RICERCA ITALIANA     

Interferenti ambientali sul sistema endocrino: approccio nanotecnologico

Università di Pisa

Abstract

Gli interferenti endocrini (TDs) sono molecole che alterano il funzionamento tiroideo, modificando sia la produzione che, più in generale, il metabolismo degli ormoni tiroidei. L’esposizione prolungata a questi composti comporta, tra gli effetti più evidenti, la comparsa di diverse forme di tiroiditi o, nei casi più gravi, del gozzo. Sebbene la maggior parte dei TDs noti in letteratura siano per lo più composti chimici di sintesi, come pesticidi o fungicidi, le piante sono anch’esse in grado di produrre metaboliti secondari con azione antitiroidea o antigonadotropica.
Tra questi i fitoestrogeni (essenzialmente isoflavonoidi e lignani), presenti in molte leguminose e, in particolar modo nella soia, possono interferire non solo con il metabolismo degli estrogeni, ma anche a livello della perossidasi tiroidea (TPO). Inoltre, sono presenti studi in cui gli acidi fenolici presenti in molte piante medicinali (Lamiaceae e Boraginaceae) potrebbero inibire l’attività e il metabolismo del sistema endocrino.Gli interfenti endocrini che mostrano una inibizione significativa sono il DDT un noto pesticida, l’Aroclor 1254 appartenente ai PCB e la Melissa Officinalis che è un flavonoide. I flavonoidi (un interferente endocrino di origine naturale) per la loro azione antiossidante, sono costituenti organici di tutte le piante superiori, molti dei quali sono presenti nella dieta di molte popolazioni. Tra le ghiandole endocrine, la tiroide, per il suo normale funzionamento, dipende dall’assunzione alimentare di iodio, quindi, la sua azione risulta particolarmente suscettibile alle modificazioni ambientali esterne. I pesticidi più impiegati sono gli anticrittogamici, che svolgono un’azione contro patogeni fungini, e gli insetticidi. I principi attivi maggiormente persistenti sono cyprodinil, diclofluanide, metalaxil, tolclofos-metile, che vengono comunemente impiegati sulle colture di fragola, lattuga e pomodoro La presente ricerca si instaura in un progetto multidisciplinare rivolto alla individuazione del materiale vegetale idoneo per la valutazione dell'impatto di alcuni pesticidi sulla salute umana (in particolare sul sistema endocrino, con riferimento agli organi riproduttivi e tiroide). Saranno impiegate alcune specie orticole (lattuga, pomodoro) e frutticole (fragola), coltivate in diversi sistemi di coltura protetta. Il progetto prevede quindi l’impiego dei pesticidi più frequentemente utilizzati in queste colture. Uno degli scopi principali sarà quello di selezionare materiale vegetale, proveniente da coltivazioni sia in vivo che in vitro, per l’individuazione di specifici metaboliti secondari in grado di interferire con il sistema endocrino. Particolare attenzione verrà posta anche ai metodi di estrazione di metaboliti secondari e a tutti quei parametri ambientali, come luce, temperatura, scambi gassosi e substrati colturali in grado di influenzare, in vivo ed in vitro, la crescita della piante e, potenzialmente, la produzione dei metaboliti secondari. Gli estratti così ottenuti verranno sottoposti a differenti saggi biologici, per testarne l’attività antitiroidea ed antigonadotropica. Per verificare l’effetto dei pesticidi e di alcune piante medicinali (Lamiaceae e Boraginaceae) con i propri metaboliti, come i flavonoidi sull’attività del recettore del TSH, sarà usata una linea cellulare che esprime stabilmente il recettore stesso. Poiché il recettore del TSHr, mostra una sequenza aminoacidica e analogie strutturali con gli altri recettori ormonali glicoproteici, come il recettore per l’ormone luteinizzante (LHr) e il recettore per l’ormone follicolo stimolante (FSHr) saranno studiati gli stessi effetti su linee cellulari che esprimono stabilmente FSHr e LHr. Inoltre sarà studiata la biodisponibilità di alcune