RICERCA ITALIANA     

Rene policistico autosomico dominante: dalla clinica alla analisi cellulare e molecolare: approccio multidisciplinare di valutazione diagnostica e prognostica

Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia

Abstract

La malattia policistica autosomica dominante (ADPKD) è una malattia ereditaria monogenica relativamente frequente nella popolazione generale. La sua incidenza è variamente descritta in letteratura tra 1: 400 e 1 :1000 nati vivi. ADPKD è causata da mutazioni a carico dei geni PKD1 e PKD2 che rispettivamente codificano per le proteine transmembrana Policistina-1 e Policistina-2. Le mutazioni di PKD1 sono responsabili dell'85 % dei casi di ADPKD mentre quelle di PKD2 sono responsabili del resto dei casi.
Il progetto si propone di superare gli attuali limiti diagnostici e di definizione prognostica che la malattia ADPKD presenta. La diagnosi precoce dei soggetti affetti e la definizione della prognosi delle complicanze renali ed extrarenali costituiscono ancora un rilevante ostacolo nella gestione clinica di questi soggetti.

Diagnosi
Poiché la formazione delle cisti renali è un processo età dipendente, la diagnosi ecografica può produrre risultati falsi negativi in soggetti giovani. Alcune condizioni cliniche pongono indicazione ad una diagnosi precoce (prima della possibile visualizzazione delle cisti in ecografia) che attualmente può essere effettuata solo attraverso metodiche basate su un test del DNA. L'analisi molecolare per l'identificazione delle mutazioni soprattutto nel gene PKD1 è estremamente complessa sia per la struttura multi esonica, sia per le dimensioni del gene e soprattutto per la presenza dei sei pseudogeni ad elevata omologia per PKD1. Per l'impegno economico, i lunghi tempi di esecuzione ed una sensibilità diagnostica prossima all’85% è necessario sviluppare metodi diagnostici più efficienti. Il progetto prevede in questo senso due metodi diagnostici innovativi: analisi in RMN (Unità di Ricerca I) e valutazione dei flussi di Ca++ in linee cellulari (Unità di Ricerca III). Ciascuno dei due metodi diagnostici sarà messo a punto confrontandone i risultati con un Gold Standard costituito dalla diagnosi genetico molecolare fornita dall’Unità di Ricerca II. Verranno analizzate circa 70 famiglie ADPKD per la caratterizzazione molecolare nei probandi. Sulla base di questa analisi effettuata sul probando la diagnosi molecolare sarà rapidamente estesa ai rimanenti soggetti a rischio della famiglia. I soggetti a rischio risultati positivi o negativi alla indagine genetico molecolare saranno testati con RMN per quantificare il numero e la grandezza delle cisti riscontrate. Infine, per mezzo di un approccio statistico che si avvalerà delle 'Receive operator Curves' (ROC), si stabiliranno i migliori parametri diagnostici in termini di numero e caratteristiche delle cisti.
Con un approccio del tutto analogo gli stessi soggetti verranno sottoposti al test delle linee cellulari per la valutazione delle alterazioni dei flussi di Ca++. I dati archiviati saranno correlati alla diagnosi genetico molecolare fornita dall’unità di Ricerca II e statisticamente sarà valutata la capacità diagnostica di questo saggio. Sarà infine anche esplorato un eventuale utilizzo combinato dei due test che potrebbe portare ad un significativo aumento della performance diagnostica.

