RICERCA ITALIANA     

IL CONTROLLO SIMBIOTICO, UNA NUOVA STRATEGIA PER LA LOTTA ALLE CICALINE VETTORI DI FITOPLASMI DANNOSI ALLA VITE

Università degli Studi di Torino

Abstract

Le malattie causate da fitoplasmi hanno assunto un ruolo sempre più importante per la gestione delle colture agrarie, provocando in molti casi ingenti danni alle piante coltivate sia arboree che erbacee. Nel Mondo rivestono grande rilevanza il giallume letale della palma, i giallumi australiani della vite, la virescenza e scopazzo dell’erba medica e i giallumi dell’astro in diverse colture orticole. In Italia le malattie indotte da questi procarioti di maggiore importanza economica sono la Flavescenza dorata (FD) e il Legno Nero (LN) della vite, gli scopazzi del melo, i giallumi delle drupacee, la moria del pero e lo Stolbur del pomodoro. Gli agenti eziologici della FD e del LN della vite sono trasmessi rispettivamente dal cicadellide Scaphoideus titanus e dal cixiide Hyalesthes obsoletus. Essi causano: i) gravi perdite di produzione; ii) problemi di reperimento di materiale di moltiplicazione sano; iii) aumento dei costi di produzione; iv) ripercussione negativa sull'ecosistema vigneto per la lotta chimica obbligatoria (FD) contro gli insetti vettori. Infatti, per il controllo delle fitoplasmosi della vite, oggi non sono disponibili efficaci approcci di lotta alternativi alla lotta chimica agli insetti vettori. Obiettivo del progetto è la caratterizzazione dei microrganismi associati agli insetti vettori delle fitoplasmosi FD e LN, per contribuire a chiarire il ruolo dei microrganismi simbionti nel ciclo biologico dei vettori e per sviluppare un approccio innovativo di biocontrollo dei fitoplasmi o dei vettori stessi, denominato “Controllo Simbiotico”. Attraverso attività di campo si procederà alla raccolta delle cicaline (giovani e adulti). Gli esemplari di S. titanus e H. obsoletus, ottenuti dalle raccolte di campo e/o dagli allevamenti e destinati ad analisi molecolari, saranno dissezionati in soluzione fisiologica in cinque differenti porzioni: i) ghiandole salivari; ii) apparato intestinale; iii) corpi grassi e fasci muscolari; iv) ovari e uova mature pronte per l’ovideposizione v) zampe, ali e frammenti di dissezione. Da tutti i campioni saranno estratti gli acidi nucleici che comprenderanno il DNA dell’insetto e della microflora ad esso associata. Per l’individuazione e l’isolamento in coltura dei microrganismi simbionti dominanti nei distretti corporei delle due cicaline saranno impiegate strategie di ecologia molecolare, quali analisi di librerie geniche di cronometri molecolari batterici e fingerprinting di comunità microbiche, abbinati all’impiego di strategie d’isolamento in coltura dei simbionti. Particolare attenzione sarà rivolta a batteri del genere Asaia ed in generale a batteri acetici che sono stati recentemente dimostrati essere importanti simbionti di diversi insetti, incluso il vettore S. titanus. Questi batteri appaiono potenzialmente utili per il controllo simbiotico di insetti di interesse medico e/o agrario; difatti sono stati facilmente coltivati in liquido e su mezzo solido: questa caratteristica, già di per sé abbastanza rara, risulta ancor più inconsueta per gli alfa-proteobatteri. Ulteriore obiettivo è la precisa localizzazione dei simbionti in distretti corporei quali apparato riproduttivo, tratto digerente e ghiandole salivari, queste ultime implicate nella trasmissione dei fitoplasmi alla vite, nonché lo studio della co-localizzazione degli endosimbionti con i fitoplasmi. L’indagine sarà condotta mediante l’impiego di strategie di ibridazione molecolare ‘in situ’, microscopia confocale a scansione laser e a trasmissione. Nell’ambito del progetto saranno inoltre sviluppati protocolli di trasformazione dei microrganismi isolati e la marcatura sul loro genoma con cassette geniche codificanti per proteine fluorescenti per tracciare i simbionti all’interno del corpo dell’insetto ospite. Esperimenti di ricolonizzazione da parte di batteri simbionti coltivabili saranno effettuati utilizzando come modello precedenti studi su Asaia effettuati sul dittero Anopheles stephensi (UR2). Ceppi marcati dei principali