RICERCA ITALIANA     

Immunoterapia con cellule staminali mesenchimali nel trapianto sperimentale di isole pancreatiche

Università di Pisa

Abstract

Il diabete mellito insulino-dipendente (IDDM) o di tipo 1 è una patologia autoimmune che provoca la degenerazione delle cellule β del pancreas endocrino, responsabili della produzione di insulina.
Ad oggi il trapianto di isole di Langerhans si prospetta come una promettente soluzione sebbene rimangano ancora numerosi fattori da considerare al fine di migliorare la funzionalità del trapianto quali: un numero inadeguato di isole trapiantate, la ridotta vitalità e funzionamento delle stesse, le infiammazioni non specifiche, l’iperglicemia, la distruzione mediata dal sistema immune. Inoltre, la ridotta efficacia degli attuali protocolli immunosoppressivi contro la risposta autoimmune agli auto-antigeni presenti sulle isole (come l’isoforma 65 kDa della decarbossilasi dell’acido glutammico, GAD 65) costituiscono un ulteriore ostacolo. A ciò si aggiunga che i farmaci utilizzati nella terapia clinica per la prevenzione del rigetto a lungo termine risultano essere diabetogeni.
Studi recenti riportano che le cellule staminali mesenchimali (MSC), capaci di differenziarsi in vari tipi cellulari, sono in grado di ridurre la proliferazione linfocitaria, mediante la produzione di citochine.
Un altro tipo di cellule staminali presenti nel midollo osseo sono i precursori delle cellule endoteliai (EPC). Le EPC hanno un' elevata capacità proliferativa e possono migrare in siti dove è presente un danno endoteliale, promuovendo la riparazione e la formazione di nuovi vasi.
Nel nostro modello sperimentale, animali riceventi saranno trapiantati per via intraportale con 700 equivalenti di isole (IE) e resi diabetici mediante una singola dose elevata di streptozotocina.
Il trapianto di marginal-mass di isole pancreatiche è capace di indurre una riduzione transitoria della glicemia, senza però raggiungere livelli normoglicemici. Questa condizione può essere responsabile dell’alterata funzionalità delle cellule β trapiantate nel ratto. Quindi nei nostri modelli di trapianto saranno monitorati anche i livelli plasmatici di glucosio, insulina e di peptide-C.
I principali obiettivi del nostro studio sono: valutare le capacità immunosoppressive delle MSC nel trapianto di isole pancreatiche; confrontare l’efficacia immunosoppressiva delle MSC rispetto al convenzionale protocollo immunosoppressivo; valutare gli effetti delle MSC sui livelli plasmatici di glucosio dopo il trapianto di isole pancreatiche anche a lungo termine; analizzare gli eventuali effetti sinergici o additivi tra i protocolli farmacologici convenzionali di immunosoppressione e la terapia cellulare (MSC); evidenziare, in presenza o in assenza di MSC, i livelli di autoantigeni e relativi anticorpi nei vari gruppi sperimentali di trapianto singenico. L’esito dei trapianti effettuati sarà valutato attraverso la classica gradazione istopatologica, esaminando la presenza ed il grado del rigetto.
Ci proponiamo inoltre di fornire un ulteriore apporto alla conoscenza dei meccanismi che sono alla base del rigetto stesso, sia grazie all’impiego di specifiche tecniche, quali la microscopia elettronica e la morfometria, che alla valutazione della presenza di fattori ancora in studio come il fattore di inibizione della migrazione dei macrofagi (MIF).
Saranno inoltre esaminati, tramite tecniche di immunoflurescenza, i processi di rivascolarizzazione delle isole trapiantate in associazione alle MSC a diversi intervalli post-trapianto, con la prospettiva di impiegare le EPC e quindi valutarne il ruolo nella rivascolarizzazione.
Infine verranno migliorati i protocolli per la marcatura delle isole e delle MSC utilizzati nel nostro modello sperimentale di trapianto per la loro individuazione mediante MRI; contemporaneamente verranno ottimizzati i protocolli di acquisizione delle immagini, i relativi metodi di analisi e delle tecniche di indagine ottiche.
E’ importante sottolineare che le condizioni sperimentali, come la dose marginale di isole, i donatori allogenici e la distruzione delle cellule β da parte del sistema immunitario mimano quelle del trapianto di isole nell’uomo affetto da IDDM. Quindi è ragionevole assumere che i risultati ottenuti nei nostri modelli animali possano trovare presto un'applicazione clinica. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Franco Mosca Università degli Studi di PISA