Prognosi
La prognosi in ADPKD è molto eterogenea e non prevedibile. La eterogeneità prognostica riguarda l’evolutività della patologia renale che può portare a diversi gradi di insufficienza renale con tempi di progressione molto variabili da soggetto a soggetto. Questo significa che alcuni soggetti affetti da ADPKD richiedono un trattamento sostitutivo della funzione renale con dialisi precocemente nella loro vita, mentre altri hanno una progressione della malattia molto più indolente e non sviluppano mai una insufficienza renale terminale. La stessa variabilità clinica riguarda anche il corteo sindromico di accompagnamento alle alterazioni renali. Infatti ADPKD è una malattia sistemica con interessamento di altri organi oltre al rene. In modo eterogeneo i pazienti sviluppano cisti epatiche, pancreatiche, spleniche, aneurismi cerebrali, ipertrofia cardiaca e valvulopatie. Non sono al momento disponibili studi che abbiano valutato le correlazioni genotipo fenotipo riguardanti le cisti epatiche o le complicanze di ordine cardiaco. Dal punto di vista clinico le alterazioni epatiche hanno un ruolo significativo tali da richiedere in alcuni casi una epatectomia parziale o un vero trapianto epatico. Anche le complicanze cardiache hanno una grande rilevanza clinica, e fenomeni di ipertrofia cardiaca e scompenso cardiaco costituiscono una significativa causa di mortalità in questi pazienti. Il nostro network potrà esplorare questi rapporti correlando gli elementi clinici raccolti nel reclutamento dei pazienti e la loro caratterizzazione genetico molecolare. Inoltre, sarà di grande interesse poter correlare i fenotipi clinici con le alterazioni dei flussi di Calcio nelle LCLs (Unità di ricerca III) ed ancora delle funzioni cellulari e delle vie cellulari valutate in linee cellulari autologhe ed eterologhe con metodologie sviluppate dall’Unità di Ricerca II. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Riccardo Magistroni Università degli Studi di MODENA e REGGIO EMILIA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il progetto si propone di superare gli attuali limiti diagnostici e di definizione prognostica che la malattia ADPKD presenta. La diagnosi precoce dei soggetti affetti e la definizione della prognosi delle complicanze renali ed extrarenali costituiscono ancora un rilevante ostacolo nella gestione clinica di questi soggetti (vedi stato dell’arte).
Si considera prerequisito essenziale nel raggiungimento degli obiettivi la costituzione di un registro di patologia. Tale archivio è funzionale alla raccolta di tutti i dati clinici e molecolari che costituiranno la base dati necessaria alle elaborazioni da cui scaturiranno i successivi risultati attesi.
Sulla base dei dati raccolti in modo elettronico e centralizzato verranno elaborati i dati per la definizione di nuovi strumenti diagnostici e di definizione prognostica.
Infine, come obiettivo aggiuntivo e di secondo livello, l’analisi molecolare delle vie cellulari alterate dalla mutazione genetica aprirà nuove prospettive di ricerca e permetterà la formulazione di nuove ipotesi patogenetiche.

REGISTRO NAZIONALE ADPKD

L’Unità di Ricerca I svilupperà per mezzo di risorse esterne una base dati aggiornabile e consultabile da tutti i gruppi di ricerca attraverso una interfaccia WEB. Il sito sarà accessibile per mezzo di parola chiave per assicurare ai pazienti arruolati la necessaria protezione dei dati sensibili. Sarà comunque richiesta preventivamente una autorizzazione alla loro archiviazione in ottemperanza alla attuale legislatura relativa alla ‘Privacy’. La base dati elettronica sarà compilata dai ricercatori inserendo i dati clinici, radiologici e molecolari che ciascun gruppo progressivamente produrrà. Infine, i dati saranno periodicamente estratti dall’archivio e saranno disponibili per le analisi ad interim ed a conclusione dello studio.
Il registro, che avrà un ruolo essenziale come strumento di raccolta dati funzionale al progetto, al termine dello stesso potrà essere utilizzato in forma modificata e ridotta come Registro Nazionale ADPKD per la raccolta dati e monitoraggio della patologia su scala nazionale. Il registro, oltre ad un interesse epidemiologico, potrebbe essere un importante strumento clinico. Questa complessa patologia genetica richiede infatti per una sua efficacie gestione un approccio multidisciplinare con convergenza di dati clinici, radiologici e molecolari.