simbionti forniti dall’UR3 saranno somministrati a S. titanus e H. obsoletus mediante diete artificiali messe a punto dall’UR1. Sarà inoltre valutata l’influenza di tali batteri modificati sulla fitness di giovani e di adulti. Analisi microscopiche ed ultrastrutturali saranno condotte su campioni d’insetti utilizzati negli esperimenti di ricolonizzazione. Le analisi ultrastrutturali saranno svolte sia su campioni di varie età, sia su diversi tessuti valutando la capacità dei batteri di colonizzare specifici distretti corporei, seguendo nel dettaglio il pattern di ricolonizzazione. I risultati permetteranno di ottenere nuove conoscenze sulle interazioni vettore-fitoplasma-simbionti, di sviluppare protocolli per l’allevamento e la nutrizione su substrati artificiali per vettori floemomizi e di valutare il ciclo e il ruolo dei principali batteri simbionti nelle diverse fasi della biologia di giovani e di adulto di S. titanus e H. obsoletus. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Alberto Alma Università degli Studi di TORINO

Obiettivo del Programma di Ricerca

Scopo generale della ricerca è quello di dare un significativo contributo alla caratterizzazione della biodiversità delle comunità microbiche associata a S. titanus e H. obsoletus vettori di fitoplasmi agenti causali di FD e LN nella vite. Tali studi, correlati ai diversi stadi post embrionali degli insetti vettori, giovani (neanidi e ninfe) ed adulti (maschi e femmine), al periodo della stagione ed all’incidenza di FD e LN contribuiranno a chiarire il ruolo dei microrganismi simbionti nel ciclo biologico dei vettori e permetteranno di individuare le linee guida essenziali per sviluppare un approccio innovativo di biocontrollo dei fitoplasmi o dei vettori stessi, basato sul “Controllo Simbiotico”. Sorprendentemente, nonostante l’importanza di S. titanus e H. obsoletus nella trasmissione di FD e LN, poco si conosce dei microrganismi simbionti associati, sebbene importanti ricerche abbiano dimostrato che i microrganismi possono avere un ruolo determinante nel ciclo biologico degli insetti.
Allo scopo di perseguire l’obiettivo generale sopra definito, si procederà attraverso un piano attuativo finalizzato al perseguimento dei seguenti obiettivi specifici: i) Campionare, allevare, catalogare e dissezionare il materiale entomologico. La costituzione di un catalogo dettagliato d’individui di campo permetterà di eventualmente verificare potenziali correlazioni tra la diversità microbica osservata negli insetti e la provenienza degli stessi. ii) Individuare e isolare in coltura i microrganismi simbionti dominanti nei distretti corporei delle due cicaline vettrici. A questo scopo saranno impiegate strategie di ecologia molecolare, quali analisi di librerie geniche di cronometri molecolari batterici e fingerprinting di comunità microbiche, abbinati all’impiego di strategie d’isolamento in coltura dei simbionti. Particolare attenzione sarà rivolta a batteri del genere Asaia ed in generale a batteri acetici che sono stati recentemente dimostrati, da gruppi di ricerca che includono il proponente, essere importanti simbionti di diversi insetti, incluse le cicaline [Favia et al., 2007; Marzorati et al., 2006]. iii) Localizzare con precisione i simbionti nei rilevanti distretti corporei dell’insetto, quali gli apparati riproduttivi, il tratto digerente e le ghiandole salivari, queste ultime implicate nella trasmissione dei fitoplasmi alla vite. Tratto digerente e ghiandole salivari sono organi corporei attraverso cui il fitoplasma deve necessariamente passare durante il ciclo vitale nell’insetto vettore e quindi costituiscono organi bersaglio dove potenzialmente attuare strategie di controllo simbiotico. Gli apparati riproduttivi hanno notevole interesse, in quanto in molti insetti sono stati dimostrati ospitare microrganismi capaci di alterare il comportamento riproduttivo degli insetti stessi. Con quest’obiettivo specifico sarà possibile valutare anche la co-localizzazione degli endosimbionti con i fitoplasmi. Tale parte dello studio sarà condotta mediante l’impiego combinato di ibridazioni ‘in situ’ di tipo “whole mount” e microscopia confocale a scansione