Obiettivo del Programma di Ricerca

L'obiettivo di questo progetto è valutare, in un modello sperimentale animale, le proprietà immunosoppressive delle MSC (cellule staminali mesenchimali) nel trapianto di isole pancreatiche allogeniche. In particolare verranno studiate le proprietà immunomodulatorie delle MSC ed il loro effetto sul controllo glicemico e verrà confrontata l'azione delle MSC con la terapia immuosoppressiva convenzionale, studiando l'eventuale effetto sinergico dei due trattamenti. Qui di seguito saranno descritte le principali tematiche affrontate da questo progetto:

1) Verrà studiata la capacità delle MSC di sopprimere localmente la risposta immunitaria nel trapianto di isole allogeniche, con l’obiettivo di evitare una terapia immunosoppressiva sistemica a lungo termine.

2) Verrà studiata la capacità delle MSC di sopprimere la risposta autoimmune del diabete di tipo 1 che colpisce le isole pancreatiche trapiantate allogeniche e singeniche. Di particolare interesse sarà valutare, in un modello di diabete autoimmune, la presenza di anticorpi rivolti contro gli autoantigeni delle isole pancreatiche nel siero di ratti trapiantati con isole allogeniche in presenza o in assenza di MSC.

3) Verrà studiato il ruolo di fattori capaci di influenzare la funzionalità delle isole, quali la vascolarizzazione e l’iperglicemia. Quest’ultima, condizione tipicamente associata al trapianto di marginal-mass di isole pancreatiche, può essere responsabile dell’alterata funzionalità delle cellule beta; di conseguenza si valutera’ l’effetto di questa variabile sull’esito dei trapianti. A tale scopo, prima del trapianto di isole allogeniche, ratti riceventi diabetici saranno trattati con iniezioni giornaliere di insulina, per raggiungere livelli di glicemia vicino a valori normali (circa 0.8 g/L nei ratti). Una rapida rivascolarizzazione, anche tramite processi di neoangiogenesi, è indispensabile per la sopravvivenza ed il corretto funzionamento delle isole dopo il trapianto. Nel nostro modello di ratto diabetico, trapiantato con isole allogeniche e MSC, sarà di grande interesse studiare il ruolo delle EPC nello stesso processo. Analizzeremo quindi la vascolarizzazione delle isole a diversi intervalli di tempo post-trapianto con metodi di immunoflurescenza; successivamente valuteremo l’anatomia del letto vascolare in rapporto al numero delle cellule β sopravvissute nel trapianto ed ai relativi livelli di insulinemia e glicemia.

Attraverso lo studio della morfologia tessutale sara’ possibile valutare l’integrità e la funzionalità delle isole pancreatiche, trapiantate nel nostro modello sperimentale. Inoltre la presenza e l’entità del rigetto saranno classificate tramite gradazione istopatologica tradizionale. Infine verrà valutata l’importanza della localizzazione delle MSC, confrontando l’effetto di queste sul trapianto con il trattamento immunosoppressivo convenzionale. Avvalendoci della microscopia elettronica, la morfometria, lo studio di nuovi fattori quale il MIF, ci proponiamo di fornire un apporto ulteriore alla conoscenza dei meccanismi che sono alla base del rigetto stesso.
Altro obiettivo del progetto sarà sviluppare e ottimizzare i metodi per l’imaging cellulare in vivo delle isole pancreatiche e delle MSC, nel modello sperimentale di trapianto di isole pancreatiche nel ratto. A tale scopo saranno migliorati i protocolli di marcatura delle isole pancreatiche, testando diversi agenti di contrasto al fine di individuare quelli che diminuiscono il rischio di falsi positivi. Al tempo stesso saranno migliorati l’acquisizione delle immagini MRI, al fine di ottenere immagini libere da artefatti dovuti al movimento, ed anche i metodi di analisi delle immagini. Tali tecniche ottimizzate, saranno poi utilizzate in esperimenti in vivo su ratti diabetici che abbiano ricevuto MSC e isole pancreatiche. Il fine ultimo di questi esperimenti sarà quello di studiare la correlazione tra il segnale MRI e l’indice biologico della vitalità delle isole pancreatiche. <<<

