RICERCA ITALIANA     

Definizione di un modello di caratterizzazione di Vibrio spp. e Aeromonas spp. in maricoltura, mediante approccio epidemiologico e biomolecolare, ai fini della definizione dei relativi Obiettivi di Sicurezza Alimentare (FSO)

Università degli Studi di Messina

Abstract

Definire la distribuzione, la prevalenza e la concentrazione di uno o più microrganismi agenti di tossinfezione alimentare lungo una filiera rappresenta, a tutt’oggi, uno dei problemi e, allo stesso tempo, degli obiettivi di maggiore interesse nel contesto del nuovo approccio europeo alla sicurezza degli alimenti. Ciò, in quanto, si è reso evidente che gli interventi di sanità pubblica inerenti il settore agro-alimentare diventano tanto più efficaci e ripetibili quanto più fondati su azioni integrate e “distribuite” lungo l’intera filiera produttiva. La definizione di modelli di gestione integrata del rischio in ambito alimentare è, attualmente, per diversi settori, una realtà piuttosto concreta e fondata su numerose evidenze tecnico-scientifiche dalle quali, peraltro, sono scaturite alcune recenti indicazioni regolamentari europee. Nel comparto della maricoltura, invece, le suddette acquisizioni risultano meno approfondite. A tal riguardo, il gruppo di ricerca proponente, già nel 2004-2006 (PRIN 2004), prendendo in considerazione la filiera dell’Orata, aveva messo in evidenza l'elevata frequenza d'isolamento degli Aeromonadi mobili, probabilmente in relazione alla loro ampia possibilità di permanenza nelle acque marine come pure alla recentemente accertata loro capacità di causare patologie condizionate nei pesci. Decisamente più bassa anche se certamente altrettanto interessante, era risultata la prevalenza dei Vibrioni alofili, anch'essi notoriamente diffusi negli ecosistemi marini e capaci di sostenere patologie condizionate nei pesci allevati.
Tali risultati preliminari, inducono a maggiori approfondimenti finalizzati alla realizzazione di un modello di approccio integrato, fondato su metodologie innovative e finalizzato alla caratterizzazione della distribuzione, prevalenza e concentrazione di Aeromonas spp. e Vibrio spp. in Orate e Spigole allevate in diversi impianti del territorio nazionale. A tal fine ed in analogia con il precedente PRIN, tre unità di ricerca (Unità di Base I, II e III), all'uopo già specializzate, si occuperanno dei campionamenti in allevamento e delle preliminari ricerche batteriologiche, sfruttando anche tecniche di PCR messe a punto nel precedente progetto, per l'identificazione del genere. Tali indagini verranno condotte, per quanto attiene al primo anno della ricerca, su più allevamenti (Sicilia, Sardegna e Toscana), cercando di valutare la distribuzione dei microrganismi in oggetto. Nel secondo anno, le stesse unità focalizzeranno la loro attenzione su un solo impianto caratterizzato dal maggiore numero d’isolamenti, al fine di definire la prevalenza dei microrganismi in una singola popolazione ittica (monitorata nel corso di circa 9 mesi), anche in funzione della mortalità e delle altre principali variabili d’allevamento (temperature medie dell’acqua, densità, incremento ponderale, frequenza delle patologie, ecc.). Una quarta unità di ricerca (Unità biomolecolare – IV), sfruttando le proprie specifiche competenze, attuerà più complesse tecniche di biologia molecolare finalizzate all'identificazione di specie e alla caratterizzazione dei fattori di patogenicità, lavorando, preliminarmente, su ceppi certificati e, successivamente, sui ceppi isolati dalle suddette Unità di Base. Nell’ottica della condivisione delle specifiche competenze di ogni Unità di Ricerca, anche l’Unità di Base III metterà a disposizione le proprie peculiarità scientifiche valutando i profili di sensibilità agli antibiotici per un campione rappresentativo dei ceppi isolati dagli altri partecipanti al progetto. Tale studio verrà eseguito mediante valutazione della Minima Concentrazione Inibente (MIC), secondo le linee guida del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2006). Ancora, l’Unità di base I, si occuperà di valutare il comportamento microbico di un campione di ceppi isolati nel corso del progetto, impiegando tecniche consolidate ed acquisite nel corso di precedenti indagini. In particolare si impiegheranno modelli di microbiologia predittiva convenzionali (Barany e Roberts, 1994) per valutare il comportamento dei suddetti batteri in funzione di diversi stressori ambientali, o, ancora, il modello di Lotka-Volterra per la valutazione degli effetti competitivi potenzialmente esercitati dalla flora alterante normalmente presente nei prodotti ittici. I batteri saggiati al tal riguardo saranno rivalutati anche dall’Unità di Ricerca II in termini di modificazione del profilo di sensibilità agli antibiotici, considerato che, come dimostrato da diversi contributi scientifici, gli stressori sub-letali possono indurre modificazioni dell’antibiotico-resistenza dei batteri.
Infine, i risultati globali del progetto saranno rielaborati per gli aspetti metodologici, epidemiologici, patogenetici e quantitativi, al fine della potenziale proposizione di Obiettivi di Sicurezza Alimentare specifici per Vibrio spp. e Aeromonas spp. nei prodotti della maricoltura. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Alessandro Giuffrida Università degli Studi di MESSINA