laser, nonché microscopia elettronica a trasmissione sui tessuti dissezionati. iv) Sviluppare protocolli di trasformazione dei microrganismi isolati finalizzati alla marcatura del genoma con cassette geniche codificanti per proteine fluorescenti. La marcatura con tali proteine permetterà di tracciare i microrganismi simbionti all’interno del corpo dell’insetto ospite durante il processo di colonizzazione. Particolare attenzione sarà riservata al miglioramento dei protocolli di trasformazione per batteri del genere Asaia e batteri acetici affini per favorire l’integrazione sul cromosoma delle cassette geniche. Tali batteri sono già stati dimostrati, dai gruppi di ricerca proponenti il presente progetto, essere trasformabili con DNA plasmidico [Favia et al., 2007]. v) Studiare il pattern di colonizzazione degli organi corporei delle cicaline da parte dei microrganismi simbionti marcati e la loro influenza sulla biologia dell’ospite. I microrganismi simbionti marcati con proteine fluorescenti saranno tracciati attraverso studi di microscopia confocale a scansione laser. La localizzazione sarà quindi confermata e ulteriormente studiata in maggior dettaglio mediante microscopia elettronica a trasmissione dei diversi organi. vi) Definire il ruolo funzionale di Asaia e dei batteri acetici nel rapporto simbiotico con le cicaline e nel mantenimento del ciclo biologico dell’ospite. A questo scopo oltre agli esperimenti di ricolonizzazione che saranno effettuati sulle cicaline stesse, sarà utilizzato un altro modello entomologico che è stato in precedenza dimostrato ospitare batteri del genere Asaia. In particolare saranno utilizzate zanzare della specie Anopheles stephensi. Tale insetto rappresenta un modello ideale dato che questa specie può essere facilmente allevata in insettario e offre quindi, la possibilità di investigare nel dettaglio il ruolo funzionale del batterio, che potrà essere in seguito verificato nelle cicaline; vii) Valutare la trasmissione orizzontale di “Candidatus Cardinium sp.” da parte di S. titanus. In un precedente lavoro il gruppo di ricerca che propone il presente progetto ha dimostrato che S. titanus ospita un batterio del genere “Candidatus Cardinium” in diversi distretti corporei con elevata prevalenza nel sistema riproduttore femminile [Marzorati et al., 2006]. Lo stesso gruppo di ricerca ha mostrato che tale microrganismo alberga anche nelle ghiandole salivari. Tale localizzazione ed esperimenti preliminari hanno indicato che questo microrganismo può essere trasmesso non solo verticalmente alla progenie, ma anche orizzontalmente attraverso la dieta. L’osservazione di una trasmissione orizzontale attraverso una pianta, la vite, costituirebbe la prima dimostrazione di tali modalità di trasmissione di un endosimbionte in natura e porrebbe le basi per evidenziare possibili alternativi meccanismi di diffusione di un microrganismo per il potenziale biocontrollo a popolazioni naturali dell’insetto vettore. <<<

Risultati parziali attesi

I risultati attesi dalle attività di ricerca condotte dalle tre UR partecipanti al progetto, anche grazie alla consolidata esperienza maturata da alcuni anni di fattiva collaborazione che ha già permesso di individuare e caratterizzare importanti simbionti in altrettanto importanti insetti vettori di malattie [Marzorati et al., 2006; Bigliardi et al., 2006; Favia et al., 2007], saranno di sicuro interesse per la comunità scientifica che si occupa di studiare e interpretare le relazioni intercorrenti tra insetto-simbionti.
In particolare, in relazione all’articolazione del progetto e agli obiettivi specifici i-vii precedentemente riportati, secondo sette ‘Work Package’ (WP1-WP7) al punto 13 “Articolazione del progetto e tempi di realizzazione” i risultati attesi sono i seguenti.
WP1: dai campionamenti di campo negli areali viticoli interessati, dagli allevamenti dei vettori e dall’attività di laboratorio sugli stadi ontogenetici (giovani e adulto) delle singole specie si potrà ottenere un elenco delle specie e relativa flora microbica associata, utile a stabilire eventuali correlazioni tra la diversità microbica osservata negli insetti e la provenienza degli stessi.
