RICERCA ITALIANA     

L'APOPLASTO E L'INTEGRAZIONE DI PROCESSI CHE REGOLANO LO SVILUPPO E L'IMMUNITÀ INNATA DELLE PIANTE

Università degli Studi Roma Tre

Abstract

L’obiettivo primario del nostro progetto di ricerca è la comprensione di specifici eventi apoplastici che orchestrano processi di crescita e differenziamento associati allo sviluppo e meccanismi che determinano la capacità delle piante di resistere ai patogeni. Recenti evidenze indicano che i sistemi di percezione nell’apoplasto e di trasduzione di stimoli ormonali, o derivati da patogeni (elicitori), condividano elementi comuni e possano regolare vie di segnalazione coordinate. Le piante si basano per la difesa contro i patogeni su un sistema immunitario innato, analogo a quello degli animali, che include recettori chinasici con domini extracellulari formati da moduli ricchi in leucina (LRR-RLK) implicati nel riconoscimento degli elicitori. Questi includono i “profili molecolari associati ai patogeni” (PAMP) quali la chitina fungina e la flagellina batterica. Gli oligogalatturonidi (OG) sono elicitori di derivazione vegetale (HAMP) rilasciati dall'omogalatturonano della parete cellulare ad opera delle poligalatturonasi (PG) secrete dai patogeni durante le prime fasi di infezione. La formazione di OG è favorita da inibitori proteici delle PG (PGIP) presenti nella parete della cellula vegetale. Gli OG regolano alcuni importanti processi di sviluppo antagonizzando l’azione dell’auxina, e condividono con i PAMP vie di trasduzione e risposte di difesa. L'attivazione del sistema immunitario attraverso il riconoscimento specifico degli elicitori innesca una risposta di difesa multi-componente che si associa a importanti cambiamenti dell’apoplasto, e in particolare dello stato redox e della composizione e struttura. La produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) è un evento essenziale e comune alla risposta immunitaria e ai processi di differenziamento associati allo sviluppo. Un ruolo importante nel controllo dello stato redox della parete cellulare è svolto dalle ammino ossidasi (AO) apoplastiche, una famiglia di enzimi che ossida le poliammine con produzione di perossido di idrogeno, che include AO a rame (CuAO) e poliammino ossidasi flaviniche (PAO). Inoltre, le caratteristiche funzionali e di regolazione suggeriscono un ruolo importante nell’omeostasi redox apoplastica di un citocromo b di plasmalemma ad alto potenziale, Air12. D’altra parte, eventi secretori ed endocitotici svolgono un ruolo cruciale nella difesa, nella crescita e nel differenziamento, per l’assemblaggio, il rimodellamento o il rafforzamento della parete. Cinque unità di ricerca, che hanno sviluppato strumenti unici ed esperienza nello studio della formazione e controllo dell’apoplasto e delle interazioni pianta-patogeno e che hanno una consolidata esperienza in ambiti complementari, si integreranno per raggiungere i seguenti obiettivi specifici:
A) Identificare il recettore degli OG sia mediante un approccio di genetica inversa basato sull’analisi di mutanti KO per RLK, che un approccio biochimico/proteomico, utilizzando OG marcati. Produrre e caratterizzare recettori chimerici basati su FLS2 e EFR, i recettori LRR-RLK dei PAMP flagellina ed EF-Tu, rispettivamente, come sistema modello per affrontare poi lo studio del recettore degli OG. Caratterizzare gli “hot spots” per l’interazione PG-PGIP ed i determinanti strutturali dell’interazione di FLS2 con flg22, un peptide derivato dalla flagellina. Identificare elementi chiave della via di trasduzione attivata dagli OG, ancora ignota e indipendente da salicilato, jasmonato ed etilene, mediante analisi di mutanti, e determinare se l’induzione di miRNA è alla base dell’antagonismo OG/auxina.
B) Definire il ruolo di CuAO, PAO e Air12 nella regolazione redox nel contesto dello sviluppo e difesa. In particolare caratterizzare strutturalmente e funzionalmente queste proteine, e studiarne il ruolo utilizzando mutanti KO. Chiarire le relazioni funzionali tra AO, Air2 e gli elementi coinvolti nella segnalazione mediata dagli OG e dai brassinosteroidi, mediante l’analisi, durante lo sviluppo ed in risposta a stress biotici ed abiotici, di mutanti KO e doppi mutanti KO ottenuti per incrocio durante questo progetto.
C) Dissezionare i meccanismi di secrezione ed endocitosi associati all’immunità innata ed ai processi di sviluppo mediante i) l’ottenimento di marker proteici fluorescenti per la definizione del “sorting” di proteine coinvolte nella formazione e il rimodellamento della parete e nella trasmissione del segnale mediato da PAMP/HAMP, ii) la determinazione del sorting nell’apoplasto e l’eventuale endocitosi di Air12, AO, dei recettori dei PAMP e degli OG e dei recettori chimerici dopo stimolazione specifica e non, iii) la caratterizzazione delle interazioni funzionali di alcune sintaxine e Rab negli eventi che regolano la secrezione e l’endocitosi di questi recettori, iv) la delucidazione del ruolo della N-glicosilazione e delle ancore GPI nei processi di secrezione ed endocitosi delle proteine indotte da PAMP e OG, e di quelle che regolano lo stato redox dell’apoplasto. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Riccardo Angelini Università degli Studi ROMA TRE