Obiettivo del Programma di Ricerca

L’obiettivo finale del progetto riguarda, principalmente, l’approfondimento delle conoscenze epidemiologiche sulla diffusione dei Vibrioni alofili e degli Aeromonadi mobili, potenzialmente agenti di tossinfezione alimentare, nei prodotti della maricoltura e, in particolare, in Spigole ed Orate allevate in diversi impianti italiani di acquacoltura. Più specificatamente, il progetto si propone di caratterizzare i meccanismi che stanno alla base della prevalenza dei suddetti microrganismi in alcune popolazioni ittiche allevate, fornendo, dunque, modelli applicativi per la pianificazione di strategie di controllo più mirate ed efficaci.
Un secondo obiettivo di particolare interesse e funzionalmente connesso al primo riguarda lo sviluppo e/o il perfezionamento di metodiche d’identificazione biomolecolare fondate, in prima istanza, su uno screening genere-specifico mediante PCR e, successivamente specie-specifico, attraverso l’applicazione di una metodica basata sul c.d. “mini-sequenziamento”.
I raggiungimento dei suddetti obiettivi consentirà di esprimere in maniera più corretta la potenziale pericolosità inerente la presenza dei microrganismi in oggetto nei pesci d’acquacoltura marina, specie considerando che a tali risultati verranno associati i seguenti sotto-obiettivi:
- la valutazione della loro patogenicità, sempre mediante l’applicazione di tecniche bio-molecolari innovative (per Vibrio: PCR per l’identificazione dei geni codificanti l’emolisina termolabile – tl -, l’emolisina termostabile – tdh - il fattore correlato alla produzione di tdh – trh -, oltre che la presenza gene toxR, regolatore dell’espressione del gene tdh; per Aeromonas: saranno ricercati i geni codificanti l’aerolisina il GCAT, la serin-proteasi, la nucleasi, la lipasi e i flagelli laterali);
- i profili di antibiotico-resistenza;
- il comportamento (crescita/decremento) in funzione di alcuni stressori ambientali o di competitori microbici, simulando, dunque, alcune delle condizioni di stoccaggio e preparazione/trasformazione post-produzione primaria (modelli di microbiologia predittiva per una specie – Baranyi e Roberts, 1994 – o per più specie in competizione tra loro – Lotka-Volterra, 1968). <<<

Risultati parziali attesi

I risultati attesi riguardano:
- la conoscenza della diffusione dei Vibrioni alofili e degli Aeromonadi mobili, potenzialmente agenti di tossinfezione alimentare, nei prodotti della maricoltura e, in particolare, in Spigole ed Orate allevate in diversi impianti italiani di acquacoltura;
- la messa a punto e/o la verifica dell’attendibilità delle metodologie analitiche volte all’identificazione di genere e specie, per quanto riguarda i Vibrioni alofili e gli Aeromonadi mobili;
- la chiarificazione degli aspetti epidemiologici inerenti le specie batteriche patogene appartenenti ai generi Vibrio e Aeromonas in popolazioni di Spigole e Orate in corso di allevamento e fino al raggiungimento della taglia commerciale;
- la definizione dello spettro di sensibilità agli antibiotici dei suddetti microrganismi, al fine di una più precisa valutazione della pericolosità per il consumatore;
- l’individuazione dei fattori che maggiormente possono incidere nel raggiungimento di concentrazioni batteriche tali da determinare malattie alimentari nell’uomo.

