RICERCA ITALIANA     

Gli Herpesvirus e i processi infiammatori dell'endotelio: meccanismi molecolari e strategie terapeutiche innovative

Università degli Studi di Roma "Tor Vergata"

Abstract

Gli Herpesvirus rappresentano una classe di patogeni ampiamente diffusi e responsabili di vari tipi di malattie caratterizzate da una forte componente infiammatoria. Oltre alle patologie classiche, e’ stato ipotizzato che l'infezione di cellule endoteliali (CE) con alcuni Herpesvirus possa essere coinvolta nella patogenesi di malattie vascolari tra cui l'aterosclerosi. In particolare, e’ stato suggerito che la presenza di questi agenti patogeni possa indurre una reazione infiammatoria associata a processi degenerativi, iperproliferazione ed aumento dell'adesione di neutrofili e piastrine all’endotelio infetto. Tuttavia il ruolo degli Herpesvirus nella patologia vascolare non è stato ancora definito, e non sono stati individuati i meccanismi molecolari attraverso cui l’infezione virale promuove l’infiammazione a livello endoteliale e causa rimodellamenti vascolari.
Nell’ambito del finanziamento di un precedente PRIN, e’ stato costituito un gruppo di ricerca per verificare se le cellule endoteliali siano dei possibili bersagli per le infezioni da Herpesvirus, e se l’infezione virale possa indurre fenomeni infiammatori. I risultati ottenuti in seguito alla interazione e collaborazione fra i gruppi hanno confermato che le CE sono target di infezione virale persistente e cronica. Inoltre è stato dimostrato che gli Herpesvirus inducono l’attivazione del fattore nucleare pro-infiammatorio NF-kB e la secrezione di un pattern di citochine e chemochine specifico a seconda del tipo di virus e della cellula infettata. Nel complesso i risultati ottenuti confermano l’ipotesi che gli Herpesvirus siano coinvolti nella patologia infiammatoria dell’endotelio, e sottolineano l’importanza di chiarire i meccanismi molecolari alla base di questi processi per individuare strategie innovative per la terapia delle malattie vascolari.
Sulla base di queste premesse, il presente progetto si propone di approfondire lo studio degli effetti dell’infezione da Herpesvirus sull’attivazione della risposta infiammatoria in cellule endoteliali di varia origine e di caratterizzare i meccanismi molecolari coinvolti, con il duplice obiettivo di far luce sul ruolo dell’infezione erpetica nelle patologie infiammatorie dell’endotelio e di identificare nuovi bersagli terapeutici per malattie vascolari.
Il programma e’ articolato in 4 fasi principali, che includono:
Fase 1. Preparazione di colture di endotelio microvascolare e macrovascolare ematico da diversi organi.
Fase 2. Caratterizzazione delle alterazioni fenotipiche e biochimiche indotte dall’infezione erpetica in cellule endoteliali.
Fase 3. Caratterizzazione dei meccanismi molecolari coinvolti nell’attivazione del processo infiammatorio associato all’infezione erpetica dell’endotelio.
Fase 4. Effetto della modulazione farmacologia di NF-kB sulla replicazione dei virus erpetici e sull’attivazione della risposta infiammatoria indotta dall’infezione virale.
Il piano secondo cui verra’ svolta la sperimentazione proposta e’ schematizzato nel diagramma riportato in seguito.



Dal punto di vista operativo, verranno allestite colture primarie di CE purificate da diversi organi e tessuti, incluso il tessuto linfatico. Le colture di CE verranno infettate con alcuni virus erpetici (HCMV, HHV-6, HHV-8, HSV-1), ed analizzate per diversi parametri, tra cui l’attivazione di chinasi cellulari, la stimolazione della trasduzione del segnale infiammatorio e di sopravvivenza, l’espressione di molecole di adesione, la secrezione di citochine e chemiochine proinfiammatorie, la capacità proliferativa e l’apoptosi. Particolare attenzione sarà dedicata all’analisi del sistema IKK/NF-kB, in quanto è stato suggerito che l’alterazione virus-indotta del meccanismo autoregolatorio di NF-kB contribuisca al cambiamento del pattern di espressione genica che si verifica in situazioni patologiche e durante l’aterogenesi. Verrà inoltre studiato l’effetto di prostanoidi ciclopentenonici e di altri inibitori sintetici del complesso chinasico IKK e di NF-kB sulla replicazione virale e sull’attivazione dei processi infiammatori virus-indotti.
