RICERCA ITALIANA     

IMMUNOAGENTI UMANI ANTITUMORALI

Università degli Studi di Napoli "Federico II"

Abstract

L’immunoterapia è uno strumento di confermata efficacia nell’arsenale delle terapie anti-cancro, soprattutto per la sua selettività e l’assenza di resistenza ai farmaci (MDR, multi-drug resistance).

Uno dei bersagli più appropriati per la immunoterapia, come antigene-associato-a-tumori, è ErbB2, un recettore tirosina-chinasico super-espresso sulla superficie di vari tipi di carcinomi, in particolare di quello mammario.

L’immunoagente anti-ErbB2 di maggior successo nella terapia del carcinoma mammario è oggi Herceptin, un anticorpo umanizzato. Tuttavia Herceptin presenta vari svantaggi: non ha efficacia terapeutica nel 40-60% dei casi di carcinoma mammario ErbB2-positivo, ed è cardiotossico in una elevata percentuale di pazienti trattate, soprattutto se somministrata in combinazione con antineoplastici comuni.

L’Unità I ha preparato negli ultimi anni una serie di immunoagenti umani anti-ErbB2: Erbicin, un scFv (frammento di anticorpo a catena singola) e due EDIA (Erbicin-Derived-ImmunoAgents), denominati Erb-hcAb e Erb-hRNasi. Gli EDIA umani sono stati costruiti con Erbicin (umana) coniugata alla regione Fc di una IgG umana (Erb-hcAb), ovvero ad una RNasi umana (Erb-hRNasi). Saggiati su modelli animali di carcinoma mammario, gli EDIA sono risultati molto efficaci come agenti anti-neoplastici, con proprietà che indicano un loro elevato potenziale per l’immunoterapia del carcinoma mammario. Esperimenti preliminari in vitro eseguiti nel laboratorio dell’Unità I hanno indicato che gli EDIA umani non hanno effetti cardiotossici e sono efficaci anche su cellule resistenti all’azione antineoplastica di Herceptin. Queste interessanti proprietà degli EDIA probabilmente dipendono dall’epitopo riconosciuto dagli EDIA sul recettore ErbB2, che è diverso da quello riconosciuto da Herceptin. Non sono tuttavia ad oggi disponibili dati sulla struttura di questi immunoagenti, né sui complessi che essi formano con il dominio extracellulare di ErbB2.

Il progetto che si propone ha dunque una doppia finalità, funzionale e strutturale. Lo studio degli aspetti funzionali, assegnato alla Unità I, sarà rivolto al potenziale antitumorale di Erbicin e degli EDIA; quello degli aspetti strutturali, assegnato alla Unità II, sarà rivolto alle determinazioni delle proprietà strutturali e dinamiche di Erbicin e EDIA, oltre che dei complessi di questi immunoagenti con il dominio extracellulare di ErbB2.

Alla Unità I è quindi assegnato il compito di studiare i parametri pre-clinici di maggiore interesse di Erbicin e degli EDIA, quali: (i) l’assenza in vivo, già determinata con prove in vitro, di effetti cardiotossici da parte di Erbicin ed EDIA; (ii) la capacità di Erbicin ed EDIA, finora determinata su cellule in vitro, di inibire la crescita in vivo di tumori resistenti a Herceptin. All’Unità I inoltre sono assegnate anche: (i) la descrizione a livello molecolare del nuovo epitopo riconosciuto da Erbicin e EDIA su ErbB2; (ii) la produzione di EDIA di seconda generazione; (iii) la costruzione di modelli sperimentali costituiti da adenovirus ricombinanti codificanti EDIA, sia per la produzione su larga scala degli immunoagenti, sia per il loro rilascio in vivo a fini terapeutici.

Alla Unità II è assegnato il compito di determinare la struttura degli immunoagenti prodotti dalla Unità I, oltre che dei loro complessi con ErbB2 per studiare il meccanismo del riconoscimento anticorpo-recettore. Le determinazioni saranno eseguite mediante cristallografia ai raggi X e con tecniche computazionali, che vanno dalla costruzione di modelli per omologia alle simulazioni di dinamica molecolare. Saranno inoltre eseguiti studi di modelli strutturali per omologia anche per il design di nuovi immunoagenti. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Giuseppe D'alessio Università degli Studi di NAPOLI "Federico II"

Obiettivo del Programma di Ricerca

I nuovi anti-ErbB2 EDIA (Erbicin-Derived-ImmunoAgents), Erb-hcAb e Erb-hRNasi, recentemente proposti dall’Unità I, sono dotati di potente azione antitumorale e di proprietà strutturali e funzionali con elevato potenziale per la immunoterapia di carcinomi ErbB2-positivi.

