RICERCA ITALIANA     

Genomica mitocondriale in diversi gruppi di Metazoi: evoluzione molecolare e strutturale ed utilità filogenetica del genoma mitocondriale

Università degli Studi di Siena

Abstract

Il presente progetto integrato sarà centrato sull’evoluzione del genoma mitocondriale (mtDNA) e sulla sua utilità come marcatore filogeografico e filogenetico in diversi gruppi di Metazoa. Il progetto rappresenta l’attività integrata di 4 Unità Operative (U.O.) coordinate da giovani ricercatori, ma tutte caratterizzate da una notevole tradizione di ricerca sull’evoluzione del mtDNA e da una ragguardevole produzione scientifica nel campo dell’evoluzione molecolare e della filogenesi molecolare basata sul mtDNA.
Da un punto di vista metodologico, lo sforzo principale sarà diretto al sequenziamento di interi genomi mitocondriali in alcune specie di bivalvi, esapodi, pesci e rettili. L’approccio al sequenziamento dei genomi sarà comune a tutte le U.O., e si baserà sull’applicazione della Long-PCR e del sequenziamento shotgun. Verrà anche verificata la possibilità di utilizzare la tecnica della Rolling Circle Amplification. La presenza di una strategia metodologica comune permetterà un’estesa integrazione tra le diverse U.O. e la possibilità di sfruttare in maniera coordinata la sofisticata strumentazione disponibile in ciascuna U.O. Verranno sequenziati 50 nuovi genomi mitocondriali; essi verranno annotati, descritti e depositati in GenBank, rendendoli disponibili all’intera comunità scientifica.
Le specie oggetto di indagine verranno campionate in taxa diversi, secondo gli obiettivi delle analisi filogeografiche e filogenetiche. Nei rettili Geochelone galapagoensis and Varanus komodoensis, verranno campionati, e sequenziati, individui di popolazioni geograficamente isolate. Le sequenze ottenute verranno utilizzate per ricostruire le relazioni evolutive in queste specie a rischio di estinzione, endemiche di due arcipelaghi (le Galapagos e Komodo) che sono andati incontro ad estese modificazione paleogeografiche negli ultimi 5 mya. Questi dati costituiranno inoltre un robusto background scientifico per la pianificazione di strategie gestionali. Nel sottordine Notothenioidei di pesci antartici e subantartici, la genomica mitocondriale sarà usata per ricostruire le relazioni filogenetiche in un gruppo di famiglie la cui evoluzione è stata influenzata dai profondi cambiamenti morfologici e fisiologici avvenuti negli ultimi 25-30 milioni di anni, ed indotti dal lungo processo di adattamento a condizioni ambientali sempre più estreme. L’adattamento all’ambiente antartico verrà anche studiato a livello molecolare attraverso la verifica della presenza di selezione direzionale verso specifici domini funzionali di alcune proteine mitocondriali, ed attraverso lo studio della potenziale compensazione per la perdita di una proteina mitocondriale. Negli esapodi, verranno sequenziate specie dagli ordini di atterigoti Protura, Collembola, Diplura, Microcoryphia e Zygentoma. Un’analisi filogenetica dettagliata permetterà di elucidare le relazioni filogenetiche all’interno dell’ordine Collembola, e di chiarire la posizione di Protura, Collembola e Diplura nell’albero filogenetico dei Pancrustacea. Questa analisi avrà anche l’obiettivo di verificare se Hexapoda e Crustacea rappresentano gruppi monofiletici. Le analisi filogenetiche verranno condotte sfruttando l’informazione filogenetica contenuta nelle sequenze nucleotidiche ed aminoacidiche, e la potenziale informatività dei cambiamenti al gene order mitocondriale. Lo stesso approccio filogenetico verrà sviluppato nei Bivalvia, allo scopo di illustrare le relazioni filogenetiche tra le sue principali linee evolutive. In questo gruppo, i dati mitocondriali disponibili sono assai limitati, ed il nostro studio contribuirà ad estendere il campionamento, fornendo una copertura più esauriente della loro biodiversità. Inoltre, si useranno due specie di bivalvi (Tapes philippinarum e Musculista senhousia) come specie modello per lo studio dei meccanismi molecolari di un modello aberrante di eredità mitocondriale (Doppia Eredità Uniparentale) e del suo significato evolutivo. Tecniche citologiche (microscopia a fluorescenza) e molecolari (PCR Real Time ed ibridazione sottrattiva) verranno utilizzate per chiarire il destino dei mitocondri degli spermi dopo la fecondazione, la distribuzione degli mtDNA maschili e femminili nei diversi tessuti ed in individui di sessi diversi ed il significato funzionale di ambedue i genomi. Questo studio rappresenterà un importante contributo alla comprensione dei meccanismi di eredità mitocondriale negli animali.