I suddetti risultati potenziali rappresentano un importante elemento di avanzamento delle conoscenze in materia di sicurezza dei prodotti ittici allevati, specie pensando a quanto riportato nel Reg. 2073/2005 UE in relazione alla ricerca quali-quantitativa dei Vibrioni alofili per il quali, anche in accordo con il CSMVSP (Comitato Scientifico per le Misure Veterinarie in relazione con la Salute Pubblica; parere adottato nel 19-20 settembre 2001), sono necessari ulteriori ricerche al fine di introdurre opportuni criteri di sicurezza. Nessun cenno, peraltro, viene fatto per il genere Aeromonas che, invece, stando a precedenti indagini (PRIN 2004), rappresenterebbe un “pericolo” per il consumatore non trascurabile nel settore della maricoltura.
Alla luce di ciò, i risultati attesi derivanti dal presente progetto potrebbero risultare immediatamente fruibili nel contesto:
- della realizzazione di specifici studi di Quantitative Risk Assessment finalizzati anche alla definizione di Obiettivi di Sicurezza Alimentare e di relativi Criteri di Performance;
- dell’individuazione di strategie di monitoraggio e verifica, da parte delle Autorità Competenti adibite al controllo ufficiale degli alimenti di origine animale;
- dell’attuazione di specifiche azioni di gestione del rischio nell’ambito lungo tutta la filiera produttiva di cui, sulla base della nuova regolamentazioni comunitaria, è primariamente responsabile l’Operatore del Settore Alimentare. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

