RICERCA ITALIANA     

Caratterizzazione biologica e molecolare di Grapevine rupestris stem pitting associated virus (GRSPaV)

Università degli Studi di Bari

Abstract

Grapevine rupestris stem pitting-associated virus (GRSPaV) è una specie del genere Foveavirus, famiglia Flexiviridae, identificata meno di 10 anni fa in viti affette da Rupestris stem pitting (RSP) e, pertanto considerata possibile agente causale dell’alterazione. RSP rappresenta una delle quattro sindromi di una complessa malattia virus-simile della vite, il “Legno riccio”, nota per essere tra le più dannose per questa specie. Nonostante la gravità dei danni causati ad una coltura di primo piano nell’economia agricola, l’eziologia della malattia è ancora incerta e, conseguentemente, la sua diagnosi è al momento effettuata in maniera esaustiva solo per via biologica, mediante innesto su indicatori legnosi e con protocolli che necessitano di almeno due-tre anni. Tempi così lunghi rappresentano evidentemente il collo di bottiglia dell’attuale sistema di accertamento dello stato sanitario della vite e generano la necessità di ricercare più rapidi metodi alternativi, che necessariamente devono passare attraverso la definizione dell’Agente eziologico. In questa direzione, il Progetto si propone di chiarire alcuni aspetti delle proprietà biologiche e molecolari di GRSPaV, il cui coinvolgimento nel determinismo di RSP, e più recentemente della “necrosi delle nervature” (un’altra virosi minore della vite) non è stato ancora pienamente accertato, con l’obiettivo di definirne il ruolo eziologico, e conseguentemente ridurre la mole dei saggi biologi per l’accertamento dello stato sanitario del germoplasma viticolo. Relativamente alla definizione del ruolo eziologico del virus nel determinismo della Necrosi delle nervature, questa sarà effettuata in stretta collaborazione con la Sezione “Biologia e Difesa” dell’Istituto di Viticoltura del CRA, anch’esso coinvolto in questo Progetto, al fine di chiarire i dubbi emersi a seguito di alcuni dati discordanti ottenuti precedentemente presso lo stesso Istituto. Circa il ruolo del virus nel determinismo di RSP, sarà verificata la reazione di specie indicatrici sane all’infezione in purezza del virus e sarà avviato lo studio del significato biologico della notevole variabilità genetica riscontrata nella popolazione di questo virus; inoltre l’attività del Progetto sarà mirata ad ottimizzare le metodiche di diagnosi e di risanamento, come pure alla conoscenza di alcuni aspetti importanti della sua biologia, quali la trasmissibilità per seme.

L'attività di ricerca prevista può essere pertanto sintetizzata nei seguenti punti:

-(Bari, Milano, Pisa) Identificazione ed analisi di varianti geniche di GRSPaV e individuazione di accessioni di vite singolarmente infette da ciascuna variante (fonti pure)
-(Bari, Milano) Verifica del ruolo delle diverse varianti geniche di GRSPaV nel determinismo della “butteratura del legno di V. rupestris”
-(Pisa, Bari, Milano) Verifica del ruolo delle diverse varianti geniche di GRSPaV nel determinismo della "necrosi delle nervature"
-(Milano) Costruzione di trascritti infettivi di differenti varianti geniche di GRSPaV e verifica della replicazione in protoplasti di vite e tabacco;
-(Milano) Messa a punto di protocolli diagnostici innovativi per l’individuazione di GRSPaV e caratterizzazione degli isolati: sonde Taqman universali e specifiche per real time PCR;
-(Bari) Produzione di antisieri per la diagnosi di GRSPaV
-(Bari) Valutazione della efficacia dei metodi di risanamento nella rimozione di GRSPaV.
-(Bari) Verifica della trasmissibilità per seme di varianti diverse di GRSPaV. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Giovanni Martelli Università degli Studi di BARI