DIAGNOSI
Dal punto di vista diagnostico l’attuale stato dell’arte nell’identificazione dei soggetti affetti si avvale dell’indagine ecografica e in casi selezionati di un test del DNA. I due approcci presentano delle limitazioni importanti (vedi stato dell’arte) che ci proponiamo di superare sviluppando nuovi approcci di diagnosi. Il progetto prevede in questo senso due metodi diagnostici innovativi: analisi in RMN (Unità di Ricerca I) e valutazione dei flussi di Ca++ in linee cellulari (Unità di Ricerca III). Ciascuno dei due metodi diagnostici sarà messo a punto confrontandone i risultati con un Gold Standard costituito dalla diagnosi genetico molecolare fornita dall’Unità di Ricerca II. Verranno analizzate circa 70 famiglie ADPKD per la caratterizzazione molecolare nei probandi. Sulla base di questa analisi effettuata sul probando la diagnosi molecolare sarà rapidamente estesa ai rimanenti soggetti a rischio della famiglia. I soggetti a rischio risultati positivi o negativi alla indagine genetico molecolare saranno testati con RMN per quantificare il numero e la grandezza delle cisti riscontrate. Infine, per mezzo di un approccio statistico che si avvarrà delle ‘Receiver Operator Curves’ (ROC), si stabiliranno i migliori parametri diagnostici in termini di numero e caratteristiche delle cisti.
Con un approccio del tutto analogo gli stessi soggetti verranno sottoposti al test delle linee cellulari per la valutazione delle alterazioni dei flussi di Ca++. I dati archiviati saranno correlati alla diagnosi genetico molecolare fornita dall’unità di Ricerca II e sarà valutata statisticamente la capacità diagnostica di questo saggio. Sarà infine anche esplorato un eventuale utilizzo combinato dei due test che potrebbe portare ad un significativo aumento della performance diagnostica.

PROGNOSI
Nel registro ADPKD saranno archiviati tutti i dati clinici relativi alla funzionalità renale, alle complicanze extrarenali, i dati molecolari di flusso di Ca++, le altre analisi funzionali di mutazione come alterazioni nelle vie cellulari. I dati verranno analizzati e correlati per verificare quali implicazioni prognostiche rivestono. In particolare, di significativo interesse sarà la correlazione tra la patologia cistica epatica e le alterazioni molecolari. Questo rapporto infatti non è ancora stato significativamente esplorato pur costituendo un elemento clinico rilevante in una quota di pazienti ADPKD. Ancora poco esplorato, ma di notevole interesse clinico, è il rapporto genotipo-alterazione molecolare cellulare-fenotipo che riguarda le complicanze di carattere cardio-vascolare. La definizione di correlazioni tra particolari alterazioni molecolari e fenotipi patologici permetterà di creare un modello prognostico. Una prognosi accurata è essenziale per una migliore definizione del rischio di complicanze di questi pazienti e quindi per un migliore monitoraggio.

Infine, la individuazione delle correlazioni tra genotipo e alterazioni nelle vie cellulari, esplorate principalmente dall’unità di ricerca II, costituirà una opportunità di grande interesse per la definizione di nuovi modelli patogenetici. Dalla caratterizzazione molecolare delle vie cellulari coinvolte nelle singole mutazioni della casistica ADPKD potranno scaturire conoscenze di interesse scientifico e di possibile applicazione anche terapeutica. <<<

Risultati parziali attesi

Il progetto ha come finalità principali la definizione di nuovi strumenti diagnostici e la definizione di un nuovo modello prognostico. Come obiettivo di secondo livello le caratterizzazioni funzionali e molecolari possono suggerire nuovi modelli patogenetici che a loro volta possono essere lo spunto di nuove applicazioni diagnostiche, prognostiche o terapeutiche.