Prove in vitro hanno rivelato che gli EDIA non hanno effetti cardiotossici e inibiscono la crescita di cellule resistenti a Herceptin, oggi l’unico immunoagente anti-ErbB2 impiegato con successo nella terapia del carcinoma mammario. Ma spesso Herceptin produce dannosi effetti cardiotossici, e in una elevata percentuale di casi di carcinoma mammario ErbB2-positivi si riscontra resistenza a Herceptin. Sebbene sia stato dimostrato che l’epitopo sul recettore ErbB2 riconosciuto dagli EDIA è diverso da quello riconosciuto da Herceptin, non sono disponibili dati strutturali su EDIA.

Pertanto i principali obiettivi del progetto sono: la definizione delle proprietà strutturali e funzionali degli EDIA, con particolare riguardo al loro potenziale pre-clinico; la costruzione di nuovi immunoagenti di seconda generazione, dotati di caratteristiche antitumorali superiori a quelle degli immunoagenti noti; lo studio in dettaglio delle componenti strutturali e dinamiche responsabili del riconoscimento recettore-immunoagenti.

Gli obiettivi specifici sono:

per l’Unità I:

1. Verifica in vivo su topi dell'assenza/presenza di effetti cardiotossici dipendenti dal trattamento con EDIA.
2. Verifica in vivo su topi dell'efficacia di EDIA su tumori resistenti a Herceptin.
3. Mappa del nuovo epitopo specificamente riconosciuto su cellule ErbB2-positive da Erbicin e dagli EDIA.
4. Produzione di adenovirus ricombinanti codificanti EDIA da somministrare a topi, sia per la produzione su larga scala di EDIA (per studi strutturali), sia per studiare il loro rilascio in vivo ai fini terapeutici
5. Costruzione e caratterizzazione come agenti anticancro di nuove immunoRNasi di seconda generazione derivate da Erbicin.

per l’Unità II:

1. Determinazione mediante cristallografia della struttura di EDIA e di complessi di EDIA con il dominio extracellulare di ErbB2.
2. Caratterizzazione dei determinanti strutturali del riconoscimento recettore-immunoagente mediante l’utilizzo combinato di simulazioni di dinamica molecolare e di analisi strutturali comparative.
3. Progettazione e determinazione della struttura di nuove immunoRNasi. <<<

Risultati parziali attesi

I risultati attesi dalla ricerca che si propone possono essere ricavati direttamente dal programma dettagliato da ciascuna Unità nel Modello B. Essi sono, per ciascuna Unità:

Unità I

- Risultati riproducibili sulla attività antitumorale degli EDIA (Erb-hcAb and Erb-hRNasi) su modelli animali basati su tumori resistenti a Herceptin.
- Dati conclusivi sulla presenza o assenza di effetti cardiotossici in topi trattati con EDIA.
- Mappa dell’epitopo riconosciuto su ErbB2 da Erbicin e dagli EDIA.
- Vettori adenovirali codificanti Erbicin o EDIA.
- ImmunoRNasi resistenti all’inibitore delle RNasi e citotossiche per cellule ErbB2-positive.
- Una variante dimerica di Erb-hRNasi resistente all’inibitore delle RNasi e citotossica per cellule ErbB2-positive.

Unità II
- Struttura tridimensionale degli EDIA (Erbicin-Derived-ImmunoAgents) sia liberi, sia complessati con il dominio extracellulare del recettore ErbB2.
- Modelli di EDIA ottenuti per omologia strutturale, basati sui dati strutturali disponibili per immunoagenti anti-ErbB2.
- Strutture tridimensionali delle ribonuclease usate per la preparazione di immunoRNasi di seconda generazione.
- Dati delle simulazioni di dinamica molecolare effettuate utilizzando le strutture della regione extracellulare di ErbB2 complessata a EDIA, o ad anticorpi monoclonali umanizzati anti-ErbB2 (trastuzumab and pertuzumab).