I risultati ottenuti contribuiranno ad approfondire le conoscenze sui meccanismi molecolari alla base dei processi infiammatori associati alle infezioni da Herpesvirus in CE, e daranno informazioni utili sia per lo sviluppo di strategie innovative per la terapia delle malattie vascolari, che per la ricerca di nuovi bersagli cellulari per farmaci antivirali. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Maria Gabriella Santoro Università degli Studi di ROMA "Tor Vergata"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Alcune infezioni virali a carico dell’endotelio sono state implicate nell’eziopatogenesi di malattie vascolari sia degenerative che proliferative. In particolare, e’ stato suggerito che alcuni Herpesvirus possano infettare cellule endoteliali (CE), innescando e/o accelerando i processi aterosclerotici attraverso l’attivazione di un processo infiammatorio. Tuttavia il ruolo degli Herpesvirus nella patologia vascolare non è stato ancora definito, e non sono stati individuati i meccanismi molecolari attraverso cui l’infezione virale promuove l’infiammazione a livello endoteliale e causa rimodellamenti vascolari. Nell’ambito del finanziamento di un precedente PRIN, e’ stato costituito un gruppo di ricerca per verificare se le cellule endoteliali siano dei possibili bersagli per le infezioni da Herpesvirus, e se l’infezione virale possa indurre fenomeni infiammatori. I risultati ottenuti in seguito alla interazione e collaborazione fra i gruppi hanno confermato che le CE sono target di infezione virale persistente e cronica. Inoltre è stato dimostrato che gli Herpesvirus inducono l’attivazione del fattore nucleare pro-infiammatorio NF-kB e la secrezione di un pattern di citochine e chemochine specifico a seconda del tipo di virus e della cellula infettata. Nel complesso i risultati ottenuti confermano l’ipotesi che gli Herpesvirus siano coinvolti nella patologia infiammatoria dell’endotelio, contribuendo ad innescare o accelerare un processo aterosclerotico.
Sulla base di queste premesse, il presente progetto si propone di approfondire lo studio degli effetti dell’infezione da Herpesvirus sull’attivazione della risposta infiammatoria in cellule endoteliali di varia origine e di caratterizzare i meccanismi molecolari coinvolti, con il duplice obiettivo di far luce sul ruolo dell’infezione erpetica nelle patologie infiammatorie dell’endotelio e di identificare nuovi bersagli terapeutici per malattie vascolari.
Gli obiettivi principali includono:
Obiettivo 1. SVILUPPO DI UNA BANCA DI COLTURE DI ENDOTELIO EMATICO E LINFATICO OTTENUTO DA DIVERSI TESSUTI ED ORGANI (Unita’ III).
Il progetto prevede la disponibilità di colture di cellule endoteliali umane primarie di diversa origine tissutale, che verranno utilizzate per le ricerche proposte dalle UO afferenti.
Per la produzione ed espansione di colture di CE di differente derivazione verranno utilizzati campioni di tessuto vascolare umano provenienti da diversi organi (cuore, derma, fegato, surrene). Una volta ottenuti campioni derivati da uno stesso distretto anatomico di pazienti diversi, si prevede anche di poter creare pools di CE omologhe, in modo da permettere ai diversi gruppi di ricerca di affrontare i diversi aspetti legati all’interazione virus/CE sugli stessi campioni cellulari. Verranno inoltre predisposte colture di cellule endoteliali linfatiche, utilizzando per la selezione il recettore per il VEGF-C (VEGFR-3).

Obiettivo 2. CARATTERIZZAZIONE DELLE ALTERAZIONI FENOTIPICHE E BIOCHIMICHE INDOTTE DALL'INFEZIONE ERPETICA IN CELLULE ENDOTELIALI (Unita’ I, II,III e IV).
L’effetto dell’infezione con Herpesvirus umani endoteliotropici (HCMV, HSV-1, HHV-6 o HHV-8) verrà valutato su colture di CE di diversa origine tissutale, focalizzando l’attenzione principalmente su aspetti molecolari dell’infiammazione e proangiogenetici. Gli obiettivi specifici sono differenziati per i diversi virus erpetici e sono riassunti nei seguenti punti:
2.1. Caratterizzazione dell’effetto dell’infezione con HSV-1, HHV-6 e HHV-8 sull’espressione di geni pro-infiammatori ed anti-apoptotici NF-kB-dipendenti e sul metabolismo del colesterolo in CE e monociti umani.