sostanze chimiche in risposta alla produzione di cAMP, attraverso un monitoraggio in tempo reale effettuato su colture cellulari e proteine fluorescenti usate come nanoinidicatori. Infatti, il livello di Ca e di ioni protonici risulta strettamente legato alla condizione metabolica delle cellule, per cui il loro monitoraggio può fornire informazioni utili sulla biodisponibilità delle sostanze esogene introdotte nel progetto. Un altro scopo del presente progetto sarà quello di esaminare alcune sostanze chimiche comunemente utilizzate come farmaci nella pratica clinica che potrebbero inibire l’attività del trasportatore NIS attraverso l’utilizzo di una linea cellulare CHO che esprime stabilmente hNIS. Il trasportare umano sodio/iodio (hNIS) è una glicoproteina di membrana plasmatica che media il trasporto attivo dello ioduro nelle cellule follicolari tiroidee, fase cruciale nella biosintesi degli ormoni tiroidei. Per poter valutare l’effetto citotossico delle sostanze da analizzare, saranno effettuati dei test di vitalità cellulare.Per verificare il potenziale effetto inibitorio delle stesse sostanze, saranno effettuati saggi di captazione dello iodio attraverso studi di preincubazione e coincubazione. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Claudia Mammoli Università degli Studi di PISA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Lo scopo della presente ricerca si instaura in un progetto multidisciplinare rivolto alla individuazione del materiale vegetale idoneo per la valutazione dell'impatto di alcuni pesticidi sulla salute umana, in particolare sul sistema endocrino, con riferimento agli organi riproduttivi e tiroide.
Il progetto si suddivide in differenti sezioni.
•Individuazione e coltivazione in vivo ed in vitro di specie e genotipi particolarmente utili ai fini della produzione di specifici metaboliti secondari in grado di interferire con il sistema endocrino. Saranno quindi realizzati sistemi di coltura in vitro delle diverse specie con lo scopo di ottenere una fonte di materiale vegetale per la produzione di piante in vivo e per la realizzazione di colture di tessuti e di cellule da utilizzare direttamente per l’estrazione e l’analisi dell’attività biologica oggetto di studio. Dopo estrazione il materiale vegetale sarà analizzato con differenti sistemi biologici per valutare l’attività antitiroidea a antigonadotropica;
•Per la crescita di alcune specie vegetali (e frutta) in differenti sistemi di coltivazione, si utilizzano pesticidi, da soli o in combinazione, durante particolari periodi del ciclo di coltura. Seguendo un timing preciso di raccolta del materiale saranno effettuate estrazioni per l’individuazione di metabolici prodotti dalla detossificazione dei principi attivi somministrati.
•Analisi con differenti sistemi biologici per investigare le sostanze chimiche usate come farmaci nella pratica clinica che potrebbero inibire il trasporto del NIS mediato dalla captazione dello iodio.
•Gli effetti dei pesticidei, PCB e di alcune piante medicinali(Lamiaceae e Boraginaceae) e dei loro metaboliti(flavonoidi) saranno studiati per valutare il loro effetto sull’attività del TSHr espresso stabilmente in cellule eucariotiche. Poiché il TSHr mostra somiglianze strutturali e aminoacidiche con gli altri recettori degli ormoni glicoproteici come LHr e FSHr, gli stessi effetti saranno studiati su linee cellulari che esprimono stabilmente LHr e FSHr.
•Inoltre sarà studiata la biodisponibilità di alcune sostanze chimiche in risposta alla produzione di cAMP, attraverso un monitoraggio in tempo reale effettuato su colture cellulari e proteine fluorescenti usate come nanoinidicatori. Infatti, il livello di Ca e di ioni protonici risulta strettamente legato alla condizione metabolica delle cellule, per cui il loro monitoraggio può fornire informazioni utili sulla biodisponibilità delle sostanze esogene utilizzate. <<<