Obiettivo del Programma di Ricerca

Obiettivo del Progetto di ricerca è l’avanzamento nella conoscenza delle caratteristiche biologiche e della variabilità molecolare di Grapevine rupestris stem pitting-associated virus (GRSPaV), la cui definizione del ruolo eziologico nel determinismo della “Butteratura del legno di Vitis rupestris” (Rupestris stem pitting – RSP) e, più recentemente, della “Necrosi delle nervature” (Grapevine vein necrosis – VN) non è stata ancora pienamente accertata. In particolare, ci si propone di verificare la reazione di specie indicatrici sane all’infezione in purezza del virus e di ampliare le conoscenze sulla consistenza ed il significato biologico della notevole variabilità molecolare riscontrata nella popolazione di questo virus; inoltre si perseguirà il miglioramento delle metodiche di diagnosi e di risanamento e si studieranno alcuni aspetti importanti della sua biologia, quali la trasmissibilità per seme.
Il tutto sarà perseguito attraverso le seguenti linee di ricerca:
- Identificazione ed analisi di varianti geniche di GRSPaV e individuazione di accessioni di vite singolarmente infette da ciascuna variante (fonti pure)
- Verifica del ruolo delle diverse varianti geniche di GRSPaV nel determinismo della “butteratura del legno di V. rupestris”
- Verifica del ruolo delle diverse varianti geniche di GRSPaV nel determinismo della "necrosi delle nervature"
- Costruzione di trascritti infettivi di differenti varianti geniche di GRSPaV e verifica della replicazione in protoplasti di vite e tabacco;
- Messa a punto di protocolli diagnostici innovativi per l’individuazione di GRSPaV e caratterizzazione degli isolati: sonde Taqman universali e specifiche per real time PCR;
- Produzione di antisieri per la diagnosi di GRSPaV
- Valutazione della efficacia dei metodi di risanamento nella rimozione di GRSPaV.
- Verifica della trasmissibilità per seme di varianti diverse di GRSPaV. <<<

Risultati parziali attesi

RSP è una delle sindromi di una complessa malattia della vite, il “Legno riccio”, tra le più dannose per questa specie. Nonostante la gravità dei danni causati ad una coltura di primo piano nell’economia agricola, l’eziologia della malattia è ancora incerta e, conseguentemente, la sua diagnosi è al momento effettuata in maniera esaustiva solo per via biologica, mediante innesto su indicatori legnosi in pieno campo e con protocolli che necessitano di almeno due-tre anni. Tempi così lunghi rappresentano evidentemente il collo di bottiglia dell’attuale sistema di accertamento dello stato sanitario della vite e generano la necessità di ricercare alternative più rapide (saggi di laboratorio), che necessariamente devono passare attraverso la definizione di uno o più agenti eziologici. In questa direzione, il Progetto si propone di chiarire le proprietà biologiche e molecolari di GRSPaV, il cui coinvolgimento nel determinismo di RSP e della “necrosi delle nervature” non è stato ancora pienamente accertato.
I principali risultati attesi dall’attività di ricerca e gli sviluppi applicativi inerenti possono essere così sintetizzati:
a) Le sequenze geniche degli isolati di GRSPaV amplieranno le conoscenze circa la variabilità molecolare della popolazione del virus, con identificazione di accessioni “fonti pure” di varianti rappresentative dei cluster filogenetici.
Un più accurato disegno di primer diagnostici (per PCR standard o applicazioni real time) in regioni ad elevato grado di conservazione potrà abbattere la quota dei falsi negativi in campionamenti massali. Sequenze aminoacidiche variabili nei geni presi in esame, e conservate differenzialmente nei varianti, possono portare alla individuazione di determinanti di patogenicità (da verificare con i successivi studi con i trascritti infettivi e con le interazioni con il genoma di vite, ora interamente sequenziato e in via di annotazione).

b) Definizione del ruolo delle diverse varianti geniche del virus nel determinismo della “necrosi delle nervature”: questo risultato indicherà la definitiva possibilità di usare 110R come indicatore biologico, peraltro rapido ed utilizzabile in serra e in vaso, per discriminare le varianti geniche e/o patologiche del virus. Eventuali interferenze con l’induzione di sintomi o addirittura inabilità alla trasmissione per innesto di alcuni isolati potranno trovare risposta nell’analisi a livello genico.