Obiettivo del Programma di Ricerca

L’obiettivo primario di questo progetto di ricerca è di chiarire specifici eventi apoplastici che orchestrano processi di crescita e differenziamento associati allo sviluppo con i meccanismi che determinano la capacità delle piante di resistere ai patogeni. L’evidenza che il co-recettore dei brassinosteroidi BAK1 sia necessario per la funzione di recettori coinvolti nell’immunità innata nella percezione nell’apoplasto di elicitori, quali i pattern molecolari associati ai patogeni (PAMP), e che questa interazione sia alla base di un processo di regolazione integrata della crescita e delle risposte di difesa, propone una nuova ottica di studio nell’ampio campo di ricerca che analizza i meccanismi fondamentali dello sviluppo e dell’immunità innata delle piante. Il dualismo difesa/sviluppo concerne anche gli elicitori di derivazione vegetale (HAMP: Host-Associated Molecular Patterns) quali gli oligogalatturonidi (OG). Gli OG, che regolano alcuni importanti processi di sviluppo e condividono con alcuni PAMP vie comuni di attivazione di risposte di difesa, sono rilasciati dall'omogalatturonano della parete cellulare ad opera delle poligalatturonasi (PG), secrete dai patogeni durante le prime fasi di infezione, grazie alla modulazione da parte di inibitori proteici apoplastici [PG inhibiting proteins (PGIP)]. Anche la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) rappresenta una risposta comune all’attivazione dei meccanismi di difesa (PAMP e HAMP inducono burst ossidativo) e ai processi di differenziamento associati allo sviluppo, che sono inoltre intimamente connessi con i processi secretori ed endocitotici. La comprensione biochimico-strutturale e funzionale di questa rete di connessioni è fondamentale per lo sviluppo di programmi di miglioramento genetico per aumentare la resistenza delle piante alle malattie ed agli stress ambientali.
OBIETTIVI SPECIFICI
A) IDENTIFICAZIONE DEL RECETTORE E DELLA VIA DI SEGNALAZIONE DEGLI OG, CARATTERIZZAZIONE STRUTTURALE DELLE INTERAZIONI PG-PGIP E DELLE PROTEINE CHE MEDIANO IL RICONOSCIMENTO DEI PAMP E HAMP. Il recettore degli OG, in analogia con la maggior parte dei recettori del sistema immunitario innato delle piante e ai recettori dei frammenti di ialuronano negli animali, potrebbe contenere un dominio extracellulare formato da moduli ricchi in leucina (LRR) ed appartenere alla sottofamiglia LRR-RLK (receptor like kinase), che comprende 235 membri in Arabidopsis. Verrà quindi adottato un approccio di genetica inversa; inoltre, poiché è possibile che gli OG siano percepiti da recettori non-LRR, verrà adottato anche un approccio biochimico/proteomico, utilizzando OG marcati. Si intende inoltre identificare elementi chiave della trasduzione del segnale mediato dagli OG e le basi molecolari e il significato biologico del noto antagonismo auxina/OG. Saranno inoltre i) analizzati i determinanti strutturali di interazione tra FLS2, un LRR-RLK coinvolto nella percezione della flagellina batterica, e flg22, un peptide da questa derivato, e le dinamiche cellulari di questa classe di recettori ii) caratterizzati LRR-RLK chimerici come sistema di studio del recettore degli OG, iii) identificati e caratterizzati gli “hot spots” per l’interazione PG-PGIP,
B) CARATTERIZZAZIONE STRUTTURALE E DETERMINAZIONE DEL RUOLO DI PROTEINE APOPLASTICHE O DI PLASMALEMMA COINVOLTE NELLA REGOLAZIONE REDOX DELL’APOPLASTO NEL CONTESTO DELLO SVILUPPO E DIFESA. Per comprendere come la produzione di ROS sia regolata nel contesto di regolazione reciproca tra risposte di difesa con lo sviluppo è necessario caratterizzare i singoli sistemi e chiarirne le loro interazioni funzionali. Obiettivo caratterizzante del progetto è la caratterizzazione strutturale e lo studio del ruolo delle ammino ossidasi a rame e delle poliammino ossidasi flaviniche apoplastiche che svolgono un ruolo cruciale nella produzione di perossido di idrogeno necessario nei meccanismi di difesa ed alla formazione di cross-links fondamentali nell’architettura del compartimento apoplastico durante la crescita ed il differenziamento associati ai processi di sviluppo. Si determinerà inoltre il ruolo di Air12, un citocromo b apoplastico ad elevato potenziale, nella regolazione dello stato redox dell’apoplasto. Air12, potrebbe essere coinvolto nel ripristino dell’ascorbato ridotto nella parete cellulare, ma necessita di altri partner proteici per determinare un trasporto redox trans-membrana. Si cercherà quindi di individuare i potenziali interattori di Air12, quali la flavoproteina FQR1, l’ossidasi a rame SKU ed una proteina transmembrana che contiene un dominio citocromo b561 e il dominio citocromico DOMON di Air 12 (CY-DOM). Si intende determinare se Air12, la NADPH ossidasi di plasmalemma e le ammino ossidasi intervengono nel burst ossidativo indotto dagli OG e sono componenti della via di trasduzione attivata da questi elicitori. Obiettivo strategico sarà inoltre quello di chiarire le relazioni funzionali tra ammino ossidasi, Air12 e le proteine coinvolte nella segnalazione degli OG e dei brassinosteroidi, nel corso dello sviluppo ed in risposta a stress biotici ed abiotici.
C) DISSEZIONE DEI MECCANISMI DI SECREZIONE ED ENDOCITOSI ASSOCIATI AI MECCANISMI DI DIFESA ED AI PROCESSI DI SVILUPPO. Eventi secretori ed endocitotici svolgono un ruolo fondamentale nell’assemblaggio ed il rimodellamento della parete durante la crescita ed il differenziamento associati allo sviluppo, come esemplificato nella formazione dell’apoplasto in cellule polarizzate o durante il differenziamento secondario, e nell’attivazione dell’immunità innata. Il sorting differenziale verso specifici subdomini della membrana plasmatica attraverso il Trans Golgi Network, come anche l’endocitosi, richiede la formazione di popolazioni di vescicole distinte con specifici targets ed il coinvolgimento delle proteine SNARE e RabGTPasi. Nell’ottica di dissezionare queste complesse reti di eventi nel contesto dei processi di crescita e differenziamento associati allo sviluppo e dell’immunità innata saranno realizzati i seguenti obiettivi specifici: i) l’ottenimento di marker proteici fluorescenti per identificare il sorting di proteine coinvolte nel formazione e rimodellamento della parete e nella trasmissione del segnale dei PAMP, ii) la determinazione del sorting nell’apoplasto e l’eventuale endocitosi, delle proteine Air12, delle ammino ossidasi e dei recettori dei PAMP e OG in seguito alla stimolazione specifica e non, iii) la caratterizzazione delle interazioni funzionali di alcune SNARE con Rab negli eventi che regolano la secrezione e l’endocitosi di tali recettori, iv) la delucidazione del ruolo della N-glicosilazione, delle ancore GPI nei processi di secrezione ed endocitosi delle proteine indotte da PAMP e OG.
Per superare i notevoli problemi concettuali e metodologici intrinseci alla complessità di questi obiettivi, cinque unità di ricerca, che hanno sviluppato negli anni passati strumenti unici ed esperienza nello studio della formazione e controllo dell’apoplasto e delle interazioni pianta-patogeno, si integreranno per raggiungere gli obiettivi specifici sopra descritti. Queste unità di ricerca hanno una consolidata esperienza in ambiti complementari della biochimica, proteomica, patologia vegetale, biologia e genetica molecolare, biologia strutturale e bioinformatica. Gran parte delle attività verranno sviluppate in stretta collaborazione e compartecipazione di protocolli, strumenti, costrutti plasmidici, materiali biologici e sonde fluorescenti. Alcune metodologie avanzate come espressione eterologa in cellule eucariotiche, microscopia confocale, proteomica, Real-time PCR, risonanza plasmonica di superficie per gli studi di interazione proteina-proteina associata alla spettrometria di massa (BIA-MS), FRET, MALS-QELS verranno messe in comune realizzando anche l’importante obiettivo di addestramento nella ricerca avanzata dei numerosi giovani ricercatori che partecipano al progetto. <<<