Questo progetto ha l’ambizioso obiettivo di raggiungere risultati di rilievo per la comprensione dei meccanismi di evoluzione del genoma mitocondriale e di contribuire alla soluzione di questioni tassonomiche a lungo dibattute in diversi gruppi di Metazoa. Abbiamo anche l’obiettivo di rinforzare il grado di collaborazione tra 4 gruppi di ricerca altamente qualificati e di facilitare la partecipazione di giovani ricercatori (studenti di dottorato e post dottorato) ad un progetto articolato di considerevole valore scientifico. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Francesco Frati Università degli Studi di SIENA

Obiettivo del Programma di Ricerca

La ragguardevole produzione scientifica dei Coordinatori di ciascuna Unità Operativa (si veda il punto 14 ed i Modelli B) assicura che gli ambiziosi obiettivi di questo progetto possano essere raggiunti con successo. L’obiettivo comune è rappresentato dal sequenziamento di interi genomi mitocondriali (mtDNA) in specie di Metazoa. Le sequenze complete dei genomi costituiranno i dati di partenza per la ricostruzione delle relazioni evolutive a diversi livelli tassonomici (filogeografia e filogenesi), per gettare luce sui meccanismi molecolari che regolano l’ereditarietà del mtDNA e per svelare processi di adattamento locale mediati da selezione direzionale.
Questo progetto integrato si basa su un notevole sforzo di sequenziamento, e si prefigge di ottenere la sequenza completa di circa 50 genomi mitocondriali, per un totale complessivo di quasi 1 Gb di informazione nucleotidica. Le sequenze copriranno un’ampia varietà di specie (molluschi, esapodi, pesci e rettili) a diversi livelli tassonomici. Nelle specie di rettili Geochelone elephantopus e Varanus komodoensis, verranno sequenziati individui conspecifici, mentre nel sottordine di pesci nototenioidei si studieranno specie da famiglie diverse. Nei Bivalvia (Mollusca) e negli Hexapoda (Arthropoda), saranno sequenziati individui da famiglie diverse, a loro volta rappresentanti di ordini diversi. Un campionamento così esteso permetterà di valutare l'utilità del genoma mitocondriale come marcatore filogeografico e filogenetico. Inoltre, un obiettivo generale del progetto è rappresentato dallo studio di vari aspetti dell’evoluzione molecolare del mtDNA, quali la composizione nucleotidica, lo sbilanciamento asimmetrico della composizione in basi, i tassi di evoluzione, l’eteroplasmia, il "gene order".
A livello filogeografico, verranno valutate le potenzialità del mtDNA in due sistemi insulari, usando come modelli due specie di rettili minacciati di estinzione: la tartaruga gigante delle Galapagos ed il varano di Komodo. A seguito dell'evoluzione geologica dei loro arcipelaghi, queste due specie si differenziarono dal loro antenato continentale più prossimo in popolazioni isolate. Ambedue le specie presentano un notevole interesse conservazionistico, sebbene in scenari paleogeografici completamente diversi. Infatti, mentre la colonizzazione e la dispersione delle tartarughe delle Galapagos risale a 0.7-3 mya, la vicarianza dovuta a cambiamenti del livello del mare ha influenzato la struttura genica del varano di Komodo durante gli ultimi 140.000 anni. I dati mitocondriali verranno utilizzati per ricostruire gli eventi storici che hanno segnato l’evoluzione di queste popolazioni (colonizzazione, isolamento, frammentazione e riduzione numerica delle popolazioni), attraverso le tracce che questi hanno lasciato sulla loro struttura genetica. Inoltre, questa parte del progetto ha come specifico obiettivo la produzione di dati biologici a supporto dello sviluppo di programmi di gestione, nonché della pianificazione, ove necessario, di interventi di reintroduzione.
Nel sottordine di pesci Notothenioidei, endemici dell’Oceano Antartico, l’obiettivo principale di questo progetto sarà la ricostruzione delle relazioni filogenetiche attraverso il confronto dei genomi mitocondriali in rappresentanti di tutte le famiglie di questo taxon. Questo studio fornirà solide evidenze sperimentali per la ricostruzione degli eventi storici che portarono alla colonizzazione dell’Oceano Antartico da parte di questo gruppo di teleostei.
Ad un simile livello tassonomico, ma con una distribuzione mondiale più vasta, ed una storia evolutiva più antica, un altro obiettivo del progetto verterà sull’analisi delle relazioni filogenetiche tra le principali famiglie dell’ordine di esapodi basali dei Collembola. Questo gruppo cosmopolita di artropodi edafici è organizzato in tre sottordini, Arthropleona, Symphypleona e Neelipleona, le cui relazioni filogenetiche non sono ancora completamente chiarite. La ricostruzione delle relazioni filogenetiche tra i collemboli ha come obiettivo anche quello di capire se l’antenato di questi organismi terrestri era anch’esso terrestre o semi-acquatico.