I risultati attesi possono essere realizzati, data l’esperienza dei due gruppi di ricerca impegnati nel progetto. Essi offrono la prospettiva di ottenere non solo conoscenza scientifica sulla struttura e la funzione dei complessi di riconoscimento recettore/anticorpo, ma anche immunoagenti con alto potenziale terapeutico. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Circa 20 anni fa furono preparati i primi anticorpi monoclonali diretti verso un antigene associato al carcinoma mammario, poi identificato come ErbB2 (o HER2), un membro della famiglia ErbB (1). ErbB2 è un recettore transmembrana TKR, per il quale non si conosce uno specifico ligando. Tuttavia, quando va incontro a etero-dimerizzazione con i recettori ErbB1 (EGFR), ErbB3 o ErbB-4, ErbB2 trasduce con grande efficienza segnali che stimolano la proliferazione cellulare. ErbB2 è dunque un bersaglio molto attraente per la immunoterapia, anche perché è super-espresso su molte cellule di carcinoma (1).

Nel 1998 la Federal Drug Admnistration degli USA ha approvato l’uso clinico di Herceptin, anche detta Trastuzumab (2), un anticorpo anti-ErbB2 umanizzato, impiegato con successo nella immunoterapia del carcinoma mammario. Tuttavia Herceptin provoca effetti cardiotossici in un significativo numero di pazienti (circa il 15%), e una elevata percentuale di carcinomi (40-60%) risulta resistente, o sviluppa resistenza a Herceptin (4). Va inoltre considerato che Herceptin non attiva il processo di citotossicità dipendente dal complemento (CDC).

L’Unità I ha isolato dalla Griffin.1 phage library un frammento di anticorpo (scFv) anti-ErbB2 chiamato Erbicin, con alta affinità per ErbB2, capace di essere internalizzato e di inibire la crescita delle cellule bersaglio ErbB2-positive (5). Erbicin è stato poi utilizzato per costruire immunoconiugati, gli EDIA (Erbicin-Derived-ImmunoAgents). Un immunoconiugato è stato costruito per fusione di due molecole di Erbicin con la regione Fc di una IgG1 umana. L'anticorpo (6,7) è stato chiamato Erb-hcAb (Erbicin-human-compact Antibody) per le sue dimensioni “compatte” (100 kDa), se paragonate a quelle di una IgG naturale (155 kDa). Erb-hcAb si lega selettivamente a cellule ErbB2-positive, ne inibisce la crescita in vitro e in vivo, e induce citotossicità sia CDC che ADCC.
<br />L’Unità I ha poi costruito nuovi immunoagenti umani basandosi sulla strategia delle immunotossine. In questi immunoagenti tuttavia la tossina è sostituita da una RNasi, ottenendo così una immuno-pro-tossina, in quanto la RNasi legata all'anticorpo non è tossica, ma lo diventa se introdotta dall'anticorpo nella cellula. Una immunoRNasi completamente umana è stata ottenuta per fusione di Erbicin con la RNasi pancreatica umana (8). Denominata Erb-hRNasi (Erbicin-human-RNase), essa ha una elevata affinità per il recettore ErbB2 ed è citotossica per le cellule ErbB2-positive in vitro e in vivo. L’attività RNasica di Erb-hRNasi è essenziale per la sua attività antitumorale, ma Erb-hRNasi è inibita dall’inibitore citosolico delle RNasi (cRI), per cui essa esercita la sua azione antitumorale solo quando raggiunge nel citosol concentrazioni più elevate del cRI endogeno (9).

Gli EDIA (Erbicin-Derived-ImmunoAgents) Erb-hcAb e Erb-hRNasi non sono immunogenici, come risulta da esperimenti di attivazione di cellule T helper umane stimolate con i due immunoagenti (risultati non pubblicati della Unità I). Recentemente inoltre si è trovato che Erbicin e gli EDIA riconoscono sulle cellule ErbB2-positive un epitopo diverso da quello di Herceptin e degli altri immunoagenti anti-ErbB2 conosciuti (10). Questa osservazione ci ha consentito di riscontrare che gli EDIA, se usati in combinazione con Herceptin, hanno una più forte azione antitumorale che quando sono usati singolarmente. Essa inoltre ci ha suggerito che gli EDIA, indirizzati a un epitopo diverso da quello di Herceptin, potessero essere privi degli effetti cardiotossici tipici di Herceptin, e potessero inoltre essere efficaci anche su cellule ErbB2-positive resistenti a Herceptin. Prove preliminari in vitro hanno rivelato che effettivamente Erb-hcAb e Erb-hRNasi non presentano cardiotossicità, e posseggono attività citotossica anche su cellule ErbB2-positive da carcinomi mammario e prostatico resistenti a Herceptin.