Obiettivo diagnostico
Il progetto prevede di testare due nuovi approcci diagnostici: il primo di tipo radiodiagnostico si avvale della maggiore sensibilità nella individuazione delle cisti determinato dalle tecniche RMN; il secondo si avvale dello studio funzionale dei flussi Ca++ nelle LCLs dei pazienti. Preliminarmente ogni paziente reclutato in questa parte dello studio sarà caratterizzato attraverso il test Gold Standard che è costituito dall’analisi genetico molecolare di ricerca della mutazione sui geni PKD1 e PKD2. Per mezzo dell’approccio statistico basato sulle ROC si definiranno i migliori parametri diagnostici di questi due nuovi metodi. Il risultato finale dello studio sarà quello di avere sviluppato dei sistemi diagnostici innovativi che supereranno alcuni dei limiti attuali nel processo diagnostico. In particolare, i nuovi test supereranno in sensibilità l’approccio ecografico che come noto ha una scarsa capacità discriminativa nelle fasce di età più giovani in cui le cisti possono essere ancora poche e di piccole dimensioni per essere colte. I nuovi test saranno preferibili al test genetico in quanto di più semplice e rapida esecuzione. Questi due nuovi test potrebbero porsi in una posizione intermedia tra lo screening di primo livello costituito dalla indagine ecografica e quello di ultimo livello costituito dal gold standard del test del DNA. In particolare, il test basato sull’analisi dei canali al Ca++ si presta ad uno sviluppo con tecniche automatizzate ed ad una brevettabilità per sfruttamento industriale.

Obiettivo prognostico
I dati clinici riguardanti le complicanze renali ed extrarenali saranno raccolte nella base dati centralizzata. Alla stessa risorsa elettronica convergeranno tutti i dati di tipo molecolare. Sarà qundi possibile correlare la presenza di complicanze e la severità di tali complicanze con la natura delle alterazioni molecolari caratterizzate dalle Unità di Ricerca II e III. Questo consentirà di individuare, qualora esistano, delle alterazioni molecolari in grado di influenzare evoluzione e morbidità della malattia. Tra le condizioni più interessanti in quanto ancora inesplorate si deve segnalare la possibile relazione tra patologia cistica epatica e alterazioni molecolari. Ancora scarsamente note sono le possibili correlazioni tra alterazioni genetico molecolari e fenotipi patologici cardiaci (valvulopatie, ipertrofia cardiaca). Altre condizioni che verificheremo e che sono già state parzialmente valutate in precedenza sono la rapidità di evoluzione di insufficienza renale ed il rischio di aneurismi cerebrali. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La malattia policistica autosomica dominante (ADPKD) è una malattia ereditaria monogenica piuttosto frequente nella popolazione generale. La frequenza di ADPKD non è trascurabile se si considera che è più comune della malattia di Huntington, dell'emofilia, dell'anemia falciforme, della fibrosi cistica, della distrofia muscolare, e della sindrome di Down messe insieme. La sua incidenza è variamente descritta in letteratura (tra 1: 400 e 1 :1000 nati vivi) e si stima che vi siano 12 milioni di soggetti affetti al mondo.
ADPKD è causata da mutazioni a carico dei geni PKD1 e PKD2 che codificano rispettivamente per le proteine transmembrana Policistina-1 e Policistina-2. Le mutazioni di PKD1 sono responsabili dell'85 % dei casi di ADPKD mentre quelle di PKD2 sono responsabili del resto dei casi. Sebbene le manifestazioni cliniche nelle due forme siano sovrapponibili, i pazienti con mutazioni a carico di PKD2 presentano i sintomi più tardivamente e hanno mediamente una progressione verso l'insufficienza renale più lenta con una sopravvivenza renale più lunga (in media 69 anni) rispetto ai pazienti con mutazioni di PKD1 (in media 53 anni). ADPKD inoltre è una malattia sistemica perché altri organi come il fegato, il pancreas e il sistema cardiovascolare sono spesso compromessi.
Nonostante nell’ultimo decennio il progresso scientifico riguardante le malattie renali cistiche sia stato notevole rispetto ad altri campi della ricerca nefrologica, la gestione clinica di questa condizione presenta ancora significativi ostacoli. Questi coinvolgono l’aspetto diagnostico, quello prognostico ed infine quello terapeutico. In questo progetto abbiamo sviluppato un network collaborativo che si pone lo scopo di portare alla risoluzione di alcuni di questi problemi e verosimilmente di suggerire nuovi indirizzi di ricerca.