Ad un livello tassonomico ancora più ampio, la raccolta dei nostri dati sarà focalizzata su nodi più profondi della filogenesi dei Metazoa, come lo studio della filogenesi dei Bivalvia e dei Pancrustacea. Qui, l’obiettivo è quello di ricostruire le relazioni filogenetiche tra le principali linee evolutive dei Bivalvia, un gruppo nel quale tali relazioni sono ancora poco chiare, e per il quale i dati di genomica mitocondriale disponibili sono ancora piuttosto limitati. Nei Pancrustacea, la nostra analisi filogenetica avrà come obiettivo la ricostruzione della posizione degli ordini di esapodi basali, Protura, Collembola e Diplura, la verifica della monofilia di Crustacea ed Hexapoda, così come tradizionalmente definiti, e la costruzione di una robusta ipotesi filogenetica per l’interpretazione di passaggi evolutivi cruciali quali la terrestrializzazione.
In questi ultimi “contesti tassonomici” (Collembola, Bivalvia e Pancrustacea), utili informazioni filogenetiche possono essere estratte anche dall’ordine con il quale i geni mitocondriali sono organizzati nella molecola, e dall’identificazione di cambiamenti condivisi tra taxa diversi. In questo senso, il nostro progetto ha anche l’obiettivo di contribuire, con nuovi dati, alla verifica dei modelli teorici che spiegano i meccanismi attraverso i quali tali cambiamenti si verificano.
Il nostro progetto integrato ha altri due importanti obiettivi, che hanno notevoli implicazioni relative ai meccanismi di trasmissione ed evoluzione molecolare del mtDNA. Uno di questi è rappresentato dallo studio dell’inusuale meccanismo di eredità dei mitocondri descritto in molti bivalvi, che conduce alla presenza di mtDNA profondamente diversi nella stessa specie (Doubly Uniparental Inheritance: DUI). Cercheremo di chiarire i meccanismi citologici che portano alla DUI, il destino dei mitocondri di ciascun gamete, la natura delle interazioni nucleo-mitocondri, il significato funzionale del mtDNA ereditato lungo la linea maschile e, in ultima analisi, le consequenze di questo fenomeno peculiare sui tassi di evoluzione del mtDNA. Il sistema-DUI rappresenta inoltre un prezioso modello per studiare nel dettaglio i meccanismi di eredità dei mitocondri, e l’evoluzione dei loro genomi, poiché la DUI è unanimamente considerata una variante rispetto alla comune eredità mitocondriale matrilineare.
L’ultimo obiettivo è rappresentato dalla verifica dell’importanza della selezione a livello mitocondrale nel processo di adattamento dei pesci nototenioidei all’ambiente antartico. Un aspetto fondamentale sarà rappresentato dallo studio dei meccanismi attraverso i quali i mitocondri dei pesci antartici sono in grado di compensare la perdita del gene nad6 dal loro genoma, e dal tentativo di comprendere se tale perdita rappresenta il risultato di un rilassamento della pressione selettiva sul contenuto genico del mtDNA. Allo stesso tempo, cercheremo di determinare se le peculiari condizioni ambientali antartiche sono responsabili di indurre significative pressioni selettive direzionali, come suggerito dai dati preliminari raccolti relativi ad un’accelerazione del tasso di sostituzioni non-sinonime osservata in particolari domini di proteine codificate nel mtDNA.
In questa sezione dedicata agli “obiettivi del progetto”, riteniamo opportuno enfatizzare che una delle finalità di questo progetto integrato è rappresentata dalla promozione di una fattiva collaborazione tra le 4 U.O. coinvolte, tutte coordinate da docenti relativamente giovani, e composte da diversi borsisti e studenti di dottorato assai motivati, per i quali la partecipazione a questo progetto può fornire un importante momento di integrazione reciproca e di accrescimento del proprio bagaglio scientifico e culturale. <<<

Risultati parziali attesi

Come descritto al punto 11, il presente progetto integrato si articola in 8 obiettivi principali. Due di questi affrontano problematiche di filogeografia, con speciale riferimento alla biogeografia insulare ed a specie di interesse conservazionistico. Quattro obiettivi riguardano temi più propriamente filogenetici, andando a studiare gruppi diversi (Teleostei, Artropodi e Bivalvi) che si collocano a differenti levelli tassonomici, e quindi differiscono per il loro livello e tempo di diversificazione. Uno dei temi è focalizzato sui meccanismi ereditari del genoma mitocondriale in specie di Bivalvi che mostrano il fenomeno peculiare noto come Doppia Eredità Uniparentale (DUI). Infine una linea di studio affronta i meccanismi e le conseguenze, a livello molecolare, dell’adattamento alle condizioni estreme dell’ambiente Antartico in una famiglia di Teleostei endemici.
In tutti questi casi l’interesse principale è di natura scientifica, legato alla possibilità di approfondire le nostre conoscenze riguardo a temi che sono al centro dell’attenzione nei vari ambiti di ricerca. Tuttavia, soprattutto nel caso della filogeografia delle tartarughe giganti delle Galapagos (Geochelone elephantopus) e del varano di Komodo (Varanus komodoensis), il loro status di specie a rischio rende i possibili risultati prodotti di particolare interesse, dal momento che essi potranno essere utilizzati per progettare migliori strategie di conservazione.