2.2. Dimostrazione dell’induzione dell’immunità innata in CE conseguente all’infezione con HHV-6.
2.3. Definizione del ruolo della proteina U94 di HHV-6 nell’inibizione della fisiologica capacità delle LEC di organizzare strutture simil-capillari.
2.4. Caratterizzazione degli effetti sulla linfoangiogenesi dell’attivazione del repressore trascrizionale cellulare YY1, indotta da U94 di HHV-6.
2.5. Caratterizzazione del pattern di espressione dei TLR in LEC, e del ruolo dei TLR nell’infezione da HHV-6.
2.6. Caratterizzazione dell’angiogenesi MCP-1-dipendente associata all’infezione da HHV-8.
2.7. Determinazione della capacità di HCMV di infettare cellule endoteliali linfatiche (LEC) e di modularne la risposta infiammatoria.
2.8. Caratterizzazione del ruolo del gene US16 di HCMV nell’infezione di diversi tipi di cellule endoteliali.

Obiettivo 3. CARATTERIZZAZIONE DEI MECCANISMI MOLECOLARI COINVOLTI NELL’ATTIVAZIONE DEL PROCESSO INFIAMMATORIO ASSOCIATO ALL’INFEZIONE ERPETICA DELL’ENDOTELIO (Unità I, II e IV).
Questo obiettivo si propone di verificare il ruolo della chinasi IkB-specifica IKK come un mediatore essenziale della risposta infiammatoria indotta da virus erpetici, e di analizzare il possibile ruolo di altre vie di trasduzione del segnale attivate dall’infezione con virus erpetici. Gli obiettivi specifici includono:
3.1. Identificazione del ruolo delle chinasi NIK, MEKK-1 e PKR nella stimolazione del pathway IKK/NF-kB indotta da virus erpetici.
3.2. Caratterizzazione dell’effetto dell’infezione con HSV-1 sull’attivazione e fosforilazione del fattore anti-infiammatorio HSF1, e del possibile cross-talk tra HSF1 ed NF-kB in cellule endoteliali e monociti umani.
3.3. Caratterizzazione dell’effetto dell’infezione con HSV-1 sulla modulazione della trasduzione del segnale infiammatorio e di sopravvivenza in cellule epiteliali ed endoteliali, ed in particolare sulla regolazione delle chinasi JNK, p38, AKT e PERK, e sulla loro possibile interazione con i fattori HSF1 ed NF-kB.
3.4. Definizione degli effetti dell’attivazione del fattore cellulare trascrizionale ATF-4 in CE in corso di infezione da HHV-8.
3.5. Caratterizzazione dell’interazione funzionale tra HCMV e la proteina cellulare IFI16 nella determinazione della risposta infiammatoria delle cellule endoteliali.

Obiettivo 4. RICERCA DI POTENZIALI INIBITORI FARMACOLOGICI DI NF-kB E CARATTERIZZAZIONE DEL LORO EFFETTO SULLA REPLICAZIONE DEI VIRUS ERPETICI E SULL’ATTIVAZIONE DELLA RISPOSTA INFIAMMATORIA INDOTTA DALL’INFEZIONE VIRALE (Unità I e IV).
Per il raggiungimento di questo obiettivo, vari tipi di cellule endoteliali verranno trattati con differenti prostanoidi ciclopentenonici inibitori di IKK, altri inibitori sintetici di NF-kB attualmente disponibili nel laboratorio della UO Santoro, inibitori di IKK di nuova generazione (AS602868) e farmaci anti-infiammatori non-steroidei, in presenza della citochina infiammatoria TNFa o dopo infezione virale.
Gli obiettivi specifici includono:
4.1. Determinazione dell’effetto dei farmaci sullo stato di attivazione di NF-kB e della chinasi IKK.
4.2. Caratterizzazione dell'effetto delle molecole in studio sulla trascrizione e traduzione di molecole di adesione, e di geni pro-infiammatori ed anti-apoptotici.
