645.
[2] Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O, Science, 1991, 254, 1497-1500.
[3] Tonelli R, Purgato S, Camerin C, Fronza R, Bologna F, Alboresi S, Franzoni M, Corradini R, Sforza S, Faccini A, Shohet JM, Marchelli R, Pession A, Mol Cancer Ther, 2005, 4, 779-786.
[4] Corradini R, Sforza S, Tedeschi T, Totsingan F, Marchelli R, Curr Topics Med Chem, 2007, 7,681-694.
[5] Tedeschi T, Sforza S, Corradini R, Marchelli R, Tetrahedron Lett, 2005, 46, 8395-8399.
[6] Menchise V, De Simone G, Tedeschi T, Corradini R, Sforza S, Marchelli R, Capasso D, Saviano M, Pedone C, Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100,12021-12026.
[7] Cerea P, Giannini C, Dall'Angelo S, Licandro E, Maiorana S, Marchelli R, Tetrahedron, 2007, 63, 4108-4119.
[8]Ausin C, Ortega JA, Robles J, Grandas A, Pedroso E, Org Lett, 2002, 4, 4073-4075.
[9] Jaouen, G. "Biorganometallics:Biomolecules,Labeling, Medicine", 2006, Wiley-VCH, Weinheim.
[10] Wang F, Shen HB, Feng J, Yang HF, Microchimica Acta, 2006, 153, 15-20.
[11] Borgatti M, Lampronti I, Romanelli A, Pedone C, Saviano M, Bianchi N, Mischiati C, Gambari R, J Biol Chem, 2003, 278, 7500-7509.
[12]Germini A, Rossi S, Zanetti A, Corradini R, Fogher C, Marchelli R, J Agr Food Chem, 2005, 53, 3958-3962.
[13]Svanvik N, Westman G, Wang DY, Kubista M, Anal Biochem, 2000, 281, 26-35.
[14]Kuhn H, Demidov VV, Coull JM, Fiandaca MJ, Gildea BD, Frank-Kamenetskii MD, J Am Chem Soc, 2002, 124, 1097-1103.
[15] Rothenhäusler B, Knoll W, Nature, 1988, 332, 615-617.
[16] Fang S, Lee HJ, Wark AW, Corn, RM, J Am Chem Soc, 2006, 128, 14044-14046. <<<