Risultati parziali attesi

Attualmente il trapianto di isole pancreatiche si prospetta come una promettente soluzione, sebbene rimangano ancora numerosi fattori da considerare al fine di migliorare la funzionalità del trapianto.
Il lavoro programmato nella prima fase del progetto mira ad individuare una terapia efficace, basata su trattamenti farmacologici associati alla somministrazione delle MSC, in grado di migliorare la sopravvivenza e la funzionalità delle isole trapiantate.
Il nostro obiettivo sarà quello di raggiungere livelli stabili di normoglicemia in un numero significativo di animali trapiantati, per un lungo intervallo di tempo (fino a sei mesi).
Studiando la somministrazione degli immunosoppressori convenzionali, in combinazione con l' immunoterapia a base di MSC, ci aspettiamo di individuare eventuali effetti sinergici o addizionali dei suddetti trattamenti. Questi risultati ci permetteranno di ridurre la somministrazione di farmaci immunosoppressori e di conseguenza di limitare i loro effetti diabetogeni.
Le analisi del ruolo delle EPC nella generazione di nuovi vasi sarà determinante al fine di realizzare le modalità utili ad evitare i danni alle isole trapiantate. Infatti, la corretta funzionalità delle isole è strettamente associata alla presenza di ossigeno e nutrienti.
I risultati, ottenuti attraverso MRI, saranno utili per monitorare la localizzazione delle isole e delle MSC trapiantate.
La correlazione tra i parametri relativi alla MRI ed il livello plasmatico di glucosio, usato come indicatore biologico della vitalità delle isole, ci fornirà l'efficacia delle MSC nel prolungare la sopravvivenza delle isole per un lungo intervallo di tempo.
Inoltre, il monitoraggio dell'homing delle MSC ci fornirà informazioni sulle interazioni delle cellule staminali e i tessuti ospiti.
Il modello animale utilizzato in questo progetto presenta le caratteristiche tipiche della reazione di rigetto, anche da un punto di vista istologico quando il ratto ricevente viene trapiantato con sole isole in assenza di terapia immunosoppressiva. Quindi, le osservazioni ottenute con la microscopia ottica convenzionale e con la microscopia elettronica, riguardo le infiltrazioni linfocitarie, sia del parenchima epatico che del sistema vascolare, eseguite in parallelo con lo studio dell'espressione del MIF e del rilascio di citochine da parte delle MSC, forniranno le basi per una corretta analisi degli effetti degli immunosoppressori e delle mesenchimali e delle loro interazioni. E’ importante sottolineare che le condizioni sperimentali, come la dose marginale di isole, i donatori allogenici e la distruzione delle cellule β da parte del sistema immunitario, mimano quelle del trapianto di isole nell’uomo affetto da IDDM. Quindi è ragionevole assumere che i risultati ottenuti nei nostri modelli animali possano trovare presto una applicazione clinica. In generale, i risultati di questo progetto di ricerca, che si propone di individuare anche gli anticorpi responsabili della distruzione delle cellule β, fornirà le basi per la comprensione del meccanismo di azione delle MSC nella regolazione della risposta autoimmune. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il diabete mellito è una malattia cronica caratterizzata da iperglicemia, determinata da una ridotta secrezione di insulina da parte del pancreas endocrino oppure dalla resistenza a questo ormone da parte dei tessuti periferici. Esistono due principali forme di diabete: tipo 1 (insulino-dipendente, IDDM) e tipo 2 (non insulino-dipendente NIDDM).
Il primo è una malattia autoimmune che colpisce una popolazione giovane ed è dovuta alla distruzione delle cellule β del pancreas ad opera del sistema immunitario.