4.3. Determinazione dell’effetto delle molecole sulla replicazione di HSV-1. <<<

Risultati parziali attesi

Come indicato in precedenza, alcune infezioni virali a carico dell’endotelio sono state implicate nell’eziopatogenesi di malattie vascolari sia degenerative che proliferative. In particolare, e’ stato suggerito che alcuni Herpesvirus in grado di indurre un processo infiammatorio in cellule endoteliali (CE) possano innescare o accelerare i processi aterosclerotici. Tuttavia il ruolo degli herpesvirus nella patologia vascolare non è stato ancora definito, e non sono stati individuati i meccanismi molecolari attraverso cui l’infezione virale promuove l’infiammazione a livello endoteliale e causa rimodellamenti vascolari.
In generale il presente programma di ricerca si pone come altamente innovativo nel campo delle infezioni da Herpesvirus in quanto il raggiungimento degli obiettivi proposti contribuirà a: i) chiarire il ruolo dei diversi virus erpetici (HCMV, HSV-1, HHV-6 e HHV-8) nell’eziopatogenesi di alcune patologie vascolari, quali coronaropatie, infarto cardiaco, e aterosclerosi; ii) caratterizzare i meccanismi molecolari del processo infiammatorio che viene innescato nelle fasi iniziali delle infezioni sostenute da herpesvirus; iii) dare nuove informazioni per la messa a punto di trattamenti farmacologici mirati ad inibire alcune vie di attivazione del segnale di trasduzione utilizzate dagli Herpesvirus per la propria replicazione.
In particolare lo svolgimento del progetto permetterà di ottenere diversi risultati interessanti. Un risultato di notevole importanza è rappresentato dalla possibilità di generare colture primarie di cellule endoteliali linfatiche umane da tonsille, linfonodi ed altri distretti attraverso la messa a punto di metodiche specifiche di purificazione, espansione e coltivazione che ne rendano possibile l’utilizzo per svariate applicazioni sperimentali. La messa a punto di tali colture renderà possibile lo studio dell’infezione di endotelio linfatico in vitro con virus erpetici quali HCMV, HHV-6 ed HHV-8 che sono spesso presenti a livello degli organi linfatici, permettendo di stabilire se le cellule endoteliali linfatiche possano rappresentare un serbatoio virale contribuendo allo spreading del virus nei confronti di altri elementi cellulari che transitano attraverso gli organi linfatici.
La disponibilità contemporanea di colture di cellule endoteliali ematiche (BEC) e linfatiche (LEC) primarie darà l’opportunità a tutte le UO afferenti al progetto di studiare le infezioni erpetiche in un contesto biologico rilevante. Inoltre, utilizzando CE derivate da diversi distretti anatomici, si potrà valutare l’eterogeneità della risposta della cellula ospite all’infezione da virus erpetici.
Nel caso del virus HHV-6, lo svolgimento del progetto potrà chiarire alcuni importanti aspetti legati all’infezione delle LEC da parte di questo virus. I nostri studi precedenti hanno mostrato che l’infezione persistente con HHV-6 deregola la funzione endoteliale sia nel sistema BEC che LEC. I risultati che prevediamo di ottenere chiariranno alcuni aspetti dei meccanismi attraverso i quali HHV-6 può esercitare la sua azione. La presenza costante di trascritti di U94 all’interno di cellule LEC lascia ipotizzare che il suo prodotto proteico possa svolgere effetti a lungo termine nei bersagli cellulari infetti ed enfatizza il possibile ruolo di U94 nei fenomeni di inibizione della formazione di strutture simil-capillari che si osserva in CE infette con HHV-6. La dimostrazione che U94 possa, digiunta dal virus, indurre tali effetti inibitori apre la possibilità di sviluppare reagenti che potrebbero trovare applicazioni terapeutiche in patologie nelle quali è importante controllare l’attività angiogenica delle CE.