Risultati parziali attesi

OBIETTIVO A. CARATTERIZZAZIONE STRUTTURALE DELLE INTERAZIONI PG-PGIP E DELLE PROTEINE CHE MEDIANO IL RICONOSCIMENTO DEI PAMP E HAMP. STUDIO DELLA VIA DI SEGNALAZIONE REGOLATA DAGLI OG.

A. 1. IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DI “HOT SPOTS” PER L’INTERAZIONE PG-PGIP
-Ci aspettiamo di identificare i requisiti strutturali minimi di PGIP per l’interazione con le diverse PG fungine.
-Ottenimento di mutanti di PGIP2 in grado di inibire PG che attualmente PGIP2 non riconosce.

A. 2. CRISTALLIZZAZIONE DEL COMPLESSO PG-PGIP2: UN APPROCCIO CHIMERICO
-L’aspettiva minima è quella di ottenere cristalli che diffrangano del complesso PG-PGIP e possibilmente di risolvere la struttura nei limiti temporali del progetto

A. 3. ANALISI STRUTTURALE DELL’INTERAZIONE FLS2-FLG22
-Il risultato atteso minimo sarà di aver ottenuto per la fine del progetto un sistema di espressione eterologa e di purificazione di FLS2-LRR e di aver testato su questo costrutto l’intero screen di prove di cristallizzazione in nostro possesso, sia per FLS2-LRR da sola che in complesso con flg22.
-Eventuali analisi cristallografica di FLS2-LRR sia da sola che in complesso con flg22.
- Disponibilità di costrutti per l’espressione di 2 recettori chimerici FLS2/EFR, fusi e non con GFP, e di piante transgeniche di Arabidopsis ecotipo Wassiliewskija (Ws, che normalmente non risponde alla flagellina) che esprimono questi recettori o la fusione FLS2-GFP.
- Disponibilità di piante transgeniche ottenute dalla trasformazione del mutante efr di Arabidopsis ecotipo Columbia con un costrutto per l’espressione della fusione EFR-GFP.
- Informazioni su quale recettore chimerico sia in grado di attivare, dopo riconoscimento di flg22, la cascata di trasduzione tipica di EFR e l’espressione dei geni marcatori.
- Informazioni sui requisiti strutturali per la costruzione di recettori chimerici funzionali.
- Disponibilità di un metodo di preparazione di IWF contenenti OG e di un almeno un saggio per la determinazione degli OG negli IWF.

A. 4. CARATTERIZZAZIONE DELLA VIA DI TRASDUZIONE REGOLATA DAGLI OG
- Informazioni sul coinvolgimento di Et, SA, JA, auxina, RbohD, Air12, AtCuAO1, AtCuAO2, AtPAO1 nell’induzione mediata dagli OG dell’espressione dei geni marcatori e della protezione contro B. cinerea.
- Informazioni sulle caratteristiche dell’antagonismo OG/auxina nella rizogenesi avventizia e nell’induzione della protezione contro B. cinerea (concentrazioni attive di auxina e OG; grado di polimerizzazione degli OG attivi, cinetica temporale dell’azione di OG e auxina).
- Informazioni sulla regolazione dell’espressione del miR393 e dei recettori dell’auxina in risposta agli OG.
- Informazioni sulla risposta agli OG e B. cinerea di piante che sovraesprimono miR393, mutanti nella formazione di miRNA , mutanti nei recettori dell’auxina o altri mutanti auxinici.