DIAGNOSI
Dal punto di vista diagnostico la patologia viene individuata sulla base della raccolta della storia familiare e per mezzo del risultato di una indagine ecografica renale che può mettere in evidenza la presenza delle cisti. Poiché la formazione delle cisti renali è un processo età dipendente, la diagnosi ecografica può produrre risultati falsi negativi in soggetti giovani.
Alcune condizioni cliniche pongono indicazione ad una diagnosi precoce (prima della possibile visualizzazione delle cisti in ecografia) che attualmente può essere effettuata solo attraverso metodiche basate su un test del DNA. Il test molecolare viene eseguito: i) per confermare la diagnosi clinica quando esiste un margine di incertezza; ii) per eseguire una diagnosi pre-sintomatica, quando i dati di imaging non sono risolutivi, o quando è richiesta l'esclusione, ad esempio, in un soggetto relato al paziente e potenziale donatore di rene. iii) Infine potrebbe avere un ruolo nell’individuazione preclinica di soggetti affetti per una terapia precoce; dati preliminari suggeriscono che nuove terapie, ancora in sperimentazione, in grado di rallentare l'espansione delle cisti renali potrebbero essere maggiormente efficaci se iniziate precocemente. La diagnosi pre-natale o la diagnosi pre-impianto non sono richieste spesso in quanto la patologia si presenta solitamente nell'età adulta ed ha una penetranza variabile. La ADPKD è trasmessa come carattere autosomico dominante, e pertanto ogni soggetto affetto ha una probabilità del 50% di trasmettere la mutazione ai propri figli. La maggior parte degli individui affetti ha uno dei genitori con ADPKD, ma in circa il 10% dei pazienti la mutazione è insorta de novo. ADPKD è prevalentemente associata a mutazioni in PKD1 (85%) e più raramente in PKD2 (15%). E' riportato che l'analisi molecolare mediante sequenziamento diretto ha una sensibilità dell'85% circa. Attualmente sono note circa 340 mutazioni in PKD1 e PKD2. Poiché la maggior parte delle mutazioni sono uniche, e circa un terzo delle mutazioni di PKD1 sono cambiamenti aminoacidici, non è sempre facile dimostrarne la patogenicità. Esiste una chiara correlazione tra la severità della malattia renale e il gene coinvolto (PKD1 o PKD2). Soggetti con mutazione in PKD1 mostrano una età più precoce alla diagnosi e dell'inizio della dialisi. L'analisi molecolare per l'identificazione delle mutazioni soprattutto nel gene PKD1 è estremamente complessa sia per la struttura multi esonica, sia per le dimensioni del gene e soprattutto per la presenza di sei pseudogeni ad elevata omologia per PKD1. Per l'impegno economico, i lunghi tempi di esecuzione ed una sensibilità diagnostica prossima al 85% è necessario sviluppare metodi diagnostici più efficienti rispetto al test del DNA.
Le limitazioni diagnostiche insite nell’approccio ecografico e genetico molecolare saranno affrontate in due sezioni del progetto riguardanti la validazione di tecniche radiodiagnostiche innovative e saggi cellulari.