Altri risultati interessanti riguardano l’influenza di alcuni fattori cellulari e virali sulle caratteristiche e l’esito finale dell’infezione delle CE con HCMV per definire meglio il ruolo svolto dall’infezione virale nella promozione dello sviluppo di malattie vascolari. Per quanto riguarda i fattori cellulari, verrà esaminato l’effetto della diversità delle CE (origine, localizzazione anatomica, caratteristiche del vaso di provenienza) attraverso un’analisi comparativa delle caratteristiche dell’infezione. In particolare, la possibilità di disporre di un modello cellulare peculiare (cellule endoteliali linfatiche, LEC) consentirà di definire, per la prima volta, la capacità di HCMV di infettare anche questo importante tipo di CE, di cui non è ancora nota la suscettibilità all’infezione. L’analisi della risposta trascrizionale e infiammatoria delle LEC infette permetterà di stabilire se, anche in questo tipo di CE, la disregolazione genica cellulare che si associa all’infezione costituisca un elemento patogenetico nella determinazione di disfunzioni delle cellule endoteliali e del danno vascolare anche a livello dei vasi linfatici. Inoltre, la definizione della capacità di HCMV di regolare nelle diverse CE in esame l’espressione e l’attività della proteina IFI16, permetterà di stabilire se esiste un’interazione funzionale tra le vie di attivazione trascrizionale innescate dall’infezione virale e quelle regolate da un fattore cellulare che influenza la risposta proliferativa e infiammatoria delle CE.
Infine, lo studio delle funzioni della proteina US16 di HCMV nella determinazione delle caratteristiche dell’infezione in CE diverse, permetterà di stabilire il contributo di un fattore virale che si ipotizza avere un ruolo di regolatore del grado di citopatologia e quindi dell’evoluzione verso l’infezione persitente. Questi risultati permetteranno, per la prima volta, di definire in un modello di rilevanza biologica quali le CE, i meccanismi molecolari con cui HCMV modula la propria replicazione, e potranno inoltre contribuire al disegno e sviluppo di molecole che interferiscono con l’attività di US16 (quali siRNA e versioni dominanti negative) per modificare l’evoluzione dell’infezione nelle CE.
Studi epidemiologici mettono in rilievo con sempre maggiore chiarezza che la presenza di HHV-6 aggrava quadri patologici indotti da HCMV. I risultati che otteremo dagli esperimenti di coinfezione HHV-6/HCMV permetteranno di chiarire se le BEC possono rappresentare un importante sito di coesistenza dei virus. Poiché queste cellule possono sostenere infezioni virali persistenti di entrambi gli Herpesvirus in assenza di effetti citopatici evidenti, nelle BEC potrebbero avere luogo fenomeni di transattivazione erpetica così come di sinergismo delle attività deregolatorie di HHV-6 e HCMV.
Di particolare rilevanza sono i risultati previsti nelle Fasi 3 e 4 del progetto. La caratterizzazione delle vie di trasduzione del segnale infiammatorio e di sopravvivenza in cellule infettate con virus erpetici contribuirà ad approfondire le conoscenze sui meccanismi molecolari alla base dei processi infiammatori associati all’infezione da Herpesvirus; inoltre questi studi daranno informazioni utili per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche antivirali che utilizzino come target fattori cellulari non soggetti alla variabilita’ dovuta alle frequenti mutazioni del virus.
Nel loro insieme, i risultati che si attende di ottenere potranno contribuire ad un miglioramento della conoscenza dei meccanismi molecolari che regolano l’interazione tra Herpesvirus e CE e l’esito finale dell’infezione, ovvero di un aspetto cruciale nella patogenesi delle malattie vascolari associate all’infezione. Questi risultati potranno poi costituire la base di partenza per studi applicativi indirizzati allo sviluppo di strategie innovative per la terapia delle malattie vascolari attraverso l’individuazione di molecole interferenti (quali inibitori farmacologici, siRNA, dominanti negativi) con l’attività di specifici fattori trascrizionali necessari per la replicazione virale e la determinazione della risposta infiammatoria nelle CE. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Gli Herpesvirus rappresentano una classe di patogeni ampiamente diffusi e responsabili di vari tipi di malattie che nell'uomo variano da patologie di lieve entita' ad infezioni con esito letale. Oltre alle patologie classiche, e’ stato ipotizzato che l'infezione di cellule endoteliali (CE) con alcuni Herpesvirus, tra cui il citomegalovirus (CMV) ed i virus Herpes Simplex di tipo 1 (HSV-1) e 2 (HSV-2), possa promuove danno vascolare e trombosi, e possa essere coinvolta nella patogenesi dell'aterosclerosi ed altre malattie vascolari che rappresentano una delle maggiori cause di mortalita’ nella popolazione adulta di entrambi i sessi (1-6). Tuttavia, il ruolo degli Herpesvirus nelle patologie vascolari non è ancora chiarito, anche a causa della mancanza di modelli sperimentali adatti allo studio delle infezioni dell’endotelio. Le cellule endoteliali mostrano infatti fenotipi differenti che dipendono da fattori quali l’origine adulta o fetale, la localizzazione anatomica dell’organo, e la grandezza e specializzazione del vaso da cui derivano (7-10). Solo negli ultimi anni lo sviluppo di tecniche di allestimento di colture primarie di CE da vasi umani adulti ha permesso di ottenere colture primarie da qualsiasi tipo di organo (11,12), consentendo lo studio degli effetti dell’infezione erpetica nella patologia endoteliale.