A.5. IDENTIFICAZIONE DEL RECETTORE DEGLI OG
- Disponibilità di linee di Arabidopsis KO omozigoti per RLK di tipo LysM e LRR, e per BAK1.
- Informazioni sull’espressione dei geni marcatori in risposta agli OG nelle linee KO per RLK e BAK1.
- Possibilmente, disponibilità di almeno una linea KO per RLK con una risposta alterata agli OG.
- Disponibilità di OG marcati con biotina e fluorofori.
- Informazioni sulla capacità degli OG marcati di indurre l’espressione dei geni marcatori.
- Identificazione di proteine capaci di legare gli OG ad alta affinità
- Disponibilità di mutanti KO doppi e tripli per RLK ottenuti mediante incrocio

OBIETTIVO B. CARATTERIZZAZIONE STRUTTURALE E DETERMINAZIONE DEL RUOLO DI PROTEINE APOPLASTICHE COINVOLTE NELLA REGOLAZIONE REDOX DELL’APOPLASTO

B. 1. CARATTERIZZAZIONE BIOCHIMICA, ANALISI DELLA MODALITA’ DI ESPRESSIONE E STUDI SU MUTANTI INSERZIONALI DI AMMINO OSSIDASI A RAME (AtCuAO) E POLIAMMINO OSSIDASI (AtPAO) APOPLASTICHE IN Arabidopsis thaliana.
-Espressione eterologa e caratterizzazione biochimica delle due CuAO secretorie di Arabidopsis (AtCuAO 1 e AtCuAO2) scelte come oggetto del presente progetto di ricerca.
-Informazioni sulla regolazione dell’espressione di AtCuAO1 ed AtCuAO2 durante lo sviluppo della pianta, in seguito a trattamento con vari ormoni vegetali ed in seguito a ferite e stress biotici.
-Caratterizzazione morfologica e fenotipica, determinazione dei livelli di perossido di idrogeno, lignina e suberina nei mutanti inserzionali di A. thaliana per le due AtCuAO in esame in condizioni di crescita normali o sottoposti a ferimento od infezione fungina.
-Ottenimento di dati ulteriori sulla localizzazione subcellulare di AtPAO 1 e AtPAO5
- Informazioni sulla modalità di espressione di AtPAO1 e AtPAO5
-Caratterizzazione morfologica e fenotipica, determinazione dei livelli di perossido di idrogeno, lignina e suberina nei mutanti inserzionali di A. thaliana per AtPAO1 ed AtPAO5 in condizioni di crescita normali o sottoposti a ferimento o infezione fungina o batterica.
- Espressione di AtPAO5 in sistemi eterologhi
- Cristallizazione e determinazione della struttura di AtPAO1 da sola ed in complesso con inibitori entro la fine del progetto. Per quanto riguarda AtCuAO1 ed AtCuAO2, ci aspettiamo di aver effettuato uno screen delle prove di cristallizzazione per almeno una di esse.

B. 2. STUDI SULLE RELAZIONI FUNZIONALI TRA AMMINO OSSIDASI, LRR-RLK, BAK1, RbohD E Air12
- Informazioni sul coinvolgimento di RbohD, Air 12, BAK1 ed altri LRR-RLK nella produzione di perossido d’idrogeno in condizioni di stress biotico ed abiotico ed in presenza di inibitori specifici delle CuAO e PAO.
-Caratterizzazione di incroci tra mutanti AtCuAO e AtPAO e rbohD in relazione al contributo specifico alla produzione di perossido di idrogeno nell’apoplasto.
-Caratterizzazione di incroci tra i mutanti AtCuAO e AtPAO con mutanti BAK1, o altri LRR-RLK, per verificare se la produzione di perossido di idrogeno derivante da specifiche ammino ossidasi durante lo sviluppo o in seguito a stress è sotto il controllo di vie di segnalazione diverse da quelle mediate da questi recettori.

B. 3. MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI DELLA POLIAMMINO OSSIDASI DI ZEA MAYS (ZmPAO): IMPLICAZIONI NELLA REGOLAZIONE E SECREZIONE
-Identificazione di eventuali isoforme fosforilate della ZmPAO purificata. Identificazione di possibili eventi regolativi dell’attività ZmPAO in vivo associati a eventi di fosforilazione-defosforilazione proteica. Verifica dell’esistenza di siti potenziali di S-nitrosilazione della ZmPAO e dell’effetto della S-nitrosilazione sui livelli di attività enzimatica.
-Verifica dell’esistenza in vivo di isoforme fosforilate o nitrosilate della ZmPAO.
-Determinazione di eventuali effetti della formazione del ponte disolfuro sull’attività enzimatica
-Comprensione del ruolo svolto dalle cisteine e dall’N-glicosilazione sul trasporto della ZmPAO nell’apoplasto.