d) Definizione del ruolo di GRSPaV nel determinismo di RSP. I risultati preliminari, già acquisibili nel Progetto (saggio biologico di accessioni su V. rupestris sana, per la validazione dei saggi già eseguiti su V. rupestris infetta) e la verifica del ruolo delle diverse varianti (che potrà essere solo avviata a causa dei tempi necessari per il saggio biologico) sono comunque di fondamentale importanza per la comprensione della biologia del patogeno (virulenza, interazioni fra ceppi, induzione/soppressione di silenziamento, etc). Coinvolgimento o sinergia di altri virus floematici (legati a RW) saranno valutati alla luce dei punti fermi raggiunti dal Progetto.

e) Costruzione di trascritti infettivi e verifica della replicazione in protoplasti di vite e tabacco. La possibilità di inoculare in purezza RNA (o virioni “accumulati” in protoplasti) permetterà di verificare la funzione dei singoli geni. La presenza di siRNA virus-specifici, facilmente rilevabili in infezioni in protoplasti di tabacco, aprirebbe la strada ad un futuro controllo del virus attraverso meccanismi di gene silencing.

f) Messa a punto di protocolli diagnostici innovativi per il rilevamento di GRSPaV e identificazione di isolati: sonde universali e specifiche per real time PCR; Antisieri specifici.
Proporre al vivaismo viticolo strumenti diagnostici validati e facilmente ed economicamente applicabili su larga scala permetterebbe un salto di qualità per il contenimento di un virus ubiquitario e sospettato di interferire pesantemente su qualità e quantità delle produzioni. Il solo vivaismo viticolo nazionale (dati 2000-2001) produce barbatelle (innestate e franche) pari a 114,5 milioni di unità, di cui 77 milioni ascrivibili alla categoria “certificato”. Molti cloni omologati di Vitis spp. sono al momento affetti da GRSPaV.

g) Valutazione della efficacia dei metodi di risanamento nella rimozione di GRSPaV e verifica della sua trasmissibilità per seme o polline.
Per quanto enunciato al punto f), l’impatto dei risultati del Progetto potrebbero essere considerevoli se si giungesse a disporre di germoplasma risanato (esente da GRSPaV). La diffusione primaria del virus avviene attraverso la propagazione vivaistica (di V. vinifera e portinnesti ) e l’uso di parentali infetti nel miglioramento genetico. Quindi efficaci tecniche di risanamento e un accurato e sensibile monitoraggio diagnostico sarebbero risolutive per la certificazione sanitaria di GRSPaV. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