Nel caso di HCMV è stato dimostrato come l’infezione di CE da parte di questo herpesvirus determini una modificazione del fenotipo cellulare, inducendo l’espressione di molecole di adesione, quali ICAM-1 ed E-selettine, sulla superficie di cellule infette, ed incrementando la produzione ed il rilascio di citochine e chemochine proinfiammatorie quali IL-6, IL-8 ed MCP-1 (13-15). La presenza di un’attiva replicazione virale in assenza di effetti citopatici lascia presupporre che le CE possano essere persistentemente infettate da HCMV e rappresentare un importante reservoir in vivo per l’herpesvirus. Inoltre, l’induzione di molecole di adesione sulla superficie delle CE infette ed il rilascio di sostanze ad attività proinfiammatoria indicano un possibile ruolo di HCMV nello sviluppo di disfunzioni endoteliali che predispongono i vasi ai fenomeni degenerativi. Molecole antigeniche e sequenze genomiche di HCMV sono state infatti ritrovate in biopsie di vasi con lesioni aterosclerotiche o con processi occlusivi (16,17).
Anche gli herpesvirus umani 6 (HHV-6) e 8 (HHV-8) sono capaci di infettare produttivamente le CE (18-21). La riattivazione di HHV-6 è associata, in vivo, a fenomeni di microangiopatia trombotica (22); inoltre, la presenza del genoma di HHV-6 è stata rilevata nell’endotelio aortico di pazienti con aneurisma dell’aorta (23). HHV-6 è in grado di infettare le colture primarie di CE di derivazione sia macro- che microvascolare, incrementando la produzione di molecole proinfiammatorie, quali IL-8, MCP-1 e RANTES (24,25).
Nostri studi precedenti confermano che le CE rappresentano un bersaglio importante anche per l’infezione da HHV-8, un gamma-herpesvirus associato al sarcoma di Kaposi, e suggeriscono che dopo alcuni cicli di replicazione produttiva HHV-8 stabilisce infezioni latenti. HHV-8 infetta le CE, causandone la proliferazione, aumentandone la longevità e causando trasformazione di CE primarie del midollo osseo (19-21).
Infine, anche i virus HSV-1 e HSV-2 sono stati implicati nella patogenesi di malattie vascolari (1,2,26). In particolare, e’ stato suggerito che la presenza di questi agenti patogeni possa indurre una reazione infiammatoria associata a processi degenerativi e ad iperproliferazione. Inoltre, e’ stato dimostrato che nel caso di cellule endoteliali l’infezione con HSV-1 altera il fenotipo cellulare promuovendo l’adesione di neutrofili e piastrine, ed induce la sintesi di molecole di adesione del tipo ICAM-1 e VCAM-1 (26). Tuttavia, i meccanismi molecolari coinvolti nell’attivazione del processo infiammatorio associato all’infezione virale dell’endotelio non sono ancora noti.
Noi abbiamo dimostrato che l’infezione da HSV-1 e’ in grado di attivare il fattore nucleare NF-kB (nuclear factor-kB) in vari tipi di cellule umane (27-29). NF-kB normalmente esiste in un complesso eterodimerico citoplasmatico inattivo, legato a proteine inibitorie della famiglia IkB, in genere IkBa, ed e' attivato in risposta ad una varieta' di stimoli patogeni, tra cui infezioni batteriche e virali, ed esposizione a citochine infiammatorie (29,30). In seguito a stimolazione, la proteina IkBa e' fosforilata dal complesso chinasico IKK, con conseguente ubiquitinizzazione e degradazione proteasoma-dipendente. Dopo il rilascio da IkBa, NF-kB transloca nel nucleo dove si lega a sequenze specifiche kB, inducendo rapidamente la trascrizione di una varieta' di geni codificanti proteine che regolano il ciclo e la sopravvivenza cellulare, e proteine pro-infiammatorie tra cui la cicloossigenasi-2, varie citochine chemiotattiche ed infiammatorie, recettori per citochine e molecole di adesione cellulare (30-32).