B. 4. CARATTERIZZAZIONE BIOCHIMICA E STRUTTURALE DI Air12 E LOCALIZZAZIONE IN PIANTA
-Ottenimento di Air12 ricombinante purificata in forma nativa e rispettivi anticorpi.
-Descrizione delle principali proprietà funzionali di Air12 di soia in vitro.Sulla base delle caratteristiche di Air12 e di proteine note che contengono il dominio DOMON, definizione delle principali proprietà di questa nuova famiglia di citocromi.
-Espressione di Air12 in sistemi eterologhi come ad esempio Pichia pastoris per la purificazione di quantità sufficienti ad effettuare uno screen di prove di cristallizzazione completo.
-Clonaggio del promotore di Air12 di Arabidopsis e produzione di piante transgeniche di Arabidopsis con gene reporter GUS sotto il controllo del promotore endogeno di Air12
-Definizione delle condizioni, dei tessuti e degli stadi di sviluppo in cui Air12 è maggiormente espressa
- Informazioni sulla regolazione di Air12 durante la rizogenesi avventizia indotta da auxina in espianti fogliari di Arabidopsis.
- Informazioni sulla regolazione di Air12 in risposta agli OG e B. cinerea.
- Informazioni sul coinvolgimento di Et, SA, JA, auxina, RbohD, nell’induzione dell’espressione di Air 12 mediata da OG e B. cinerea

B. 5. CARATTERIZZAZIONE FENOTIPICA DI MUTANTI di ARABIDOPSIS KO PER Air12 E POTENZIALI INTERATTORI
- Isolamento linee T-DNA omozigoti per Air12, FQR1, SKU5
- Caratterizzazione fenotipica delle linee mutanti omozigoti
- Informazioni sulla produzione di perossido d’idrogeno indotta da OG, flg22 e B. cinerea.
- Informazioni sulla suscettibilità a B. cinerea.
- Informazioni sulla capacità di espianti fogliari delle piante KO di formare radici avventizie in risposta all’auxina.
- Recupero del fenotipo wild type di linee T-DNA omozigoti per Air12, FQR1 e SKU5
mediante reintroduzione dei rispettivi geni
- Ottenimento mutanti multipli per incrocio

B. 6. RICERCA DI PARTNER DI Air12
- Messa a punto di protocollo di purificazione di raft lipidici da radici di soia
- Individuazione di eventuali interattori di Air12
- Produzione di piante transgeniche di soia che esprimono Air12-HA
- Espressione e purificazione di interattori di Air12 in forma ricombinante
- Ricostituzione dei complessi, stechiometria e analisi funzionale dell’attività redox

OBIETTIVO C. DISSEZIONE DEI MECCANISMI DI SECREZIONE ED ENDOCITOSI ASSOCIATI AI MECCANISMI DI DIFESA ED AI PROCESSI DI SVILUPPO

C. 1. COSTRUZIONE DI NUOVI MARKER FLUORESCENTI PER LO STUDIO DEL RIMODELLAMENTO DELLA PARETE E DEI PROCESSI DI ESO/ENDOCITOSI DEI RECETTORI DEI PAMP E HAMP
- Disponibilità di costrutti per l’espressione delle proteine di fusione CslAO2-GFP, CesA6-GFP, Air12-GFP, PAO-GFP
- Informazioni sulla loro localizzazione e dinamica in protoplasti e foglie di tabacco agroinfiltrate.
- Conoscenza della dinamica di internalizzazione ligando-dipendente e in risposta agli OG delle proteine di fusione FLS2-GFP, EFR-GFP, FLS2/EFR-GFP in protoplasti, foglie di tabacco agroinfiltrate, plantule e piante transgeniche di Arabidopsis.
- Informazioni sulla possibilità di ottenere un blocco differenziale del traffico endocitotico delle proteine di fusione FLS2-GFP, EFR-GFP, FLS2/EFR-GFP in presenza di tyrphostin A23 e BFA, e il possibile accumulo in prevacuoli o endosomi.
- sovraespressione del costrutto di fusione CslAO2-GFP e verifica dell’attività mannano sintasica.
- Informazioni sull’ eventuale internalizzazione del costrutto PGIP2-GFP in risposta a OG e la sua differenziale inibizione con tyrphostin A23 e BFA.

C. 2. RUOLO DI UN’ANCORA DI GLICOSILFOSFATIDILINOSITOLO E DELLA N-GLICOSILAZIONE NEGLI EVENTI DI TARGETING, SECREZIONE ED ENDOCITOSI
- Informazioni sul traffico nel RE e/o nel Golgi, membrana plasmatica e/o l’apoplasto delle proteine di fusione PGIP2-GFP, CslAO2-GFP, CesA6-GFP, Air12-GFP, PAO-GFP, FLS2-GFP, EFR-GFP, FLS2/EFR-GFP in presenza di un inibitore della sintesi dell’ancora GPI
- Informazioni sulle variazioni del traffico alla membrana plasmatica o della internalizzazione di PGIP2-GFP, CslAO2-GFP, CesA6-GFP, Air12-GFP, PAO-GFP, FLS2-GFP, EFR-GFP, FLS2/EFR-GFP in risposta a flg22 o OG in presenza di inibitori della glicosilazione.
- Informazioni sulle variazioni della secrezione del mutante ZmPAO Asn105Ser-GFP.
- Informazioni sull’eventuale internalizzazione degli OG marcati con fluorofori.

C. 3. DISSEZIONE DEI MECCANISMI DI SECREZIONE ED ENDOCITOSI ATTRAVERSO L’USO DI MUTANTI DOMINANTI NEGATIVI (DN)
-Messa a punto di un saggio in vivo per la caratterizzazione funzionale del ruolo di SYP121 e SYP122 nel sorting di PGIP2-GFP, CslAO2-GFP, CesA6-GFP, Air12-GFP, PAO-GFP.
- Disponibilità di mutanti DN delle RabGTPasi (Rab11a, RabA2, RabA3, RabA5 e RabF2) che blocchino in maniera differenziale l’esocitosi, l’endocitosi e il traffico endosomiale dei
nuovi marker sviluppati nel programma.
-Ottenimento di fusioni tra GFP e frammenti C- o N-terminali di PGIP2 e ZmPAO per stabilire i domini significativi per il targeting alla parete.