La risposta autoimmune verso gli antigeni delle cellule β del pancreas è associata alla presenza nel sangue di autoantigeni quali: acido glutammico decarbossilasi (GAD), tiroxina fosfatasi IA2 e di proteine citoplasmatiche i quali determinano la presenza di autoanticorpi (anti-GAD, anti-IA2, anti-ICA) nel sangue[1,2].
Il diabete di tipo 2 invece colpisce i soggetti generalmente al di sopra dei 40 anni ed è provocato da una resistenza cellulare all’insulina, non legata a processi immuni [3,4].
La somministrazione giornaliera di insulina ha risolto alcune complicazioni del diabete quali la chetoacidosi e il coma diabetico; tuttavia una percentuale di pazienti incorre in complicanze quali: retinopatie, alterazioni vascolari e neurologiche [5]. Il trapianto di pancreas, in pazienti affetti da diabete di tipo 1, è attualmente l’unica strategia terapeutica che consente di ripristinare una condizione di normoglicemia in assenza di somministrazione esogena di insulina [6-9].
Gli aspetti del trapianto di pancreas ancora da perfezionare sono:il ruolo delle procedure chirurgiche, i criteri di selezione del ricevente, la scelta del protocollo immunosoppressivo e l’impatto dei fattori immunologici, metabolici e genetici sulla sopravvivenza del trapianto.
Come alternativa al trapianto solido di pancreas si ricorre a quello di isole pancreatiche, una procedura efficace in modelli sperimentali di animali diabetici [10-14].Infatti il trapianto di isole è una tecnica chirurgica relativamente semplice con una bassa incidenza di rischi peri-operatori per il paziente.
Esistono alcuni punti critici per l’ottimizzazione del trapianto di isole pancreatiche: il tempo di conservazione a freddo del pancreas prima dell’isolamento delle isole deve essere inferiore ad 8h [15]; inoltre il contenuto medio di isole presenti in un solo organo solido raramente permette di ottenere una indipendenza insulinica e per questo sono necessari più donatori [16,17].
Nella pratica trapiantologica il rigetto rimane una delle complicanze più gravi da affrontare e prevenire.
Il grado del rigetto viene classificato, sulla base di parametri istopatologici, in iperacuto, acuto e cronico.Il primo ha una rapida insorgenza e comporta un’occlusione trombotica [18, 19]. Nel rigetto acuto, la necrosi vascolare è legata a reazioni di immunità umorale (anticorpale). Nella forma cellulare, invece, la patogenesi è legata all’azione di linfociti T citotossici e di macrofagi contro antigeni co-espressi con il complesso maggiore di istocompatibilità [20]. Nel rigetto cronico, fenomeni di fibrosi con alterazioni strutturali dell’organo portano ad una progressiva perdita di funzionalità [21].
Il MIF (Macrophage Migration Inhibitory Factor), proteina pro-infiammatoria, è tra i fattori presi in considerazione per lo studio dei meccanismi e per il monitoraggio della reazione di rigetto [22-28]. L’unità IV-Siena si è occupata dello studio di questa citochina [29-40]. E' stato ipotizzato che il MIF possa controbilanciare gli effetti immunosoppressivi degli ormoni glucocorticoidi sulla produzione di altre citochine infiammatorie [29]. Studi recenti hanno svelato nuove funzioni del MIF, dimostrandone la capacità di conservare il “privilegio immunitario” tramite azione sull’attività delle cellule Natural Killer (NK) [33, 41, 42]. Ulteriori lavori hanno dimostrato che il MIF può agire come fattore di controllo su proliferazione, differenziazione e vascolarizzazione tessutale, specialmente nelle neoplasie [43-45]. Il mantenimento della funzionalità vascolare, sopprattutto della microcircolazione, potrebbe essere una valida terapia anti-rigetto [46-49]. Attualmente, i protocolli anatomopatologici del follow up del rigetto si basano sull’impiego di metodiche istologiche classiche e di score internazionali [50-54]. La valutazione istopatologica deve comunque sempre essere correlata con i parametri funzionali [55].