Non ci sono dati sulle strutture di Erbicin e degli EDIA, liberi o complessati con ErbB2-ECD, la regione extracellulare di ErbB2. Risultati interessanti sono stati ottenuti negli ultimi anni sugli anticorpi anti-ErB2 umanizzati. Cho et al. (11, 12) hanno determinato mediante cristallografia ai raggi X la struttura del dominio ErbB2-ECD libero e legato a Herceptin. Si è trovato che Herceptin si lega al dominio IV, C-terminale, dell’ECD (12). In seguito è stata determinata la struttura ai raggi X del complesso tra ErbB2-ECD e il 2C4 (o pertuzumab), un anticorpo monoclonale umanizzato anti-ErB2 recentemente approdato nella pratica terapeutica. Si è trovato che Pertuzumab interagisce on un epitopo diverso da quello di Herceptin (13), in particolare si lega alla giunzione tra i domini I, II e III. Questi risultati vanno letti con quelli su citati, recentemente prodotti dalla Unità I (10), che indicano che l’epitopo riconosciuto dagli EDIA è diverso da quelli riconosciuti da Herceptin e da Pertuzumab. E’dunque forte l’interesse per gli studi strutturali e di dinamica molecolare sugli EDIA.

Bibliografia
1. Slamon, D. J., Godolphin W, Jones LA, Holt JA, Wong SG, Keith DE, Levin WJ, Stuart SG, Udove J, Ullrich A., Studies of the HER-2/neu proto-oncogene in human breast and ovarian cancer, Science, 244: 707-712, 1989.
2. Stebbing, J. Stebbing, J., Copson E, O'Reilly S., Herceptin (trastuzumab) in advanced breast cancer, Cancer Treat. Rev., 26: 287-290, 2000.
3. Chien, K.R., Myocyte survival pathways and cardiomyopathy: implications for trastuzumab cardiotoxicity Semin. Oncol., 27 : 9-14, 2000.
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5. De Lorenzo, C., Palmer, D.B., Piccoli, R., Ritter, M.A., and D’Alessio, G. A new human antitumor immunoreagent specific for ErbB2. Clin. Cancer Res., 8: 1710-9, 2002.
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7. De Lorenzo, C., Cozzolino, R., Carpentieri, A., Pucci, P., Laccetti, P. and D'Alessio, G. Biological properties of a human compact anti-ErbB2 antibody. Carcinogenesis, 26,81890-1895, 2005.
8. De Lorenzo, C., Arciello, A., Cozzolino, R., Palmer, D. B., Laccetti, P., Piccoli, R., D'Alessio, G. A fully human antitumor immunoRNase selective for ErbB-2-positive carcinomas. Cancer Res., 64: 4870-4874, 2004.
9. De Lorenzo, C., Di Malta, C., Calì, G., Troise, F., Nitsch , L., D'Alessio, G. Intracellular route and mechanism of action of Erb-hRNase, a human anti-ErbB2 anticancer immunoagent. FEBS Letters, 581: 296-300, 2007.
10. De Lorenzo, C., Troise, F., Cafaro, V., D'Alessio, G. Combinatorial experimental protocols for Erbicin-derived immunoagents and Herceptin. British J Cancer, in press (online bjc.6604022), 2007.
11. Cho, H.S. and Leahy, D.J. Science 2002, 297, 1330-1333.
12. Cho, H.S., Mason, K, Ramyar, K.X., Stanley, A.M., Gabelli, S.B., Denney, D.W.J and Leahy, D.J. Nature 2003 421, 756-760.
13. Garrett, T.P., McKern, N.M., Lou, M., Elleman, T.C., Adams, T.E., Lovrecz, G.O., Kofler, M., Jorissen, R.N., Nice, E.C., Burgess, A.W., Ward, C.W. Mol Cell 2003;11,495-505. <<<