La risonanza magnetica nella diagnosi di ADPKD. Un’alternativa diagnostica interessante riguarda l'utilizzo di tecniche per immagini più sensibili quali la risonanza magnetica nucleare (RMN). Negli ultimi anni tale indagine è stata fortemente implementata nei protocolli di studio di ADPKD. In questi approcci l'uso della RMN ha avuto principalmente il ruolo di quantificazione dell'aumento volumetrico dei reni per mezzo di valutazioni sequenziali a distanza di 6 , 12 o più mesi. Lo scopo di questi approcci non era perciò di tipo diagnostico, quanto piuttosto mirato ad ottenere un outcome derivato che potesse cogliere l' evolutività della patologia (rapidità di aumento volumetrico del rene). Infatti, questi studi hanno ricavato una buona correlazione tra velocità di incremento del volume renale e progressione della perdita di funzione renale. Nessuna di queste ricerche ha invece indagato la potenzialità della RMN in senso puramente diagnostico. Da questo punto di vista la capacità di questo mezzo di evidenziare lesioni cistiche di diametro inferiore rispetto alle tecniche ecografiche lo rende uno strumento più sensibile ed adatto alla diagnosi precoce. La possibilità dell'unità di ricerca di poter collaborare con gli altri partecipanti a questo progetto permetterà di condividere le informazioni di carattere clinico e radiologico con quelle genetico molecolari che costituiscono attualmente il gold standard diagnostico. In questo modo sarà possibile definire correttamente sotto il profilo metodologico i migliori criteri diagnostici per ADPKD in risonanza magnetica e quindi utilizzare questo potente mezzo nella pratica diagnostica routinaria.

Canali al Calcio ed ADPKD. Negli ultimi dieci anni sono stati identificati più di 60 geni le cui mutazioni causano malattie da alterato funzionamento di canali ionici e la ADPKD è una di queste. E’ oramai opinione condivisa che Policistina 1, un recettore accoppiato a proteine G , può regolare l'attività del canale Ca2+ Policistina 2. Questo complesso recettore/canale forma il cuore di una via del segnale che utilizza il Ca2+ come secondo messaggero . L’osservazione non è valida solo per le cellule epiteliali tubulari, ma anche per cellule non epiteliali. Tuttavia, non sono ancora stati identificati con certezza i meccanismi di attivazione né gli effettori a valle di questo segnale calcio. In particolare, rimane ancora indefinito come la perdita di funzione di Policistina 1 o Policistina 2 nella ADPKD provochi alterazione dell'omeostasi intracellulare del Ca2+, a cui consegue aumento della proliferazione ed apoptosi, sia delle cellule dell'epitelio cistico che di altri tessuti come quello vascolare . La ADPKD è infatti una malattia sistemica con alterazioni presenti in vari tipi cellulari. Difetti dell'espressione dei geni PKD sono stati identificati anche in cellule del sangue ed in linee linfoblastoidi (LCLs) ottenute da pazienti ADPKD, candidandole come un modello utile per lo studio della malattia. Nelle LCLs è già stato esaminato il segnale del Ca2+ per studiare le basi patofisiologiche di comuni malattie come l'ipertensione, il Diabete mellito, la malattia di Alzheimer e la malattia di Huntington. In uno studio condotto dall’Unità di Ricerca III su LCLs ottenute da soggetti ADPKD con mutazioni di PKD1 e di PKD2 sono stati dimostrati difetti del Ca2+ citoplasmatico compatibili con l'alterazione del canale Policistina 1/Policistina 2. La riduzione del Ca2+ citoplasmatico è in accordo col concetto della aploinsufficienza dei geni PKD, già osservata in varie cellule e animali. E' presumibile che il rapporto tra alterazioni quantitative e/o funzionali di Policistina 1 e di Policistina 2, che sono state documentate anche dall’Unità di Ricerca III in vari modelli cellulari renali, possa essere evidenziato nelle LCLs PKD non solo come variazioni quantitative del [Ca2+]i evocato da PAF, ma anche come variazioni qualitative in termini di oscillazioni del Ca2+ (Ca2+Os).
Le LCLs, facilmente ottenibili dai linfociti di pazienti ADPKD, possono quindi rappresentare un idoneo modello sia per l'analisi dell'omeostasi del calcio che come marker della malattia.