Nelle tartarughe giganti delle Galapagos, lo studio delle sequenze complete del genoma mitocondriale permetterà di ricostruire in maniera organica le relazioni filogenetche fra i sub-taxa (razze o sottospecie) che sono stati descritti in 6 delle maggiori isole dell’arcipelago. Questo studio permetterà inoltre di identificare le principali vie di colonizzazione delle diverse isole in relazione agli eventi paleogeografici che hanno caratterizzato la formazione dell’Arcipelago. I dati relativi al DNA mitocondriale aiuteranno inoltre a risolvere il problema, ad oggi molto dibattuto, relativo allo status tassonomico delle diverse forme, ed i rapporti fra differenziazione morfologica e genetica. Di non minore importanza, i dati raccolti costituiranno una solida base biologica per guidare le scelte di gestione e conservazione in quelle isole in cui la specie si è recentemente estinta, e le reintroduzioni devono essere effettuate a partire dalle popolazioni endemiche originarie, ad oggi non note.
Risultati simili sono attesi riguardo al varano di Komodo. Le relazioni evolutive fra le sei popolazioni (presenti su 5 isole) saranno ricostruite utilizzando le sequenze complete del genoma mitocondriale, e costituiranno un contributo importante al problema della biogeografia insulare di quest’arcipelago originatosi in epoca recente (meno di 4 milioni di anni fa). Questi dati forniranno un contributo importante riguardo all’identificazione della linea ancestrale che ha dato vita alla differenziazione di Varanus komodoensis nell’arcipelago di Komodo, alla ricostruzione del processo di colonizzazione delle isole (un sistema di masse terrestri che ha subito modificazioni estese durante i periodi glaciali del Pleistocene a causa di notevoli variazioni eustatiche nel livello marino), ed allo studio degli effetti del flusso genico recente sulla diversificazione delle popolazioni. Questo progetto fornirà quindi un quadro esariente della storia evolutiva di questa specie a rischio di estinzione, con importanti ricadute sulla possibilità di sviluppare strategie di gestione appropriate.
Le tartarughe giganti delle Galapagos ed i varani di Komodo hanno differenti capacità di dispersione ed abitano arcipelaghi la cui formazione è caratatterizzata da diverse storie paleogeografiche. Pertanto, questa parte del progetto fornisce l’opportunità per confrontare modelli di evoluzione del genoma mitocondriale in scenari biogeografici spazialmente e temporalmente diversi.
Studiando rappresentanti del sub-ordine dei pesci Notothenioidei, verranno ricostruite nel dettaglio le relazioni filogenetiche all’interno del gruppo, le cui specie sono endemiche e confinate all’oceano antartico ed ai corpi d’acqua fredda delle regioni sub-antartiche. Questo costituirà il primo tentativo organico di ricostruire la filogenesi in questo gruppo, che fino ad adesso è stata studiata, con esiti contrastanti, solo sulla base di caratteri morfologici o di sequenze di singoli geni. Sarà quindi possibile sviluppare un quadro filogenetico organico per studiare l’evoluzione di questo gruppo peculiare di famiglie che si sono differenziate negli ultimi 25-30 milioni di anni, successivamente alla separazione delle acque dell’Oceano Antartico dagli altri oceani dell’emisfero australe. Una ricostruzione affidabile delle relazioni evolutive all’interno dei nototenioidei, su cui sia possibile mappare le novità evolutive di interesse, è di particolare importanza in questo gruppo, dal momento che esso è andato incontro a rimarchevoli adattamenti morfologici, fisiologici, biochimici e molecolari (vedi sotto) per poter sopravvivere in simili condizioni estreme.
Il sequenziamento di genomi mitocondriali completi permetterà inoltre di assemblare un set di dati specifico per risolvere le relazioni filogenetiche fra le linee evolutive principali (a livello di famiglie) dei Collemboli, un interessante ordine di esapodi basali. Avendo a disposizione 8 genomi già descritti, verranno aggiunte le sequenze di 9 ulteriori rappresentanti di tutti e tre i sottordini. Questo porterà il numero di sequenze mitocondriali disponibili per questo ordine a 17, creando uno dei dataset più completi disponibili per un singolo ordine di insetti. L’analisi filogenetica permetterà di ottenere una ricostruzione esauriente dell’evoluzione di questa antichissima (450-500 milioni di anni) linea di esapodi terrestri, con speciale enfasi riguardo alle relazioni fra i tre sottordini (Arthropleona, Symphypleona, Neelipleona), alla loro reciproca monofilia, e alla comparsa di caratteristiche ecofisiologici peculiari quali l’habitus semiacquatico di alcune delle specie.