WP2: dall’esame dei diversi distretti corporei di S. titanus e H. obsoletus mediante strategie di ecologia molecolare verranno identificati i principali microrganismi simbionti che albergano nelle due cicaline. Verranno inoltre isolati in coltura i microrganismi simbionti dominanti, con particolare attenzione per i batteri acetici in generale e per i microrganismi del genere Asaia in particolare.
WP3: mediante l’impiego combinato di ibridazioni ‘in situ’ di tipo “whole mount”, microscopia confocale a scansione laser e microscopia elettronica a trasmissione sui tessuti dissezionati saranno localizzati con precisione i simbionti nei diversi distretti corporei. In particolare nel tubo digerente e ghiandole salivari dove i fitoplasmi si localizzano e si moltiplicano. Sarà così costruita una mappatura della localizzazione dei microrganismi simbionti nel corpo delle due cicaline.
WP4: verranno ottenuti protocolli di trasformazione dei microrganismi isolati finalizzati alla marcatura del genoma con cassette geniche sul cromosoma codificanti per proteine fluorescenti. Sarà inoltre ottenuta una batteria di simbionti modificati a livello cromosomico che sarà impiegata nel progetto ed in studi successivi. Successivamente alla realizzazione del presente progetto, tale batteria di ricombinanti sarà messa a disposizione della comunità scientifica nazionale ed internazionale.
WP5: attraverso l’esame con la microscopia confocale sarà identificato il pattern di colonizzazione degli organi corporei delle cicaline da parte dei microrganismi simbionti marcati e la loro influenza sulla biologia dell’ospite.
WP6: attraverso esperimenti di ricolonizzazione utilizzando come base il modello Asaia-An. stephensi (Diptera) [Favia et al., 2007] verrà definito il ruolo funzionale di Asaia e dei batteri acetici nel rapporto simbiotico con le cicaline (Hemiptera) e nel mantenimento del ciclo biologico dell’ospite.
WP7: attraverso l’alimentazione di S. titanus e H. obsoletus sulle rispettive piante ospiti e su diete artificiali si otterranno informazioni sulla trasmissione orizzontale del batterio simbionte Ca. Cardinium, dimostrando per la prima volta la modalità di trasmissione di un endosimbionte in natura attraverso la pianta.
I risultati ottenuti nel loro insieme permetteranno di implementare le conoscenze di base, fondamentali per complesse ricerche interdisciplinari e contemporaneamente aprire la strada verso l’applicazione di nuove potenziali strategie per una gestione innovativa e il più possibile rispettosa dell’ambiente degli insetti vettori di interesse agrario e non solo. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

I fitoplasmi sono organismi procarioti privi di parete cellulare, circondati solamente da membrane e pleomorfici nell’aspetto. Vivono a spese delle piante, nelle quali si trovano localizzati nel floema [Lee et al., 2000; Martini et al., 2002]. I fitoplasmi provocano nei vegetali ospiti sindromi complesse con sintomi specifici che denotano profondi disturbi nel normale equilibrio degli ormoni vegetali, come virescenza, fillodia, sterilità dei fiori, proliferazione di germogli ascellari ed ausiliari in seguito alla perdita di dominanza apicale, abnorme allungamento degli internodi [Oshima et al., 2004]. Nella trasmissione dei fitoplasmi un ruolo fondamentale per la loro diffusione in natura è svolto dagli insetti vettori, tipicamente floemomizi, con apparato boccale pungente-succhiante, appartenenti alle famiglie Cixiidae e Cicadellidae, sezione Auchenorryncha [Conti e Vidano, 1988, Alma e Conti, 2002] e alla famiglia Psyllidae, sezione Sternorrhyncha [Carraro et al., 1998; Tedeschi e Alma, 2004]. Le fitoplasmosi della vite (giallumi) sono otto, appartenenti a cinque diversi gruppi. In Europa sono noti i giallumi causati da fitoplasmi del gruppo Stolbur, 16SrXII-A: Bois Noir (BN) in Francia, Vergilbunskrankheit (VK) in Germania, Legno nero (LN) in Italia, trasmessi da Hyalesthes obsoletus (Cixiidae); e del gruppo EY, 16SrV-A: PGY in Germania, trasmesso da Oncopsis alni, e la Flavescenza dorata (FD) (sottogruppi –C e –D), trasmessa da Scaphoideus titanus (Cicadellidae). In Italia sono presenti solo FD e LN. Delle due malattie, FD è la più preoccupante e causa gravi perdite economiche, dato il carattere epidemico e la monofagia dell’insetto vettore. Attualmente, FD è presente anche in Francia, Corsica, Spagna, Slovenia, Serbia e Svizzera. In Italia è presente in tutto il nord e in alcune regioni del centro. Il