PROGNOSI
La prognosi in ADPKD è molto eterogenea e non prevedibile. La eterogeneità prognostica riguarda l’evolutività della patologia renale che può portare a diversi gradi di insufficienza renale con tempi di progressione molto variabili da soggetto a soggetto. Questo significa che alcuni soggetti affetti da ADPKD richiedono un trattamento sostitutivo della funzione renale con dialisi precocemente nella loro vita, mentre altri hanno una progressione della malattia molto più indolente e non sviluppano mai una insufficienza renale terminale. La stessa variabilità clinica riguarda anche il corteo sindromico di accompagnamento alle alterazioni renali. Come infatti è già stato segnalato, ADPKD è una malattia sistemica con interessamento di altri organi oltre al rene. In modo eterogeneo i pazienti sviluppano cisti epatiche, pancreatiche, spleniche, aneurismi cerebrali, ipertrofia cardiaca e valvulopatie.

Mutazioni e fenotipo clinico. Riguardo alla eterogeneità della progressione renale è chiaro che i pazienti affetti da mutazioni di PKD1 hanno forme più gravi dei pazienti PKD2. Inoltre, sembra che i pazienti con mutazioni determinanti interruzioni di traduzione precoci di PKD1 abbiano malattie renali lievemente più evolutive rispettto ai casi in cui porzioni più ampie di Policistica 1 sono conservate. Questo non è stato dimostrato per PKD2 ed in ogni caso anche per PKD1 l’effetto rilevato è di scarso impatto clinico. Esistono modificatori del comportamento evolutivo renale non ancora identificati. Si suppone che vi siano altri geni, detti geni modificatori, e quindi altri cofattori proteici espressi da questi geni modificatori in grado di giustificare questa variabilità. Allo stesso modo è stato supposto che mutazioni non senso con interruzione precoce della traduzione della Policistina 1 determinino dei fenotipi clinici vascolari più gravi. Non sono al momento disponibili studi che abbiano valutato le correlazioni genotipo fenotipo riguardanti le cisti epatiche o le complicanze di ordine cardiaco. Dal punto di vista clinico le alterazioni epatiche hanno un ruolo significativo, infatti, sebbene non frequentemente, alcune alterazioni epatiche assumono una tale rilevanza da richiedere una epatectomia parziale ed in alcuni casi un vero trapianto epatico. Anche le complicanze cardiache hanno una grande rilevanza clinica, e fenomeni di ipertrofia cardiaca e scompenso cardiaco costituiscono una significativa causa di mortalità in questi pazienti. Il nostro network potrà esplorare questi rapporti correlando gli elementi clinici raccolti nel reclutamento dei pazienti e la loro caratterizzazione genetico molecolare. Inoltre, sarà di grande interesse poter correlare i fenotipi clinici con le alterazioni dei flussi di Calcio nelle LCLs ed ancora delle vie cellulari .
Mutazioni e fenotipo cellulare. Accanto all’analisi della funzione dei geni endogeni mutati come segnale Calcio nelle LCLs, le forme mutanti del gene PKD1 verranno espresse in un sistema eterologo tramite trasfezione transiente o stabile in diversi tipi cellulari (MDCK, MEFs Pkd1-/-, Hek293, NIH3T3) e la funzione dei mutanti verrà confrontata a quella della proteina wild-type. In particolare, il gruppo di ricerca II analizzerà: 1) ciclo cellulare (incorporazione di Brdu, cell cycle profile); 2) resistenza all'apoptosi (saggio TUNEL e colorazione con anti-caspasi-3 attiva); capacità di formare tubuli in gel tridimensionali di collagene; 4) dimensioni delle cellule e stato di attivazione della cascata mTOR/p70S6K/S6Rp; 5) effetto sul citoscheletro di actina e sulla migrazione cellulare; 6) capacità di regolare le cascate PI3k/Akt e beta-catenina. I risultati ottenuti ci permetteranno di verificare quali mutazioni missenso di pazienti alterano quali processi biologici. Infine, la alterazione dei processi biologici sarà correlato alle caratteristiche cliniche dei pazienti verificando in quale rapporto le manifestazioni renali ed extrarenali si associano alle funzioni cellulari esplorate. <<<