Nel più ampio contesto delle relazioni filogenetiche all’interno degli Artropodi, si andranno a studiare mediante un’analisi filogenetica mirata la possibile parafilia degli Hexapoda e la posizione degli altri ordini di esapodi basali. Questo ulteriore obiettivo verrà affrontato sequenziando 9 rappresentanti degli “atterigoti” (Protura, Diplura, Microcoryphia e Zygenoma, oltre ai sopracitati Collembola), e assemblando insieme agli altri taxa disponibili in GenBank un ampio dataset comprendente tutti i rappresentanti di Pancrustacea per i quali la sequenza completa del genoma mitocondriale è nota. Questo set di oltre 120 genomi per oltre 10kb di sequenza analizzabile, sarà il più ampio dataset mai assemblato per questo gruppo di Artropodi, e l’analisi filogenetica aiuterà a ricostruire i passati eventi evolutivi che hanno caratterizzato il gruppo nell’arco degli oltre 600 milioni di anni della loro storia, e che hanno portato alla diversificazione degli Insetti, certamente gruppo di maggior successo evolutivo sulla Terra. La possibilità di ricostruire un robusto quadro filogenetico costituirà la base per interpretare alcuni rimarchevoli esempi di evoluzione ed adattamento, quali il passaggio alle terre emerse e i cambiamenti morfologici legati alla terrestrializzazione. Lo stesso dataset permetterà inoltre di testare la reciproca monofilia di Crustacea ed Hexapoda, un problema largamente dibattuto fra gli esperti di sistematica degli Artropodi, e l’efficienza di diversi metodi di ricostruzione filogenetica, incluse alcune specifiche matrici di sostituzione aminoacidica recentemente sviluppate.
La comparazione di genomi mitocondriali completi sarà inoltre utilizzata per studiare le relazioni filogenetiche fra Bivalvi. Per questa classe di Molluschi verrà assemblato un dataset ragionevolmente ampio, seppur non definitivo, sequenziando il genoma di almeno 10 specie da famiglie diverse. Questo permetterà di aumentare in maniera significativa il numero di sequenze complete ad oggi disponibile (13) e permetterà di assemblare un dataset sufficientemente rappresentativo per studiare le relazioni filogenetiche fra le principali famiglie di Bivalvi. Per questo verrà analizzato, oltre alle sequenze nucleotidiche ed aminoacidiche, l’ordine con cui i geni sono codificati lungo il genoma, un marcatore particolarmente interessante in questi gruppi.
I Bivalvi saranno inoltre oggetto di un’ulteriore importante parte del progetto proposto, rappresentato dallo studio della Doppia Eredità Uniparentale, che ha ovvie e profonde implicazioni sulle meccaniche di eredità ed evoluzione del genoma mitocondriale. Questo studio fornirà un contributo importante alla descrizione di questi processi nelle specie Tapes philippinarum e Musculista senhousia, che verranno comparati con quanto già noto per Mytilus. Usando sistemi in vivo per tracciare i movimenti dei mitocondri, sarà inoltre possibile studiare, in entrambe le specie, il destino dei mitocondri di origine spermatica dopo la fecondazione. La metodica di Real Time PCR verrà utilizzata per quantificare l’abbondanza relativa del genoma maschile e femminile nei gameti, durante lo sviluppo embrionale, in individui di sesso diverso ed in tessuti differenti dello stesso individuo. Inoltre, la tecnica dell’SSH sarà utilizzata per determinare i meccanismi molecolari della determinazione del sesso, e per chiarire le interazioni fra nucleo e mitocondrio. Queste causano la soppressione del meccanismo di eliminazione del mitocondrio spermatico, che nella maggioranza delle specie determina l’eredità patrilineare del DNA mitocondriale. Questa parte del progetto rappresenta una novità assoluta negli studi sulla Doppia Eredità Uniparentale e contribuirà in maniera significativa allo studio dei meccanismi molecolari che ne sono alla base. Questo costituirà un notevole avanzamento nella comprensione dei meccanismi dell’eredità mitocondriale anche in specie che non presentano Doppia Eredità Uniparentale, visto che questo meccanismo è in genere considerato come una particolare variazione sul tema dell’eredità matrilineare. Questa parte del programma potrà inoltre contribuire alla determinazione del tasso di ricombinazione nei genomi mitocondriali, fenomeno che è con ogni probabilità particolarmente frequente nei tessuti in cui le due forme mitocondriali differenti sono presenti contemporaneamente. Infine, la possibilità di individuare marcatori molecolari per la determinazione precoce del sesso in T.philippinarum, una specie di considerevole interesse commerciale, sarà utile per riconoscere il sesso dei giovani prima dello sviluppo delle gonadi, possibilità che apre interessanti prospettive applicative.
Similmente, i pesci nototenioidei costituiscono un interessante modello per studiare i meccanismi molecolari dell’evoluzione mitocondriale, specificamente riguardo all’adattamento alle condizioni estreme dell’Oceano Antartico e alle conseguenze di tali adattamenti a livello del genoma mitocondriale. Lo studio proposto andrà a testare se, ed in che modo, le particolari condizioni ambientali possano determinare una pressione evolutiva direzionale su specifici geni e/o domini funzionali. Questo sarà possibile studiando sequenze di specie Antartiche e non, e comparando il tasso di sostituzioni sinonime e non sinonime fra di esse. Inoltre, il sequenziamento di ulteriori genomi mitocondriali permetterà chiarire se la perdita del gene nad6, descritta in alcuni genomi di nototenioidei, sia da collegarsi ad un rilassamento della pressione selettiva o a meccanismi di compensazione a livello biochimico.