E’ noto che i prodotti della pesca occupano un posto di rilievo nel soddisfacimento dei fabbisogni alimentari dell’uomo. E’, inoltre, ben noto come una parte sempre maggiore di tali fabbisogni sia soddisfatta dai prodotti dell’acquacoltura. Infatti, già nel 2005, a livello mondiale, le catture di prodotti della pesca si sono attestate intorno a 109 milioni di tonnellate di cui circa il 32% derivava dall’acquacoltura (FAO, 2006).
Si sta, infatti, assistendo ad un intenso incremento delle attività di allevamento dei prodotti della pesca che ha coinvolto principalmente i Paesi Asiatici, ma anche l’Europa (Spagna, Francia, Italia, Grecia), specie nel caso dei Salmonidi e, più recentemente, di alcune specie marine (Spigole, Orate ed altre specie di nuova introduzione).
Relativamente agli aspetti igienico-sanitari, detto sviluppo ha determinato, certamente, la nascita di problematiche nuove, che possono complicare non poco le strategie di gestione del rischio da attuare sulla base del nuovo approccio comunitario alla sicurezza degli alimenti. In generale, anche nel caso dei pesci allevati, si può affermare che le loro caratteristiche microbiche, dopo la cattura, sono fortemente dipendenti dalle condizioni ambientali in cui essi vivono (Reilly, 1998); segnatamente, le caratteristiche fisico-chimiche dell’acqua, la vicinanza a zone fortemente antropizzate, la naturale presenza di determinate specie batteriche, gli aspetti quali-quantitativi inerenti l’alimentazione, i metodi di pesca e di trattamento post-cattura, la densità e tutti gli altri potenziali stressori d’allevamento (competizione per il cibo, predazione, patologie, ecc.), possono essere particolarmente influenti al riguardo, condizionando, in alcuni casi, la contaminazione del pescato anche ad opera di microrganismi agenti di tossinfezione alimentare come quelli appartenenti al genere Vibrio e Aeromonas (Balebona et al., 1998; Huss, 1997).
Fino a pochi anni fa, Aeromonas e Vibrio venivano classificati come appartenenti, unitamente a Plesiomonas e Photobacterium, alla famiglia delle Vibrionacee, composta da microrganismi spesso isolati dall'ambiente acquatico ma talvolta anche dall'uomo e dagli animali per i quali alcune specie possono essere patogene (Thompson et al., 2004). Nel 1986 Colwell et al., sulla base delle sequenze dei geni 5S e 16S rDNA e sui risultati dell'ibridazione DNA-rRNA, proposero una nuova classificazione di Aeromonas all'interno della fam. Aeromonadaceae; nel 2006, infine, venne inserito il nuovo ordine Aeromonadales nel Bergey's Manual. All'interno delle rispettive famiglie tuttavia risulta ancora piuttosto difficile identificare rapidamente le specie di interesse sanitario, in quanto per il genere Vibrio ci si basa prevalentemente su un set di chiavi per l’identificazione biochimica sviluppato da Alsina e Blanch, 1994, mentre per Aeromonas si è osservata grande eterogeneità fenotipica all'interno delle 14 specie.
Aeromonas spp è frequentemente isolato nel contenuto intestinale dei pesci e la sua presenza non indica infezione in atto. A. hydrophila è un patogeno emergente per l’uomo, nel quale determina malattia a carattere locale o sistemico, anche in soggetti immunocompetenti (25,50). Le manifestazioni cliniche comprendono gastroenterite e colite autolimitanti e forme colera-simili di gravità rilevante (15). La maggior parte dei casi di gastroenterite (&gt;85%) è attribuita ad A. hydrophila, A. sobria e A. caviae. Aeromonas spp può inoltre causare infezioni extraintestinali di considerevole gravità che comprendono batteriemie, meningiti, infezioni polmonari e di origine traumatica (10).
Aeromonas spp sembra inoltre svolgere un ruolo consistente nelle forme di diarrea estiva in soggetti in giovane età, anziani e viaggiatori. Le tossinfezioni alimentari sostenute da A. hydrophila conseguono l’ingestione di cibi contaminati da un elevato numero di cellule (10^6-10^7 UFC/g) (17,18). La patogenicità di A. hydrophila dipende dalla produzione di esotossine (emolisine, enterotossine), citotossine, endotossine, siderofori, invasine, adesine e flagelli (10,29). La produzione di emolisine e enterotossine associate è caratteristica di A. hydrophila e A. sobria.
Fra ceppi patogeni e non patogeni si rilevano differenze di struttura e funzione cellulare, anche se delle basi biochimiche e molecolari devono essere ancora definite. Il ruolo dei plasmidi è accertato nell’espressione dei fattori di virulenza, di patogenicità o dell’antibiotico resistenza, anche in merito al suo trasferimento (39). In ceppi isolati da forme gastroenteriche sono stati rilevati geni che codificano per l’enterotossina citotossica Act, per l’enterotossina citotonica termolabile Alt e per l’enterotossina citotonica termostabile Ast. Il polipeptide di 52 kDa codificato da Act è correlato all’aerolisina ed è dotato di attività emolitica, citotossica ed enterotossica. Questa tossina determina infiltrazioni di monociti e macrofagi nell’intestino degli animali contribuendo ai fenomeni infiammatori e al danno tissutale. I due polipeptidi citotonici determinano un incremento della produzione di AMP (cAMP) e prostaglandine in modelli cellulari (1). I ceppi isolati da patologie intestinali dell’uomo sembrano avere caratteristiche specifiche (1,23,26).