L’induzione della tolleranza immunologica nei confronti delle isole viene indotta con l’impiego di farmaci ad attività immunosoppressiva. L’induzione di tolleranza con l’impiego di cellule staminali è stata per la prima volta perseguita mediante infusione di midollo intero del donatore (DBMC) [56]. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) derivano dal midollo osseo (MO) ed hanno la capacità di auto-rinnovarsi e di differenziare in vitro in diversi tessuti (osso, cartilagine, stroma, tessuto adiposo, muscolo e tendine). Sebbene tali cellule abbiano una bassa frequenza nel MO, possono essere facilmente isolate ed espanse senza perdere le loro capacità differenziative, caratteristiche che conferiscono loro la potenzialità clinica di riparare o ricostituire i tessuti danneggiati. Le MSC non esprimono i marcatori della linea ematopoietica CD34, CD45 o CD14 e possono essere identificate dalla positività per diverse molecole di adesione come CD29, CD44, CD73, CD105 [57]. Le MSC, inoltre, non esprimono molecole costimolatorie e molecole MHC di classe II, motivo per il quale probabilmente in vitro non vengono riconosciute dal sistema immunitario e sono considerate dei buoni candidati per la terapia cellulare in condizioni allogeniche [58]. Numerosi studi in vitro hanno dimostrato che MSC isolate da varie specie sopprimono la risposta immunitaria cellulo-mediata (cellule dendritiche, linfociti T CD4+, CD8+, cellule NK) direttamente o tramite fattori solubili, sopprimendo i processi di rigetto cellulare. Inoltre le MSC esprimono l’enzima indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) che, catalizzando la conversione di triptofano in chinurenina, provoca una carenza di tale aminoacido, esercitando un effetto immunosoppressivo [59]. Le proprietà immunosoppressive delle MSC sono supportate in vivo dall’osservazione che esse possano prolungare la sopravvivenza del trapianto allogenico di cute in babbuini immunocompetenti [60], prevenire il rigetto di cellule di melanoma murino in topi immunocompetenti [61] e attenuare la malattia di trapianto verso l’ospite (GVHD) nel topo e nell’uomo [62, 63]. I risultati preliminari ottenuti da questo stesso gruppo di ricerca (PRIN 2005) suggeriscono un ruolo delle MSC anche nel miglioramento della sopravvivenza delle isole pancreatiche trapiantate in assenza di terapia immunosoppressiva.
Un’appropriata vascolarizzazione delle isole è essenziale per la durata del graft e per il successivo trapianto di isole pancreatiche [64-66]. Al fine di prolungare la vita del graft stesso, sono state impiegate le MSC [67, 68]. A tale scopo un ruolo importante è rivestito dai progenitori endoteliali (EPC) nella rivascolarizzazione dei tessuti danneggiati.
Diversi studi hanno dimostrato che le EPC (CD34+, CD133+, CD31+, vWF+, lectins+, VEGFR2+), derivate dal MO, contribuiscono funzionalmente alla vasculogenesi durante fenomeni di cicatrizzazione, ischemia degli arti, infarto del miocardio, endotelizzazione dei trapianti vascolari o della organogenesi fisiologica dell’endometrio, sotto l’influenza di appropriati stimoli citochinici e/o ormonali [69-71].
Recenti studi su modelli di animali diabetici individuano come possibile causa dei problemi cardiovascolari associati al diabete, un numero ridotto di EPC circolanti ed una loro minima mobilizzazione dal midollo osseo [72, 73]. Infine il controllo dei processi ischemici è cruciale per la sopravvivenza delle isole [74-81].
Il controllo del rigetto acuto nei pazienti che hanno subito un trapianto d’organo è spesso associato ad effetti collaterali a lungo termine dovuti all’uso di immunosoppressori [81]. I corticosteroidi danno luogo a: disfunzione endoteliale, ipertensione, iperlipidemia, diabete mellito e scompenso della fibrinolisi [82-84].