Il progetto proposto prevede, nel suo complesso, il sequenziamento e la descrizione di circa 50 nuovi genomi mitocondriali, e va a contribuire in maniera significativa allo studio dei meccanismi molecolari dell’evoluzione del genoma mitocondriale, dei suoi processi ereditari, della sua utilità come marcatore per studi di filogeografia e filogenesi, e delle conseguenze a livello molecolare dell’adattamento del genoma a condizioni ambientali estreme.
Infine, consideriamo come un significativo valore aggiunto del programma proposto la possibilità di offrire a giovani ricercatori (assegnisti e dottorandi) l’opportunità di prendere parte a progetti di alto livello nel campo dell’evoluzione molecolare, di approfondire tecniche all’avanguardia di tipo molecolare e bioinformatico, e di essere coinvolti in tutti i diversi passi della ricerca sperimentale, contribuendo in maniera significativa alla loro formazione di ricercatori. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il genoma mitocondriale (mtDNA) è una molecola circolare caratterizzata da uno straordinario grado di conservazione strutturale. Con pochissime eccezioni, il DNA mitocondriale dei metazoi varia tra 15 e 20 kb e contiene 37 geni (Boore et al 1999). Tredici geni (PCG) codificano per subunità di enzimi coinvolti nel processo di fosforilazione ossidativa; ci sono 3 subunità (I-III) della citocromo c ossidasi (cox1, cox2, cox3), 7 subunità della NADH-deidrogenasi (nad1, nad2, nad3, nad4, nad4L, nad5, nad6), due subunità della ATPasi (atp6, atp8) ed il gene codificante per la citocromo b. Tutte le proteine prodotte vengono usate nel mitocondrio, assieme a subunità proteiche codificate nel genoma nucleare e trasportate all’interno dell’organulo. Ventidue geni (trnX) codificano per molecole di tRNA, una per ciascun aminoacido, con l’eccezione di Leucina e Serina che hanno 2 tRNA ciascuno. Due geni (rrnS, rrnL) codificano per le subunità piccola (12S) e grande (16S) dell’RNA ribosomale, che partecipano all’assemblaggio dei ribosomi mitocondriali. La loro presenza, ed il set completo di tRNA, fa sì che la traduzione dei geni mitocondriali possa essere effettuata all’interno dei mitocondri, e rende quest’ultimo autosufficiente per quanto riguarda la sintesi proteica.
Il mtDNA ha un’organizzazione molto compatta, con brevissimi spaziatori intergenici non-codificanti (talvolta persino assenti): in alcune circostanze, le regioni codificanti dei geni si sovrappongono. Normalmente, esiste una singola regione non-codificante di una certa dimensione, ove si ritiene che siano localizzati i segnali molecolari per l’inizio della replicazione e della trascrizione del mtDNA (Saito et al. 2005) e che è denominata Regione di Controllo. Negli insetti, questa regione è straordinariamente ricca in A e T (fino a 90%: Crozier &amp; Crozier 1993), ed è pertanto denominata regione A+T-rich.
In generale, la composizione nucleotidica del mtDNA è piuttosto eterogenea, con molti artropodi che mostrano un considerevole sbilanciamento verso la basi A+T. Tale sbilanciamento è particolarmente marcato negli esapodi pterigoti, ed in alcuni imenotteri il contenuto complessivo in A+T supera l’80% (Crozier &amp; Crozier 1993). Un altro aspetto interessante è rappresentato dall’asimmetria nel contenuto in basi che si osserva tra le due eliche del mtDNA. Hassanin et al (2005) hanno infatti mostrato che la frequenza relativa di A e T dei PCG varia in relazione all’elica dove risiede la regione codificante. La frequenza di T tende ad essere più elevata (rispetto alle A) nelle eliche dove è presente la regione codificante di un PCG, se confrontata con l’elica complementare (Podsiadlowski et al. 2006; Carapelli et al. 2006). Lo stesso avviene per le C rispetto alle G. Tuttavia, negli insetti, questo sbilanciamento verso le T tende ad essere meno pronunciato nell’elica dove sono codificati la maggior parte dei geni (J-strand), rispetto all’altra elica (N-strand). Ciò indica che, oltre alla pressione selettiva dovuta alla presenza della regione codificante di un PCG, esercitano la loro influenza anche altri fattori, specifici per ogni elica, e forse legati a quale delle due eliche viene sintetizzata per prima durante la replicazione. Questo fenomeno ha implicazioni interessanti per lo studio delle pressioni selettive che regolano l’evoluzione molecolare del mtDNA, ma ha anche importanti ripercussioni se i geni mitocondriali vengono usati per la ricostruzione della filogenesi. Infatti, la traslocazione di un gene, con cambiamento di elica, finisce per modificare la pressione selettiva elica-specifica che agisce sulla sua sequenza nucleotidica, differenziando questo gene dai suoi omologhi che, in altre specie, si trovano sull’elica opposta (Hassanin et al. 1995).