Risultati parziali attesi

I risultati del progetto derivano da una collaborazione tra le diverse competenze delle Unità Operative coinvolte nel progetto.
Sarà selezionato materiale vegetale, proveniente da coltivazioni sia in vivo che in vitro, per l’individuazione di specifici metaboliti secondari in grado di interferire con il sistema endocrino mediante un’azione antitiroidea o antigonadotropica A questo proposito, verranno prese in considerazione tecniche di coltivazione tradizionali e fuori suolo che prevedono la produzione in ambiente protetto, come serre e celle climatizzate. Particolare attenzione, inoltre, verrà posta a tutti quei parametri ambientali, come luce, temperatura ed umidità relativa, in grado di influenzare la crescita della piante e, potenzialmente, la produzione dei metaboliti secondari.
Poiché i metaboliti secondari possono essere prodotti in diverse fasi di sviluppo delle piante, il materiale vegetale sarà raccolto durante questo periodo.
Allo stesso tempo, sarà adottato un approccio in vitro per ottenere una fonte di materiale vegetale in vivo e di usare tessuti e colture cellulari per l'estrazione di metaboliti secondari e la loro successiva analisi con saggi biologici.
Infatti, uno dei principali obiettivi sarà lo studio della coltivazione di alcune specie vegetali largamente commercializzate in Italia, somministrando vari pesticidi in particolari periodi del ciclo colturale per valutare l’impatto di queste sostanze sul sistema endocrino umano.
Perciò, in questo progetto sarà standardizzato un metodo che permetta l’identificazione delle sostanze esogene in grado di interferire con la produzione di cAMP indotta dal TSH, FSH e LH utilizzando delle linee cellulari CHO che esprimono stabilmente i recettori degli ormoni suddetti e utilizzando una linea cellulare (CHO-hNIS) che esprime stabilmente la proteina umana del trasportatore sodio/iodio hNIS. Il recettore del TSH insieme con i recettori FSH e LH appartiene alla famiglia del recettore delle glicoproteine e mostrano un’elevata omologia aminoacidica. Aroclor 1254, DDT e gli estratti di piante possono esercitare sul recettore dell’FSH la stessa attività inibitoria osservata con il recettore del TSH, suggerendo un meccanismo comune di inibizione in entrambi i recettori. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