E’ noto che le virosi della vite causano gravi danni alla qualità delle uve prodotte sia per il consumo fresco sia per la vinificazione. Per alcune di queste ampelopatie, tra cui per importanza primeggia il “Complesso del legno riccio”, gli strumenti per attuare adeguate e tempestive misure di prevenzione sono ancora molto scarsi. Il Legno Riccio (rugose wood, RW), malattia ad eziologia virale presente in tutte le aree viticole europee ed extraeuropee (Martelli, 1993), è un complesso cui concorrono quattro differenti sindromi: (a) "suberosi corticale" (corky bark, CB), (b) "scanalatura del legno di Kober 5BB" (Kober stem grooving, KSG), (c) "scanalatura del legno dell'ibrido LN 33" (LN stem grooving, LNSG); (d) "butteratura del legno di Vitis rupestris" (Rupestris stem pitting, RSP). Queste sindromi, rilevabili singolarmente per via biologica tramite innesto con gli indicatori LN 33, Kober 5BB e V. rupestris, inducono alterazioni macroscopiche a carico dei tessuti legnosi e floematici, quali butterature, scanalature e rugosità (Martelli, 2000).
Sperimentalmente due Vitivirus (Grapevine virus A, GVA, e Grapevine virus B, GVB) sono stati associati fino ad ora ad alcune sindromi della malattia, tuttavia il quadro eziologico risulta ancora lungi dall’essere definito e, pertanto, l’accertamento dello stato sanitario di qualunque accessione di vite è ancora dipendente, per il RW, dal saggio biologico (indexing) che, per i lunghi tempi necessari (almeno due anni), rappresenta il vero collo di bottiglia di tutto il sistema di accertamento dello stato sanitario della vite.
Le prime segnalazioni di RSP risalgono alla fine degli anni '80 e a tutt’oggi è segnalata in tutti gli areali dove è coltivata la vite (Martelli 1993), ma solo alla fine degli anni '90 sono state formulate le prime ipotesi sulla natura dell’agente eziologico (Minafra et al. 1997). Successivamente, due gruppi di ricercatori americani, in studi condotti separatamente, hanno individuato, in viti con sintomi di RSP, due virus denominati rispettivamente GRSPaV (Zhang et al. 1998) e RSPaV 1 (Meng et al. 1998). Le sequenze nucleotidiche dei due virus hanno un’elevata omologia, ed entrambi risultano simili ad Apple stem pitting virus. La disponibilità di questi dati ha permesso di classificare il virus associato a RSP come appartenente al genere Foveavirus (Martelli e Jelkmann 1998) e alla famiglia, di recente costituzione, Flexiviridae (Adams et al. 2004). Il genoma di GRSPaV è costituito da una molecola di RNA a singola elica, poliadenilato alla sua estremità 3’. Sono presenti regioni non codificanti all’ estremità 5’ (60nt) e all’estremità 3’ (140 nt) e 5 potenziali ORF, con una putativa ORF6 di circa 10K (analogamente presente in altri generi della famiglia) alla porzione 3’ terminale dell’acido nucleico. Caratteristica dei virus appartenenti al genere Foveavirus ed altri generi quali Potexivirus, Mandarivirus, Allexivirus e Carlavirus è la presenza del triplo blocco genico, codificante proteine funzionali dedicate al movimento intercellulare e sistemico.
Numerose segnalazioni di associazione di GRSPaV a RSP hanno portato a considerare questo virus quale possibile agente causale della sindrome. Tuttavia il frequente rinvenimento del virus anche in accessioni negative a RSP (Meng et al., 1999a; Meng et al., 2000; Nolasco et al., 2000) pone dei dubbi sul ruolo eziologico di GRSPaV. Inoltre un ulteriore elemento di complicazione è derivato dalla scoperta di infezione da GRSPaV delle fonti di V. rupestris utilizzate come indicatrici di RSP in numerosi laboratori impegnati nello studio di RSP (Minafra et al., 2000; Meng et al., 2000; Petrovic et al., 2000; Habili et al., 2006). La scoperta della contaminazione di V. rupestris potrebbe in parte spiegare le discrepanze riscontrate per l’ipotesi di associazione GRSPaV-RSP, ponendo dei dubbi sulla validità dei saggi biologici effettuati con gli indicatori contaminati. Un avanzamento in questa direzione sarà rappresentato dalla identificazione di fonti sicuramente sane di V. rupestris e dal loro impiego per la definitiva verifica dell’associazione virus-malattia. Ancora, un recente studio (Meng et al., 2005) ha dimostrato che il ceppo di GRSPaV presente in una accessione contaminata dell’indicatore V. rupestris è una variante latente e, inoltre, non interferente nelle prove di saggio biologico di altri isolati del virus. Se ciò