Con un contenuto genico virtualmente conservato in tutti i Metazoa, una caratteristica del genoma mitocondriale è l’ordine con il quale i 37 geni sono organizzati lungo la molecola. Questa caratteristica è piuttosto eterogenea su un ampio spettro tassonomico, ma tende ad essere più conservata all’interno di un taxon, con pochissimi cambiamenti di PCG osservati, ad esempio, all’interno degli insetti o dei vertebrati (Boore 1999). Ciò nonostante, sono state evidenziate regioni del mtDNA particolarmente soggette a riarrangiamenti genici, dove, cioé, le traslocazioni avvengono più frequentemente (Dowton et al. 2003), specialmente di alcuni geni per tRNA. Il processo attraverso il quale avvengono queste traslocazioni può essere mediato dalla duplicazione di lunghi tratti del genoma (comprendenti diversi geni), seguita dalla rapida perdita di una copia dei geni duplicati, indotta dalla tendenza del mtDNA ad economizzare le sue dimensioni. A questo proposito, sulla base della comparazione del “gene order” di taxa diversi, i modelli proposti prevedono che la perdita di una copia dei geni duplicati possa essere casuale (Boore 2000), o essere predeterminata da caratteristiche strutturali quali la polarità trascrizionale (Lavrov et al. 2002). Prove sperimentali a suffragio di un tale meccanismo possono essere rappresentate dal ritrovamento di regioni intergeniche non-codificanti insolitamente lunghe, ove sono talvolta localizzate copie complete (o quasi) di geni per tRNA duplicati (Campbell &amp; Barker 1999; Carapelli et al. 2006). Indipendentemente dal meccanismo attraverso il quale i riarrangiamenti genici si manifestano, i suoi cambiamenti possono avere importanti implicazioni filogenetiche. In virtù della lora rarità, e del numero astronomico delle possibili combinazioni, la possibilità che arrangiamenti genici identici siano comparsi per convergenza è insignificante. Pertanto, qualsiasi cambiamento al gene order condiviso da più taxa ha un notevole valore come marcatore di una storia evolutiva comune (Boore et al. 1995). Un esempio paradigmatico è rappresentato dalla traslocazione del gene per un tRNA nel mtDNA degli artropodi che è considerata una sinapomorfia di tutti i Pancrustacea (Boore et al. 1998).
Il genoma mitocondriale presenta aspetti peculiari anche in relazione alle sue modalità di trasmissione (Xu 2005). Poiché i mitocondri dello zigote derivano da quelli dell’oocita, il mtDNA di ogni individuo è normalmente ereditato secondo la linea materna. Questà modalità di eredità matrilineare, associata con l’omoplasmia (tutte gli mtDNA di tutti i mitocondri di tutte le cellule di un individuo sono identici), è stata considerata per anni un dogma, finchè non si sono raccolte evidenze sperimentali di casi di eteroplasmia mitocondriale (Kann et al. 1998; Nardi et al. 2001) e di eredità patrilineare parziale (Bromham et al. 2003). Un caso particolare di eteroplasmia ed eredità patrilineare parziale è rappresentato dalla cosiddetta Doppia Eredità Uniparentale (DUI) (Zouros etal. 1992), quando sono presenti due differenti varianti mitocondriali (con livelli di divergenza nucleotidica tra 10% e 30%: Passamonti et al. 2003; Mizi et al. 2005) ed esse segregano in modo diverso nei due sessi ed in tessuti diversi. Mentre il mtDNA femminile (F) è ereditato dagli embrioni di ambedue i sessi, il mtDNA paterno (M) viene ereditato soltanto dalla progenie maschile. In quest’ultima, che è effettivamente eteroplasmica, i due aplotipi mitocondriali hanno una distribuzione disomogenea, con il mtDNA-F che è più abbondante nei tessuti somatici, ed il mtDNA-M più abbondante nelle gonadi. Gli spermi sembrano portare soltanto mitocondri con mtDNA-M. La DUI è ampiamente diffusa nei bivalvi, dove essa è stata dimostrata in specie di diverse famiglie (Mytilidae, Unionidae, Veneridae), un’osservazione che suggerisce che essa si è evoluta una sola volta in tutto il gruppo (Passamonti et al. 2003; Zouros 2000). I dati raccolti sinora indicano che la DUI si è evoluta a causa della modificazione del sistema di riconoscimento dei mitocondri degli spermi da parte dell’uovo, ed attareverso l’instaurarsi di uno speciale meccanismo di trasmissione del mtDNA-M dai maschi ai loro figli maschi (Burzynski 2007). Nei bivalvi, la DUI potrebbe anche essere correlata con la determinazione del sesso, cosa che implicherebbe differenze funzionali tra gli mtDNA M ed F (Kenchington et al. 2002), rendendo così queste specie un modello unico per lo studio dell’eredità mitocondriale, nonché dell’evoluzione del genoma mitocondriale a livello nucleotidico.