INTERESSE PER L'AVANZAMENTO DELLA CONOSCENZA E LE EVENTUALI POTENZIALITÀ APPLICATIVE

La conoscenza dei meccanismi molecolari dell’integrazione nell’apoplasto di processi che regolano differenziamento e sviluppo e l’immunità innata degli organismi vegetali ha importanti ricadute sia a livello del progresso delle conoscenze biologiche sia a livello della loro applicazione nel miglioramento genetico di specie di interesse agronomico per la resistenza alle malattie. Inoltre si ravvisano altre importanti ricadute sia in ambito industriale che nell’addestramento alla ricerca avanzata, con conseguenti influenze sulla competitività e possibilità di impiego:

A) Costruire una solida base di conoscenze per il miglioramento di specie di interesse agronomico per renderle più resistenti ai patogeni ed altri stress con il conseguente minor uso di sostanze chimiche per controllare malattie o stress ambientali.
Le perdite di prodotto pre e post- raccolta conseguenti alle malattie provocate da agenti fitopatogeni o da stress di vario tipo ammonta fino al 40% per alcune specie importanti dal punto di vista agronomico. Per limitare queste perdite, ingenti quantità di pesticidi od altri tipi di sostanze chimiche sono utilizzati con effetti deleteri sugli ecosistemi. Lo sviluppo di nuove colture con migliorate caratteristiche di resistenza alle malattie potrà ridurre il ricorso all’uso di fungicidi ed altre sostanze in pre- e post-raccolta con benefici importanti per l’ambiente. Sebbene la capacità di resistenza a vari agenti patogeni sia stata introdotta in molte colture attraverso i programmi di miglioramento genetico, ciò non è stato possibile per molti altri agenti e c’è un impellente bisogno di aumentare le conoscenze dei meccanismi molecolari della resistenza anche in relazione al rapporto esistente con i processi di sviluppo dell’organismo vegetale. I componenti delle UR hanno fornito contributi importanti alle recenti scoperte sul ruolo dell’apoplasto, la prima linea di difesa delle piante contro i microrganismi patogeni, nelle interazioni molecolari ospite-patogeno, nella caratterizzazione strutturale delle proteine della parete cellulare e della membrana plasmatica coinvolte in queste interazioni, nella regolazione dello stato redox di questo compartimento, nel sistema di esocitosi/endocitosi coinvolto nella formazione e rimodellamento della parete cellulare durante lo sviluppo e nel corso dell’attacco da parte dei patogeni. Lo sviluppo di piante modello mutate nei recettori dei PAMP e HAMP, in componenti chiave del macchinario redox della parete cellulare e della membrana plasmatica, del sistema di esocitosi/endocitosi in associazione alla caratterizzazione funzionale dei geni coinvolti nella trasduzione del segnale dei PAMP e HAMP fornirà una solida base di conoscenze per lo sviluppo di colture con resistenza durevole e ad ampio spettro.

B) Sviluppare la ricerca industriale.
Un numero crescente di Industrie e PMI sta sorgendo in Italia ed Europa per sfruttare le opportunità nascenti dagli studi avanzati in campo biochimico, genetico molecolare e fisiologico della parete cellulare vegetale e dell’immunità innata delle piante (industrie agro-alimentari, fibre, bio-energia etc). Queste realtà industriali rappresentano potenziali utilizzatori delle metodologie avanzate messe a punto nell’ambito del progetto.

C) Uso industriale di prodotti e nuove possibilità di sviluppo
La consapevolezza, tra i potenziali utilizzatori industriali, degli obiettivi, prodotti e metodologie del progetto può produrre importanti ricadute. Gli utilizzatori industriali possono infatti prefigurare nuove possibilità di sviluppo e di impiego per soddisfare la crescente richiesta di prodotti “environment-friendly” e di biomassa vegetale per molteplici applicazioni.

D) Addestramento alla ricerca avanzata
L’addestramento ricerca avanzata di giovani ricercatori rappresenta una ricaduta importante sia in termini di competitività che di possibilità di impiego. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

L’apoplasto delle cellule vegetali, costituito principalmente dalla parete cellulare e dall’interfaccia membrana plasmatica/parete, è sede di importanti eventi di percezione e segnalazione sia di stimoli endogeni associati ai processi differenziativi e di sviluppo che stimoli esogeni associati agli stress biotici ed abiotici (23, 41). Recenti evidenze sperimentali indicano che i sistemi deputati alla percezione e trasduzione di questi stimoli siano spesso associabili e possano orchestrare vie di segnalazione che regolano in modo coordinato processi di differenziamento e risposte di difesa (11).

L’IMMUNITA’ INNATA.
In assenza di un sistema immunitario adattativo, le piante si basano per la difesa contro i patogeni su un sistema immunitario innato, analogo a quello identificato negli animali (36). Elementi principali di questo sistema sono i recettori codificati dalla linea germinale (PRR); questi sono implicati nel riconoscimento di molecole prodotte dal patogeno e definite "elicitori" (elicitori generici ed elicitori pianta-genotipo specifici). Gli elicitori generici includono i cosiddetti pattern molecolari associati ai patogeni (PAMP) quali la chitina fungina, la flagellina batterica. Gli oligogalatturonidi (OG), elicitori di derivazione vegetale (HAMP: Host-Associated Molecular Patterns), sono invece rilasciati dall'omogalatturonano della parete cellulare ad opera delle poligalatturonasi (PG) secrete dai patogeni durante le prime fasi di infezione (42). L'accumulo di OG è favorito dall'interazione delle PG con specifici inibitori (PGIP: inibitori proteici delle PG) (14, 17). Le PGIP sono proteine ricche di leucina (LRR) localizzate nella parete cellulare (16) che, oltre ad interagire con le PG, sono in grado di interagire con gli OG grazie ad una serie di cariche positive regolarmente distribuite (47). Il trattamento con OG protegge dall’infezione contro Botrytis cinerea attraverso una via di trasduzione indipendente dall’etilene (Et), dall’acido jasmonico (JA) e dall’acido salicilico (SA) (18) ed ancora poco nota. Nel corso di un precedente progetto PRIN, analisi del trascrittoma di Arabidopsis hanno mostrato che le risposte precoci (1 h) agli OG e al peptide flg22, corrispondente ad una regione conservata della flagellina e considerato un tipico PAMP, sono ampiamente sovrapponibili (&gt;98%), mentre quelle più tardive (3 e 6 h) divergono notevolmente, con l’espressione di almeno 4000 geni regolata solo da flg22. Nulla è noto sulla percezione degli OG. Poiché i PRR implicati nel riconoscimento dei PAMP sinora caratterizzati sia nelle piante che negli animali sono recettori chinasici caratterizzati da domini extracellulari LRR (LRR-RLK) (36), il recettore degli OG potrebbe essere un recettore con domini LRR.