I fattori ambientali che interferiscono con la funzione della tiroide o con l’azione dell’ormone tiroideo alterando l'omeostasi della tiroide, vengono definiti interferenti endocrini (ED). Gli interferenti endocrini (TDs) sono molecole in grado di alterare il funzionamento tiroideo, modificando sia la produzione che, più in generale, il metabolismo degli ormoni tiroidei. L’esposizione prolungata a questi composti comporta, tra gli effetti più evidenti, la comparsa di diverse forme di tiroiditi o, nei casi più gravi, del gozzo. Sebbene la maggior parte dei TDs noti in letteratura siano per lo più composti chimici di sintesi, come pesticidi o fungicidi, le piante sono anch’esse in grado di produrre metaboliti secondari con azione antitiroidea o antigonadotropica.
Le recenti scoperte, riguardo all’azione degli ED sugli esseri umani non sono effettivamente basate su dati dimostrabili, ma solo su un insieme di osservazioni, effettuate su un gruppo di studio in cui è possibile notare delle alterazioni sul sistema endocrino o su modifiche nel sistema riproduttivo In letteratura emergono molti studi effettuati per dimostrare come sia possibile verificare un aumento del tumore testicolare, azoospermia, criptorchidismo e ipospadia in pazienti sottoposti ad interferenti endocrini. Esistono diversi studi in letteratura per dimostrare se gli interferenti endocrini prolungando l’attività degli estrogeni possano essere considerati fattori causali nell’insorgenza del cancro della mammella. Sono stati identificati oltre 500 interferenti endocrini che con la loro azione estrogenica alterano il sistema endocrino ma non vi sono sufficienti dati per stabilire se l’esposizione a questi interferenti possa causare effettivi rischi all’apparato riproduttivo. Esistono altri potenziali meccanismi di azione degli ED in grado di alterare il sistema endocrino a livello cellulare, interagendo con i recettori steroidei (agonisti), bloccandone la loro azione (antagonisti) oppure interferendo con il metabolismo e la sintesi degli steroidi. Gli interferenti chimici tiroidei sono degli xenobiotici in grado di alterare la struttura e la funzione tiroidea, e comprendono una vasta gamma di sostanze chimiche, come ad esempio il perclorato, che è in grado di inibire la captazione dello iodio nella ghiandola tiroidea, con conseguente diminuizione della sintesi degli ormoni tiroidei. Esistono anche altri composti chimici quali la tionammide, l’amitrolo e l’etilentiourea, che sono in grado di inibire la sintesi della perossidasi tiroidea. Anche se nell’ambiente le sostanze che alterano il sistema endocrino sono sostanze chimiche, in natura troviamo nelle piante, anche sostanze come pesticidi o fungicidi (fitoestrogeni, isoflavonoidi, lignani), in grado di produrre metabolici secondari che sono in grado di interagire con l’attività di sintesi tiroidea e gonadotropica. I fitoestrogeni sono composti vegetali che possono interagire con l’attività riproduttiva negli animali, a causa della presenza di estrogeni naturali con cui competono. Inoltre in piante medicinali, appartenenti alla famiglia delle Boraginaceae e delle Lamiaceae, studi recenti hanno dimostrato la presenza di acidi fenolici, come l’acido clorogenico e litospermico, che si trova nella Lithospermum, la cui attività antigonadotropica è in grado di inibire la produzione di LH e aumentare la secrezione di FSH. Diversi metaboliti, incluso l’acido caffeico (presente nella melissa e nel timo), l’acido clorogenico e l’ellagico (trovati nelle specie di Lithospermum and Lycopus), sono in grado di inibire la secrezione degli ormoni tiroidei ed il legame del TSH al suo recettore. Negli ultimi 60-70 anni si è verificato un considerevole inquinamento ambientale dovuto all’uso indiscriminato di pesticidi in agricoltura. I pesticidi si utilizzano per impedire che le coltivazioni agricole vengano attaccate da vari tipi di infestanti. I pesticidi possono essere classificati in base alla classe chimica cui appartengono (diocarbammati, organofosforati, piretroidi), oppure al tipo di utilizzo; in tal caso le categorie principali sono quattro: antiparassitari (che comprende anticrittogamici, che combattono funghi, batteri e virus, acaricidi, nematocidi, insetticidi, limacidi e rodenticidi), diserbanti o erbicidi (per combattere le erbe infestanti), fumiganti (usati per sterilizzare i terreni) e fitoregolatori, utilizzati per anticipare la fioritura, o favorire l'allegagione dei frutti, uniformarne la pezzatura e aumentare la produzione I pesticidi utilizzati per eliminare insetti e funghi in agricoltura lasciano tracce eccessive nella frutta e verdura che utilizziamo. Il più elevato residuo di pesticidi è stato trovato nella lattuga, seguita da uva, fragole, mele e pomodori. Per la loro stessa natura i pesticidi possono risultare pericolosi all'uomo o agli altri animali, in quanto il loro scopo è di uccidere o danneggiare gli organismi viventi. . Gli effetti dannosi sulla salute provocati dai pesticidi sono proporzionali alla quantità di sostanza assorbita e ai tempi di esposizione, oltre che alle caratteristiche proprie di ciascuna sostanza.
La maggioranza dei pesticidi oggi in uso ha effetti neuro tossici sull’uomo. In particolare gli organofosforici (il Clorphirifos è il più diffuso) che sono una classe di pesticidi largamente impiegati in agricoltura Tra i casi più gravi ed eclatanti, risulta urgente attirare l’attenzione sui rischi associati all'impiego fungicidi ditiocarbammati (etillene-bisditiocarbammati, EBDC) tipo Mancozeb e Maneb. Questi prodotti, di per sè considerati a bassa tossicità, vengono metabolizzati rapidamente nell’organismo e nell’ambiente, generando un metabolita molto tossico la etilentiourea (ETU) che ad alte dosi diventa un vero e proprio teratogeno per il feto di mammiferi producendo malformazioni (Belpoggi et al. 2002) ma è anche un potente tireostatico, ovvero interferisce con lo sviluppo della tiroide e con i livelli di ormoni tiroidei e ne provoca il cancro. <<<