Da almeno 15 anni il genoma mitocondriale viene usato estesamente come marcatore filogeografico e filogenetico (Avise 1987; Caterino et al. 2000; Simon et al. 2006). L'intenso uso di questa molecola ebbe inizio quando la PCR ed il sequenziamento diretto divennero strumenti metodologici di uso quotidiano anche per gli zoologi, permettendo la raccolta di sequenze di DNA in tempi relativamente brevi, e la conseguente ricostruzione di relazioni evolutive sulla base del confronto di sequenze nucleotidiche ed aminoacidiche (Kocher et al. 1989; Simon et al. 1994). Questo sforzo ha generato una straordinaria quantità di informazioni, lo sviluppo di primers universali che possono essere usati in una vasta gamma di taxa (Simon et al. 1994, 2006) ed un consistente perfezionamento dei metodi analitici di ricostruzione filogeografica e filogenetica (Simon et al. 2006). Sebbene si ritenga che i geni mitocondriali evolvano più rapidamente di quelli nucleari a singola copia (Lin &amp; Danforth 2004), il genoma mitocondriale è indubbiamente un mosaico di sequenze che si evolvono rapidamente ed altre che si evolvono più lentamente, rendendolo un marcatore potenzialmente utile a diversi livelli evolutivi. Più recentemente, il miglioramento degli approcci metodologici ha reso molto più semplice il sequenziamento dell’intero mtDNA (Boore et al. 2005), permettendo di trasferire le analisi a livello di interi genomi. Come conseguenza di questi sforzi di sequenziamento, un considerevole numero di sequenze mitocondriali complete è adesso disponibile in GenBank (oltre 130 artropodi, oltre 500 vertebrati). Diverse caratteristiche molecolari del mtDNA possono essere utilizzate come utili marcatori filogeografici e filogenetici: sequenze nucleotidiche ed aminoacidiche dei PCG (Simon et al. 2006), e dati di gene order (Boore 1999). Ciò permette l’utilizzazione di questo genoma a diversi livelli tassonomici, da popolazioni conspecifiche sino alla filogenesi di un intero Phylum.
A titolo di esempio, il mtDNA è stato intensamente usato negli artropodi per la ricostruzione delle relazioni filogenetiche tra le sue principali linee evolutive (miriapodi, chelicerati, crostacei ed esapodi), portando ad una complessiva riconsiderazione della storia evolutiva dell’intero Phylum. Le diverse analisi, adesso basate su oltre 100 taxa ed oltre 10 kb di sequenze nucleotidiche, hanno prodotto ipotesi filogenetiche innovative, quali il rifiuto degli Atelocerata, rimpiazzati dai Pancrustacea (Telford &amp; Thomas 1995; Boore et al. 1998), la presunta affinità tra Chelicerata e Myriapoda (Hwang et al. 2001) e la reciproca parafilia di Crustacea ed Hexapoda (Nardi et al. 2003; Cook et al. 2005; Carapelli et al. 2007).
A livello intraspecifico, il genoma mitocondriale può essere assai informativo. Il tasso di evoluzione relativamente rapido di alcuni geni, o la possibilità di selezionare sottogruppi di posizioni nucleotidiche ipervariabili, come le 3° posizioni di codone dei PCG o la regione di controllo, rendono il mtDNA un marcatore ideale per la ricostruzione della storia delle popolazioni in un lasso di tempo che va da poche decine di migliaia a pochi milioni di anni (Caterino et al. 2000). Ciò permette la calibrazione abbastanza accurata dell’orologio molecolare e lo studio dell’influenza di eventi paleogeografici passati sulla struttura genetica di una specie. Un filone di ricerca che può godere dell’applicazione della genomica mitocondriale è lo studio della biogeografia insulare, specialmente in contesti in cui l’età geologica delle isole è relativamente recente e le specie in esame hanno notevole valore conservazionistico, necessitando pertanto di una valutazione dettagliata delle relazioni evolutive tra le popolazioni, per le ovvie implicazione sulle strategie gestionali (Ciofi et al. 2007).
Come ricordato precedentemente, un importante contributo della genomica mitocondriale si manifesta attraverso l’analisi del gene order. Un caso particolare è rappresentato dai rari esempi in cui un gene è scomparso all’interno di una singola linea evolutiva. Un tale caso è stato dimostrato nei pesci nototenioidei, endemici dell’oceano antartico, che hanno perso il gene nad6 (Papetti et al. 2007). L’eccezionalità di un tale evento, associata al contesto ambientale in cui si è manifestata, stimola interessanti ipotesi sui meccanismni che questi animali possono aver evoluto per compensare tale perdita, oltreché sul suo valore adattativo.
In conclusione, ora che i genomi mitocondriali possono essere sequenziati con relativa facilità, e che i metodi di ricostruzione filogenetica vengono continuamente migliorati, la genomica mitocondriale si apre ad una vastissima gamma di applicazioni, dalla filogeografia alla filogenesi, dallo studio delle modalità di eredità alle implicazioni adattative dell’evoluzione dei suoi geni e del suo contenuto genico.

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