risulterà vero anche per le fonti di V. rupestris utilizzate in altri laboratori (probabilmente originate da un’unica accessione di una collezione Californiana) si potranno considerare validi i risultati dei saggi precedenti. Emerge, quindi, la necessità di chiarire il ruolo biologico della variabilità di GRSPaV, potenzialmente responsabile della discordanza di alcune analisi con l’ipotesi di associazione a RSP. Diversi studi hanno accertato come all'interno della popolazione del virus siano individuabili varianti geniche con percentuali di omologia variabili in funzione della parte genomica indagata (Meng et al., 1999b; Rowhani et al., 2000; Nolasco et al., 2005). Anche in Italia indagini, condotte da Casati et al. (2003) e da Terlizzi e Credi (2003), hanno permesso di evidenziare su accessioni nazionali la presenza di almeno tre differenti gruppi genici, e analoghi risultati sono stati ottenuti dall’analisi di isolati identificati in viti argentine ( Talquenca et al. 2006).
Nel 2005, ricerche condotte da Meng e collaboratori hanno consentito di caratterizzare due nuovi isolati di GRSPaV. Il primo (GRSPaV-BS) è stato individuato sull'ibrido "Bertille Seyve 5563" infetto da "butteratura del legno di rupestris", mentre il secondo isolato (GRSPaV-SG), reperito su V. rupestris St. George, è risultato avirulento. Nello stesso anno sono stati pubblicati i risultati dell’analisi della variabilità della ORF5 (coat protein, CP) di 190 accessioni di viti in gran parte portoghesi (Nolasco et al., 2005), dalla cui analisi filogenetica è emersa la differenziazione in 4 distinti “cluster”, tre dei quali comprendenti i tre isolati di GRSPaV (1, SG1 e BS) completamente sequenziati da Meng et al. Infine Habili et al. (2006) presentano lo studio della variabilità molecolare del dominio della replicasi di GRSPaV in viti australiane in parte affette da “Syrah decline”, da cui emerge l’esistenza di una variabilità più elevata della replicasi rispetto alla CP e la ulteriore differenziazione degli isolati australiani dai gruppi filogenetici già segnalati da altri autori. Alla rapidità con cui si sta sviluppando questa massa di informazioni sulla variabilità genetica di GRSPaV manca tuttavia la corrispondente conoscenza del loro significato biologico. Uno studio svolto recentemente presso questa Unità Operativa (Bouyahia et al., 2006a) ha confermato l’associazione “parziale” GRSPaV-RSP: lo studio della variabilità genetica degli isolati concordanti e non con l’associazione potrà contribuire allo sforzo teso a definire il ruolo eziologico di GRSPaV.
La "necrosi delle nervature" (vein necrosis, VN) è una malattia simil-virale del genere Vitis, segnalata da Legin e Vuittenez nel 1973. Questa alterazione, la cui eziologia è tuttora ignota, si manifesta attraverso necrosi delle nervature di diverso ordine esclusivamente sulla pagina inferiore del suo indicatore specifico, l'ibrido V. rupestris x V. berlandieri 110 Richter, mentre è latente in V. vinifera e nella maggior parte delle specie e degli ibridi portinnesti. Lo stato infettivo in questione risulta ampiamente diffuso nelle principali aree vitivinicole mondiali, con incidenze spesso superiori al 70%.
Nell'ambito di un programma di ricerca, condotto presso il Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata dell'Università di Bari, volto ad una più precisa definizione dell'eziologia di VN è stata accertata una stretta associazione tra GRSPaV e VN. In particolare, indagini diagnostiche molecolari (RT-PCR) e sierologiche (Western blot) hanno permesso di accertare come il 98% delle accessioni positive a VN sia risultato infetto anche da GRSPaV, mentre solo il 2% delle piante negative abbia fornito risposta positiva a GRSPaV (Bouyahia et al., 2005). Successive indagini condotte da Bouyahia et al. (2006b) su germoplasma viticolo toscano (Sangiovese, Aleatico, Mammolo, Prugnolo gentile, Canaiolo Colorino), anch'esso caratterizzato da una idonea condizione fitovirologica (Triolo e Materazzi, 2000; Triolo e Materazzi 2004), e da Mslmanieh et al. (2006) su germoplasma viticolo Siriano hanno sostanzialmente confermato tali indicazioni. Tuttavia una parziale discordanza segnalata da Borgo et al. (2006) obbliga ad ulteriori verifiche prima di prendere definitivamente in considerazione l’impiego dell’ibrido 110 R (V. berlandieri x V. rupestris) come indicatore biologico di GRSPaV.