Il genere Vibrio comprende 44 specie di cui 12 possono determinare tossinfezione alimentare, rappresentate principalmente da V. cholerae, V. parahaemolyticus (prevalentemente associati a gastroenteriti) e V. vulnificus (gastroenteriti e forme setticemiche). Altre specie sono patogene per vertebrati ed invetebrati (13). V. mimicus è un patogeno riconosciuto e altre specie sono patogene occasionali per l’uomo, come V. alginolyticus, V. fluvialis, V. furnissii, V. metschnikovii e V. hollisae. Le specie diverse da V. cholerae e V. mimicus sono “alofile” e richiedono per la crescita terreni nei quali sia stato addizionato NaCl. V. cholerae, la specie di riferimento del genere, è l’agente causale del colera, responsabile dei casi a carattere epidemico (21). L’enterotossina CT è il fattore di virulenza principale e l’isola di patogenicità VPI costituisce il sito genico su cui sono allocati la maggior parte dei fattori di patogenicità e il gene regolatore dell’enterotossina CT (27). I ceppi patogeni per l’uomo isolati da casi epidemici appartengono al sierotipi O1 e O139. I ceppi non-O1/O139, coinvolti in modo sporadico in malattie gastroenteriche colera-simili, non producono l’enterotossina CT ma presentano un fattore di virulenza simile e, nei ceppi invasivi responsabili di setticemia, una tossina stabile al
calore. V. cholerae O1 viene trasmesso primariamente per via oro-fecale e indirettamente attraverso acqua contaminata. Il contagio diretto da persona a persona non è comune. Vibrio può pervenire agli alimenti attraverso materiale fecale o per mezzo di acque contaminate. Alcuni casi di tossinfezione derivano dal consumo di prodotti della pesca crudi, poco cotti, contaminati o ricontaminati. Viceversa, i ceppi di V. cholera non-O1/O139 sono comunemente isolati dall’acqua di estuario e dai Molluschi Eduli Lamellibranchi. V. mimicus, incapace di fermentare il saccarosio, è responsabile di casi gastroenterite associati al consumo di prodotti ittici (28). V. parahaemolyticus causa gastroenterite e, occasionalmente, setticemia (21). La differenziazione dei ceppi clinici da quelli ambientali avviene sulla base della presenza di una emolisina termostabile (TDH) e di una emolisina ad essa correlata (TRH) codificate dai geni tdh e trh (43,44). Le tossinfezioni da V. parahaemolyticus sono associate al consumo di pesci e molluschi crudi o di crostacei cotti e soggetti a ricontaminazione. V. vulnificus può determinare setticemia attraverso l’ingestione di prodotti ittici o in seguito all’infezione di ferite della cute, esposte all’acqua di mare contaminata (37). Inoltre V. vulnificus può causare gastroenteriti e infezioni delle vie respiratorie (9). I ceppi sono suddivisi in tre biotipi sulla base di caratteristiche biochimiche e biologiche. I Vibrio alofili vengono isolati dalle acque salmastre costiere, dai sedimenti e dagli organismi marini che vivono negli estuari delle zone temperate (21). Ancora poco studiata è la sensibilità di Vibrio spp alofili e Aeromonas spp nei confronti degli antibiotici e la diffusione di ceppi dotati di antibiotico resistenza singola o multipla (3,45). Standards interpretativi (breakpoints) per la determinazione della sensibilità nei confronti degli antibiotici sono stati pubblicati nel documento M100-S16 del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) per V. cholerae testato nei confronti di un limitato numero di antibiotici (33) e solamente di recente per alcuni ceppi di Vibrio spp (32). Breakpoints specifici per l’interpretazione dell’antibiogramma di altri microrganismi di Vibrio spp ed Aeromonas spp non sono stati pubblicati. Anche i sistemi commerciali automatizzati disponibili non sono stati validati per la determinazione dell’antibiotico resistenza di Vibrio spp. Diversi ceppi di Aeromonas spp sono resistenti alla penicillina, ampicillina, carbenicillina e alla ticarcillina e producono beta-lattamasi (24,42). I ceppi appartenenti al genere Aeromonas si adattano velocemente ai nuovi antibiotici usati comunemente in medicina umana (6, 12,46). La resistenza agli antibiotici degli Aeromonas è mediata a livello cromosomico (16,22,31,47) e alcune specie hanno mostrato la presenza di plasmidi portatori del fattore di resistenza alle tetracicline e di altre beta-lattamasi (7). Aeromonas spp può produrre tre beta-lattamasi compresa una carbapenamasi. In ceppi di Vibrio spp è stata dimostrata la presenza di plasmidi e trasposoni che veicolano fattori di resistenza ai chinoloni, agli aminoglicosidi e alle tetracicline. L’utilizzo empirico degli antibiotici in acquacoltura può determinare selezione di ceppi antibiotico-resistenti (2,48), e, dunque, per una maggiore protezione dell’ambiente e dell’uomo sono state definite definite all’uopo specifiche Buone Pratiche Veterinarie (40). Gli studi sulla sensibilità di Vibrio spp e Aeromonas spp nei confronti di differenti antibiotici sono stati condotti prevalentemente con il metodo Bauer-Kirby (3,19,36,45) piuttosto che mediante microdiluizione in brodo o diluizione in agar (34), tecniche che consentono la diretta valutazione della concentrazione minima inibente (MIC).