NF-kB svolge un ruolo critico nella regolazione dei processi infiammatori alla base di varie patologie, tra cui alcune malattie infiammatorie croniche del sistema vascolare e la formazione di lesioni aterosclerotiche (33). NF-kB nello stato attivato e’ stato identificato in situ in placche aterosclerotiche umane, mentre e’ assente in vasi esenti da lesioni aterosclerotiche (34). Inoltre, molti geni i cui prodotti sono coinvolti nella patogenesi del processo aterosclerotico sono regolati da NF-kB (31,32). Tra questi, quelli di maggiore rilevanza sono le molecole di adesione VCAM-1, ICAM-1 e E-selettine, e le chemochine MCP-1 e IL-8, che hanno un ruolo importante nel reclutare monociti circolanti sull’endotelio dei vasi. Inoltre, altri prodotti di geni target di NF-kB, tra cui la ciclina D1 e le proteine anti-apoptotiche cIAP-1, cIAP-2, XIAP e cFLIP, possono stimolare la proliferazione cellulare o indurre sopravvivenza in cellule nel sito di formazione della lesione (32). E’ stato recentemente suggerito che un’attivazione non regolata di NF-kB contribuisca al cambiamento del pattern di espressione genica che si evidenzia in situazioni patologiche e durante l’aterogenesi (33).
Noi abbiamo recentemente identificato un nuovo meccanismo attraverso cui il virus HSV-1 attiva il fattore NF-kB in maniera persistente, causando una ’disregolazione’ del funzionamento del fattore stesso (35). Abbiamo dimostrato che, diversamente dall’induzione in seguito a stimoli infiammatori, l’attivazione di NF-kB indotta da HSV-1 non è in grado di indurre la trascrizione del gene inibitorio IkBa in cellule infette. La neosintesi di IkBa e’ essenziale per promuovere il distacco di NF-kB dal DNA e l’esporto nucleare del fattore trascrizionale, e rappresenta il principale sistema di regolazione negativa che assicura la ricostituzione dei livelli intracitoplasmatici di NF-kB inducibile, limitando la durata della trascrizione NF-kB-dipendente. Abbiamo dimostrato che il blocco dell’espressione di IkBa è dovuto al mancato reclutamento di NF-kB sul promotore del gene inibitorio in cellule infette. NF-kB viene invece reclutato selettivamente sul promotore del gene immediato-precoce ICP0 di HSV-1, attivando l’espressione del genoma virale (35). Questi risultati suggeriscono che l’attivazione persistente di NF-kB in cellule infettate con HSV-1 non sia parte di un meccanismo aspecifico di risposta cellulare al virus, ma possa avere un ruolo positivo nel promuovere l’espressione di geni virali. Questa ipotesi è ulteriormente rafforzata da nostri studi recenti che mostrano come il blocco funzionale di NF-kB indotto sia attraverso l’inibizione della chinasi IKK mediata da prostanoidi ciclopentenonici (26,36) che attraverso l’inibizione del proteasoma (37) inibisca la replicazione virale.
L’attivazione prolungata di NF-kB non e’ limitata al virus HSV-1. Risultati analoghi sono stati ottenuti in un recente studio in collaborazione con le Unita’ Di Luca e Caruso, utilizzando un modello sperimentale di infezione acuta con il virus erpetico HHV-8 in cellule endoteliali messo a punto dal Prof. Di Luca. Abbiamo dimostrato che HHV-8 e’ in grado di attivare IKK e NF-kB nei primi stadi dell’infezione, inducendo selettivamente l’espressione e secrezione di elevati livelli della chemochina proinfiammatoria MCP-1 (38). Questi studi hanno inoltre portato all’importante osservazione che la chemochina MCP-1 indotta in seguito all’infezione con HHV-8 promuove la formazione di strutture tubulari in cellule endoteliali infette, suggerendo che MCP-1 possa avere un ruolo importante nel promuovere i processi infiammatori ed angiogenetici indotti dall’infezione con HHV-8.
Nel complesso questi risultati confermano l’ipotesi che gli Herpesvirus siano coinvolti nella patologia infiammatoria dell’endotelio e sottolineano l’importanza di chiarire i meccanismi molecolari alla base di questi processi per individuare strategie innovative per la terapia delle malattie vascolari.


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