vettore S. titanus è neartico, introdotto in Europa alla fine degli anni ‘50 e attualmente presente in dieci Paesi. In Italia è diffuso in tutto il nord, in Emilia-Romagna, Toscana, Lazio, Umbria, Campania e Basilicata. Compie una generazione l’anno e sverna come uovo deposto sotto la corteccia. I giovani, presenti da maggio ad agosto, colonizzano prevalentemente le foglie basali ed hanno una distribuzione di tipo aggregato. Il fitoplasma è acquisito dalle ninfe. Gli adulti sono presenti da luglio fino alla metà di ottobre. Il LN è ampiamente diffuso in Europa, in Ucraina e in Medio Oriente. In Italia è pressoché ubiquitario, negli ultimi anni la sua diffusione è in preoccupante crescita. Il vettore H. obsoletus è una specie paleartica. I giovani si nutrono sulle radici di dicotiledoni erbacee, in particolare ortica e convolvolo; gli adulti si nutrono sulle foglie e occasionalmente possono spostarsi sulla vite alla quale trasmettono il fitoplasma. Compie una generazione l’anno e sverna come giovane sulle radici delle piante ospiti.
Il controllo dei fitoplasmi è piuttosto complicato, poiché non esistono metodi curativi efficienti: la lotta diretta tramite l’utilizzo di antibiotici è poco efficace, oltre che proibita dalla legge italiana, così come risultano di importanza relativa e non risolutivi la somministrazione di composti a base di metalli pesanti oppure l’uso del calore. Attualmente, l’unico metodo efficace di controllo è la prevenzione, attraverso la lotta agli insetti e l’impiego di materiale vegetale sano. Nonostante l’importanza di S. titanus e H. obsoletus nella trasmissione di fitoplasmosi dannose come FD e LN, poco si conosce del microbiota simbionte associato. Peraltro diverse ricerche hanno dimostrato che i microrganismi simbionti spesso hanno un ruolo importantissimo ed in molti casi determinante per il completamento ed il mantenimento del ciclo biologico degli insetti. L’importanza dei microrganismi simbionti nel ciclo vitale degli insetti ha delineato nuove potenziali strategie di controllo delle malattie da essi trasmesse attraverso l’impiego dei simbionti come agenti di controllo per bloccare la trasmissione dei patogeni. Ad esempio recentemente è stato proposto che la trasmissione dell’agente della malattia di Pierce nella vite, il batterio Xylella fastidiosa, potrebbe essere controllata da un batterio antagonista presente nell’insetto vettore Homalodisca coagulata [Bextine et al., 2004]. Tale strategia potrebbe essere valutata anche per il biocontrollo delle fitoplasmosi della vite e in particolare di FD e LN. Da questo punto di vista, i batteri simbionti sono stati proposti per il controllo di popolazioni di insetti nocivi o per ridurre la loro capacità vettrice secondo un approccio denominato SCS, acronimo per “Symbiont-Based Control Strategies”. Questa metodica, o per meglio dire, insieme di metodi, risulta eco-sostenibile e può sostituire il controllo chimico basato sull'utilizzo di insetticidi [Beard et al, 1993]. Due approcci in particolare sembrano avere un interessante potenziale applicativo:i) l'eliminazione del microrganismo simbionte (o l'interferenza con le sue funzioni) necessario all'insetto nocivo e ii) la manipolazione del microrganismo con il maggior impatto sul "fenotipo" nocivo dell'insetto (capacità di trasmettere malattie, resistenza a nemici naturali) o del simbionte che va a localizzarsi in particolari aree anatomiche dell'ospite. E' comunemente accettato che questi tratti ecologici correlati alla nocività siano attribuibili ad una specifica attività genetica, espressione del genoma dell'insetto. Ciò nonostante, un numero ragguardevole di esperienze recenti tendono a dimostrare che lo status nocivo attribuibile ad un dato insetto è principalmente determinato dal genotipo del simbionte piuttosto che a quello dell'ospite. Molti studi si sono focalizzati sull'analisi dei batteri simbionti residenti nell'intestino medio di formiche e termiti (van Borm et al, 2002; Harazono et al, 2003). Il contributo nutrizionale di questi microrganismi intestinali in condizioni di diete sub-ottimali è alquanto rilevante; inoltre l'intestino degli insetti sembra essere un "hot spot" per il trasferimento genico tra differenti microrganismi. L'analisi genetica può fornire nuove prospettive nello studio delle comunità batteriche associate ad insetti (ed in particolare di quelle a localizzazione intestinale) contribuendo a definire le basi molecolari delle relazioni tra insetti e microbiota.