La relazione tra Vibrioni alofili, Aeromonadi mobili e prodotti dell’acquacoltura marina non è ampiamente documentata, anche se, per Vibrio spp., è noto come questo venga isolato nei sedimenti delle vasche e nei rotiferi utilizzati per l’alimentazione larvale (Verdonk et al., 1996), e che è, notoriamente, patogeno per diverse specie ittiche marine allevate, cosa che potrebbe rappresentare un fattore di “amplificazione” della sua diffusione. Al riguardo, Balebona et al. (1998), dal 1990 al 1996, hanno condotto un’indagine sulle patologie batteriche di alcuni allevamenti spagnoli, riscontrando una netta prevalenza (67,8%) delle malattie da Vibrio, rispetto a quelle sostenute da Pseudomonas (13,5%), Photobacterium damsela subsp. Piscicida (6,7%), Cytophaga / Flexibacter like bacteria (4,8%) e Aeromonas spp. (0,5%). Lo stesso Yamazaky (1996, in FAO/WHO document, MRA 01/03/04, 2002) ha evidenziato una maggiore prevalenza di Vibrio parahaemolyticus nei pesci allevati rispetto a quelli selvatici. Peraltro una maggiore possibilità di contaminazione da Vibrioni è stata osservata da Sakazaky et al. (1975, in FAO/WHO document, MRA 01/03/04, 2002) nei pesci provvisti di larghe scaglie, come, ad esempio la maggior parte delle specie marine allevate.
In parziale accordo con tali considerazioni risultano i recenti dati ottenuti nel contesto di un precedente progetto di ricerca (PRIN 2004) che ha messo in evidenza, in Orate allevate, la discreta diffusione del genere Vibrio e, soprattutto, l’elevata frequenza d’isolamenti del genere Aeromonas.
Questi ultimi aspetti meritano, certamente, ulteriori approfondimenti in termini epidemiologici, considerato che, almeno in Spagna, il genere Aeromonas viene poco frequentemente isolato dalle Orate allevate, campionate in stato agonico. Inoltre, come detto, relativamente al rischio per il consumatore, sono stati poco o per nulla valutati gli aspetti inerenti i fattori di patogenicità in Aeromonadi mobili isolati dai pesci marini allevati.
Tali informazioni potrebbero contribuire ad affrontare alcune problematiche irrisolte, nel contesto del nuovo approccio comunitario alla sicurezza alimentare, specie pensando a quanto riportato nel Reg. 2073/2005 UE in relazione alla ricerca quali-quantitativa dei Vibrioni alofili per il quali, anche in accordo con il CSMVSP (Comitato Scientifico per le Misure Veterinarie in relazione con la Salute Pubblica; parere adottato nel 19-20 settembre 2001), sono necessari ulteriori ricerche al fine di introdurre opportuni criteri di sicurezza. Nessun cenno, peraltro, viene fatto per il genere Aeromonas che, invece, stando a precedenti indagini (PRIN 2004), rappresenterebbe un “pericolo” per il consumatore non trascurabile nel settore della maricoltura. In relazione a ciò, il percorso scientifico necessario dovrebbe prevedere, oltre che la suddetta valutazione epidemiologica del problema, anche una caratterizzazione probabilistica delle concentrazioni che i patogeni in oggetto potrebbero raggiungere nei prodotti finiti, specie pensando ad Aeromonas hydrophila, capace di moltiplicarsi attivamente sulle superfici dei pesci in corso di stoccaggio a refrigerazione. Per far ciò è necessario sviluppare modelli dinamici di microbiologia predittiva sia in grado, come effettuato da Giuffrida et al. (2007), di tenere in debito conto il potenziale effetto competitivo, sui patogeni, della flora alterante dei pesci, che anche di esprimere in maniera probabilistica le concentrazioni batteriche in funzione della variazione stocastica dei parametri condizionanti al crescita e/o l’inibizione delle popolazioni microbiche considerate.
La realizzazione di tali strumenti renderebbe molto più prestante l’attuazione di modelli di Risk Assessment e, conseguentemente, l’individuazione di Obiettivi di Sicurezza Alimentare (Food Safety Objects) su cui fondare, in maniera coerente, opportuni criteri microbiologici specifici per i prodotti della maricoltura, in relazione ai “pericoli” in oggetto. <<<