Gli inibitori della calcineurina , ciclosporina A (CyA) e tacrolimo (o FK506), sono gli agenti immunosoppressivi più efficaci. La calcineurina fosfatasi (CaN), un eterodimero calmodulina dipendente ed il nuclear factor of activated T cells (NFAT) sono coinvolti nella regolazione della pompa di Ca++ e agiscono sul segnale di attivazione della risposta immunitaria. CyA ed FK506 inibiscono la CaN, legando specifici recettori endocellulari (ciclofillina e FK-binding protein-12, FKBP-12) [85]. Ciò impedisce la desfosforilazione di NFAT e la sua traslocazione nel nucleo, causando una diminuizione dell’espressione di geni la cui trascrizione dipende da NFAT. Attraverso questo meccanismo CyA e FK506 bloccano l’attivazione dei linfociti T.
Tra gli effetti collaterali più gravi di CyA e FK506 vi è la impaired glucose tolerance (IGT) che induce iperglicemia e diabete mellito; essi hanno un’incidenza stimata dal 10 al 30% [90-96]. L’effetto diabetogeno è dovuto ad un’azione diretta sul metabolismo del Ca++ intracellulare nelle cellule β, con la conseguente riduzione del numero dei granuli secretori ed una diminuzione della secrezione insulinica [97-99].
Poiché tali immunosoppressori non riducono, nell’immediato, la secrezione di insulina, l’effetto primario potrebbe consistere nell’inibizione della trascrizione genica [100-101].
Studi immunoistochimici, condotti su pancreas murini, evidenziano che il contenuto di FKBP-12 è maggiore nelle cellule β rispetto alle a. Ciò causa un accumulo intracellulare di tacrolimo e di conseguenza, un aumento dell’ effetto tossico per le cellule β [102].
A differenza dei pazienti trattati con CyA, quelli trattati con tacrolimo presentano un aumento dei livelli di anticorpi rivolti contro le isole pancreatiche (ICA) [90, 95, 103-105].
Infine un altro trattamento immunosoppressivo efficace, utilizzato nel trapianto di isole pancreatiche, consiste nella somministrazione di anticorpi antilinfociti (antithymocyte globulin, ATG o antilymphocyte globulin, ALG), per l’induzione della deplezione linfocitaria. [106]
L’Unità III-Verona ha dimostrato che le isole pancreatiche possono essere marcate con un agente di contrasto superparamagnetico (ossido di ferro) e visualizzate in vivo per mezzo della MRI (tecnica altamente sensibile) [107-109]. Le MSC vengono marcate con delle sonde opportune e visualizzate in vivo con le seguenti tecniche: Magnetic Resonance Imaging, MRI [110], Optical Imaging OI [111]. Affinché siano visibili alla MRI, le MSC sono marcate con particelle di ossidi di ferro superparamagnetico (SPIO), aventi dimensione compresa tra 4-10 nm [112]. La marcatura delle cellule richiede la loro incubazione con l’agente di contrasto, occasionalmente in presenza di agenti trasfettanti [113]. Diversi studi hanno evidenziato che l’analisi MRI permette di seguire, con un’elevata sensibilità, il destino delle cellule negli organismi dopo il trapianto [114]. La sensibilità della MRI dipende fortemente dalle caratteristiche proprie dell’organo in cui si localizzano le cellule. Infatti, poiché nelle immagini MR, le cellule marcate con l’agente di contrasto SPIO appaiono come spot di bassa intensità, essi non possono essere individuati se si posizionano in organi che appaiono scuri alla MRI (es: polmoni). E’ possibile superare questo inconveniente, utilizzando la tecnica OI, nella modalità di bioluminescenza o fluorescenza.
La bioluminescenza si basa sulla generazione di luce derivante da reazioni enzimatiche compiute da organismi viventi; essa conferisce un’alta sensibilità grazie alla mancanza di segnale di fondo da parte delle cellule di mammifero [115].
Un altro approccio prevede l’uso di quantum dots (QDs) cristalli semiconduttori aventi dimensioni dell’ordine dei manometri e caratterizzati da una resa in fluorescenza estremamente elevata e proprietà di fluorescenza costanti per intervalli di tempo molto lunghi [117].

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