I RECETTORI DELL’IMMUNITA’ INNATA INTERAGISCONO CON RECETTORI COINVOLTI NELLA REGOLAZIONE DEI PROCESSI DI SVILUPPO.
II domini LRR sono presenti anche nei recettori di Drosophila (Toll) e dei mammiferi (Toll-Like receptor) implicati sia nell'immunità innata (37) che nella regolazione dei processi di sviluppo (44). Anche nel caso dei recettori dei PAMP nelle piante è stato recentemente dimostrato che vi sia un punto comune di regolazione tra le risposte di difesa ed i processi che regolano lo sviluppo (11). Il sistema di percezione vegetale per i PAMP è esemplificato dal sistema di riconoscimento della flagellina (e flg22) da parte di FLS2, un recettore chinasico con un dominio extracellulare composto da 28 ripetizioni LRR ed un dominio intracellulare chinasico (21). FLS2 si associa con BAK1, il co-recettore chinasico dei brassinosteroidi (BR), nelle fasi iniziali dell’infezione batterica stimolando le risposte di difesa (11). BAK1 può eterodimerizzare anche con il recettore chinasico BRI1 e intervenire nella regolazione dello sviluppo mediato dai BR, nel controllo BR-independente della morte cellulare programmata (25) e nella percezione dei danni da ferita, essendo BRI1 anche in grado di legare la sistemina, un HAMP peptidico coinvolto nella segnalazione sistemica del danno (53). Non è noto se anche per gli OG siano operanti queste interazioni anche se è molto probabile, vista la capacità di queste molecole di regolare sia risposte di difesa che processi di sviluppo. Infatti, è stato dimostrato che gli OG hanno attività antagonistica nei confronti dell’auxina (7, 32). Recentemente è stata riportato che flg22 interferisce con la segnalazione mediata da auxina attraverso la soppressione dell’espressione dei recettori di questo ormone mediata dal microRNA miR393 (34). La cooperazione tra i recettori degli HAMP e PAMP con i recettori ormonali costituisce probabilmente una strategia evolutiva volta ad orchestrare i processi di difesa nei confronti dei patogeni e quelli differenziativi e di sviluppo dell’organismo vegetale operando meccanismi di percezione e trasduzione coordinati.