Negli anni recenti molti sforzi di ricerca, anche da parte del gruppo proponente il progetto, sono stati focalizzati sui microrganismi che stabiliscono con l’insetto ospite una stretta relazione di simbiosi. In particolare alcuni batteri possono stabilmente colonizzare a livello intracellulare il sistema riproduttivo dell’insetto ed essere trasmessi verticalmente alla progenie [Gil et al. 2004]. Questi batteri possono avere importanti effetti sul ciclo vitale dell’insetto ed interferire con la riproduzione determinando incompatibilità citoplasmatica, partenogenesi, femminizzazione, ecc. A fianco delle tradizionali metodologie microbiologiche basate sulla coltivazione, sono ora disponibili una serie di metodologie consolidate basate sull’analisi di geni ribosomali che permettono di individuare anche quei microrganismi che non sono coltivabili [Amann et al., 1995; von Witzingerode et al., 1997; Head et al., 1998]. Tra queste metodologie si annoverano la costruzione di librerie del gene codificante per il 16S rRNA o la separazione dei frammenti amplificati mediante DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) [Muyzer et al., 1993], od ancora i metodi semiautomatizzati che presentano una maggiore sensibilità della DGGE come ad es. i T-RFLP (Terminal-RFLP) [Liu et al., 1997] che basano la separazione dei prodotti di amplificazione in sequenziatori di DNA automatici. La disponibilità di una completa piattaforma di ecologia molecolare presso la UR3 apre la prospettiva per una caratterizzazione dettagliata della microflora associata alle due cicaline vettrici delle due maggiori fitoplasmosi della vite.
Le recenti ricerche sulla microflora associata a S. titanus, condotte dal gruppo di ricerca proponente il presente progetto, hanno permesso di individuare in diversi distretti corporei di S. titanus, un batterio simbionte affine a ‘Candidatus Cardinium hertigii [Marzorati et al., 2006; Bigliardi et al., 2006]. Tale endosimbionte è stato individuato in uova, corpi grassi e in particolare nelle ghiandole salivari dove co-localizza con il ‘Ca. Phytoplasma vitis’ agente della FD. Indagini preliminari hanno evidenziato la presenza di Ca. Cardinium hertigii anche nel vettore del LN H. obsoletus. Inoltre, recentemente, il gruppo di laboratori proponente ha individuato un batterio acetico del genere Asaia come uno dei microrganismi dominanti nelle zanzare del genere Anopheles [Favia et al., 2007] e di S. titanus [Marzorati et al., 2006] dove potrebbe svolgere un importante ruolo nel ciclo biologico dell’ospite. Questo microrganismo è risultato anche facilmente trasformabile ed è stato marcato sul suo genoma con una cassetta genica codificante per una proteina fluorescente che ha permesso di studiare nel dettaglio le modalità di colonizzazione del corpo dell’insetto, nonché le modalità di trasmissione [Favia et al., 2007].
La disponibilità di metodologie molecolari per caratterizzare anche i microrganismi non coltivabili associati alle cicaline vettori, e quella di protocolli di trasformazione genetica dei batteri coltivabili aprono le prospettive per approfondire lo studio delle interazioni tra insetto e microbiota simbionte, sia per comprendere la biologia di base dell’interazione che per sfruttare tale interazione per interferire con la trasmissione dei fitoplasmi in generale e in particolare degli agenti eziologici di FD e LN causa di ingenti danni economici alla vite. <<<