L'ALTERAZIONE DELLO STATO REDOX DELL’APOPLASTO E’ UN ELEMENTO COMUNE DELL'IMMUNITA' INNATA E DEI PROCESSI DI CRESCITA E DIFFERENZIAMENTO ASSOCIATI ALLO SVILUPPO.
L'attivazione del sistema immunitario innato attraverso i PRR innesca una risposta di difesa multi-componente che spesso si associa a importanti cambiamenti dello stato redox dell’apoplasto. In particolare la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS, 3) rappresenta una risposta comune all’attivazione dei meccanismi di difesa (PAMP e HAMP inducono burst ossidativo) e ai processi di differenziamento associati allo sviluppo (10, 19, 20, 38, 51). La produzione di specifiche ROS nell’apoplasto è finemente regolata ed ha importanti funzioni quali la regolazione dello stato di rilassamento o irrigidimento della parete cellulare con importanti effetti sulla crescita o sulla sua interruzione, la regolazione del differenziamento della parete cellulare durante lo sviluppo e l’attivazione dei meccanismi di difesa nei confronti dei microrganismi patogeni, inclusa la risposta di ipersensibilità, e l’attivazione dei meccanismi di riparazione delle ferite. La produzione di ROS nell’apoplasto dipende da molteplici sistemi (1, 3) [NADPH ossidasi di membrana, perossidasi, ossalato ossidasi, ammino ossidasi a rame (CuAO; 26), poliammino ossidasi flaviniche (PAO; 8, 49)]. Recenti dati evidenziano in particolare come le ammino ossidasi extracitoplasmatiche svolgano un ruolo cruciale nella produzione di perossido di idrogeno necessario alla formazione di cross-links fondamentali nell’architettura del compartimento apoplastico durante la crescita ed il differenziamento associati ai processi di sviluppo e nei meccanismi di difesa (2, 13, 31, 40, 46, 52). Ad esempio è stato dimostrato che la somministrazione a cellule di tabacco di alfa-difluorometil-ornitina, inibitore specifico della biosintesi delle poliammine, blocca la produzione di perossido di idrogeno indotta da criptogeina, un elicitore batterico che provoca burst ossidativo e PCD (54). Inoltre cellule di tabacco trasformate con un costrutto esprimente un RNAi in grado di sopprimere l’espressione di una PAO apoplastica, se trattate con criptogeina, non producono perossido di idrogeno e non vanno incontro ai processi di morte cellulare programmata (54). Nella pianta modello Arabidopsis thaliana sono presenti 10 geni codificanti CuAO, di cui due, At4g14940 (AtCuAO1) e At1g62810 (AtCuAO2), che codificano proteine apoplastiche. AtCuAO1 è espressa durante le fasi precoci di sviluppo del tessuto xilematico (33). Dati di microarray indicano che l’espressione di AtCuAO1 è indotta BR e acido jasmonico mentre AtCuAO2 da BR, infezioni con Pytophtora infestant e Botrytis cinerea (dati non pubblicati UR II). In Arabidopsis sono presenti cinque geni codificanti PAO (AtPAO1-5) (50). AtPAO1 ha una elevata omologia di sequenza con una PAO di tabacco (NtPAO) che è stato dimostrato essere apoplastica e coinvolta nella produzione di perossido di idrogeno durante la risposta di ipersensibilità indotta da TMV (54) o da criptogeina (55). AtPAO2-4 hanno una localizzazione perossisomiale mentre per AtPAO5 non è evidente nessun segnale di localizzazione specifica.
L’acido ascorbico ha un ruolo fondamentale nella regolazione dello stato redox dell’apoplasto e quindi nella regolazione dei processi descritti. Non è nota l’esistenza di sistemi enzimatici della parete cellulare di ripristino dell’ascorbato ridotto. I citocromi di tipo B del plasmalemma (5, 39) potrebbero trasferire elettroni da donatori intracellulari al deidroscorbato apoplastico. L’unico citocromo di questo tipo finora individuato è Air12 (dati non pubblicati dell’UR IV), una proteina solubile ancorata al lato esterno della membrana mediante un’ancora GPI (9). Questo citocromo interagisce con l’ascorbato, ma necessita di altri partner proteici per determinare un trasporto redox trans-membrana. Proteine redox che contengono il dominio citocromico di Air12 (detto DOMON; 4) fuso con altri domini di tipo redox sono noti in diversi organismi e suggeriscono che tra i possibili interattori di Air12 (15, 30) possano esserci i citocromi CY-DOM (che comprendono un dominio citocromo b561 e un dominio DOMON). I citocromi b561 sono proteine transmembrana (22, 39) il cui dominio redox è in grado di trasferire elettroni dall’ascorbato al monodeidroascorbato o ad altri accettori elettronici attraverso il doppio strato lipidico (48). Altri possibili interattori sono la flavoproteina FQR1 (27) e l’ossidasi a rame SKU5, entrambe trovate in associazione con Air12 nelle preparazioni di rafts lipidici. La possibile associazione funzionale tra Air12, FQR1 e SKU5 è ulteriormente supportata dal fatto che i tre geni sono indotti in modo e tempi simili da auxina nelle radici laterali in formazione (27, 28, 35). L’espressione del gene Air12 è indotta sia da OG che da B. cinerea come indicato dalle analisi trascrittomiche di Arabidopsis condotte dall’UR II.

SECREZIONE DI SPECIFICHE MACROMOLECOLE NELL’APOPLASTO ED ENDOCITOSI SONO PROCESSI INTEGRATI NEGLI EVENTI DI DIFFERENZIAMENTO ASSOCIATI ALLO SVILUPPO E NELL’IMMUNITA’ INNATA.
La notevole dinamicità della parete cellulare dipende dalla funzionalità del sistema di endomembrane dal momento che polisaccaridi e proteine di matrice, sintetizzate rispettivamente a livello di Golgi e di RE, vengono secrete nell’apoplasto via vescicole (24). Eventi secretori ed endocitotici (45) sono importanti per l’assemblaggio ed il rimodellamento della parete durante la crescita ed il differenziamento, come esemplificato nella formazione dell’apoplasto in cellule polarizzate o durante il differenziamento secondario, e nell’attivazione dell’immunità innata. La condizione di un attacco da patogeno rappresenta in particolare una situazione in cui la cellula vegetale richiede una rapida secrezione di grandi quantità di componenti apoplastici. Analisi trascrittomiche mostrano che in Arabidopsis molti geni codificanti per proteine secrete e di membrana plasmatica sono indotti dagli OG e da flg22, come anche geni implicati nella regolazione della secrezione. D’altra parte è stato dimostrato che sia il complesso FLS2/BAK1 che l’eterodimero BRI1/BAK1 sono internalizzati in vescicole endocitotiche in seguito, rispettivamente, a stimolazione con flg22 o BR (43). Il sorting differenziale verso vacuoli litici o di riserva, o verso specifici subdomini della membrana plasmatica attraverso il Trans Golgi Network richiede la formazione di popolazioni di vescicole distinte con specifici targets ed il coinvolgimento delle proteine SNARE e RabGTPasi. E’ diffusa la convinzione che la membrana plasmatica e, di conseguenza la parete, sia la destinazione di default per molte proteine (6, 24). In realtà la secrezione delle macromolecole nell’apoplasto sembra essere un evento molto più complesso, infatti, è stato recentemente evidenziato che proteine marker di secrezione generica (secGFP) e polisaccaridi di parete vengono secreti attraverso vie secretorie differenti (29). L’ottenimento di marker specifici di secrezione e di endocitosi, lo studio del loro dinamismo in risposta ai PAMP ed HAMP, la comprensione del ruolo della N-glicosilazione e delle ancore di glicosilfosfatidilinositolo (GPI) di specifiche proteine coinvolte nella formazione della parete e nella difesa risulta quindi un obiettivo fondamentale per capire i meccanismi molecolari che controllano il rimodellamento dell’apoplasto durante la crescita e in condizioni di stress biotici.

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