Oltre a confermare la stretta associazione tra GRSPaV e VN (100%), le ricerche svolte presso l’Università di Pisa (Bouyahia et al., 2006b) hanno permesso, utilizzando primers degenerati in grado di rilevare la presenza di tre gruppi genici (Gruppo I, Gruppo II e Gruppo III) diversi (Rowhani et al., 2000), di accertare quanto segue: (a) una rilevante diffusione sia singolarmente sia in associazione dei tre diversi gruppi genici nel materiale indagato (64,7%, 44,0% e 50,0% per il gruppo I, II e III, rispettivamente); (b) una completa corrispondenza tra la presenza del gruppo I e VN; (c) il rinvenimento in forma singola dei gruppi II e III in accessioni esenti da VN. Questi ultimi ritrovamenti hanno fatto ipotizzare che anche la manifestazione della necrosi delle nervature sia condizionata dalla variabilità genetica di GRSPaV, confermando in tal modo la necessità di definire il ruolo biologico delle diverse varianti del virus.
Purtroppo non esistono metodi in grado isolare in purezza ciascuna variante genica, rendendo difficile soddisfare i postulati di Koch. Un sistema per ovviare a questo inconveniente è la realizzazione di trascritti infettivi da utilizzare in prove di infezione sia in vitro (utilizzando protoplasti) sia in vivo. Ciò consentirebbe di chiarire i rapporti ospite-patogeno, come in parziale via di realizzazione per altri virus della vite (Saldarelli et al. 2000, Valat et al., 2003). D'altra parte anche per i virus della vite maggiormente studiati resta difficile l'infezione di piante e di protoplasti con trascritti infettivi virali. I recenti studi condotti su GVA (Haviv et al. 2006) se da un lato suggeriscono la possibilità di utilizzare costrutti virali per l'infezione di piante erbacee, dall'altro indicano la difficoltà di infettare piantine di vite. Infatti impiegando una tecnica che prevede l'agroinfiltrazione di cDNA full-lenght di GVA, inseriti in un vettore che porta il promotore CaMV 35S, l'efficienza di inoculazione è soltanto del 5%. D’altro canto lavori recenti condotti su Citrus Tristeza Virus (CTV, closterovirus floematico e non trasmissibile a piante erbacee) hanno messo in luce la possibilità di inoculare, con successo, piante di Citrus con trascritti infettivi, moltiplicati in protoplasti di Nicotiana e successivamente utilizzati come inoculo (Satyanarayana et al. 2001).
In riferimento ai metodi di diagnosi, la disponibilità di sequenze nucleotidiche di diversi isolati di GRSPaV ha permesso di disegnare differenti coppie di primer adatte alla sua individuazione in vite mediante saggi di retrotrascrizione e amplificazione genica (Nolasco et al. 2000, Dovas et al. 2003). L’incapacità ad estrarre in concentrazioni significative il virus dai tessuti infetti ha impedito la produzione dei tradizionali reagenti anticorpali, pertanto i pochi antisieri prodotti (Minafra et al., 2000; Petrovic et al., 2003) sono stati derivati da immunizzazioni con proteine ricombinanti. Essi hanno consentito l’individuazioni in vite tramite saggi di Western blot (Minafra et al. 2000, Meng et al. 2003). E’ stato inoltre possibile purificare parzialmente GRSPaV permettendone la sua visualizzazione e individuazione al microscopio elettronico grazie ad anticorpi ricombinanti (Petrovic et al. 2003).
Due ulteriori, ma non meno rilevanti, aspetti del problema, collegati alla definizione eziologica come alla pratica della propagazione vivaistica, sono la necessità di sperimentare valide ed efficaci tecniche di risanamento per GRSPaV e la verifica della sua ipotizzata trasmissibilità per seme. Fra i virus della vite, GRSPaV risulta essere fra i più recalcitranti alla eliminazione attraverso le tecniche normalmente impiegate (coltura in vitro di apici meristematici, abbinata o meno alla termoterapia)(I. Gribaudo, comunicazione personale). La definizione di protocolli di risanamento, anche con il ricorso a tecniche alternative quali la crioterapia (Wang et al., 2003) ai fini dell’ottenimento di piante sane di vite (portinnesti indicatori e varietà) da utilizzare come controllo nei saggi biologici (ed eventualmente da propagare nei circuiti del materiale omologato) resta un obiettivo di notevole interesse.
Altrettanto fondamentale per lo studio epidemiologico delle malattie associate a GRSPaV è la sua possibile trasmissione per seme. Rowhani et al. (2000) hanno per la prima volta evidenziato una bassa percentuale di trasmissione di GRSPaV attraverso il seme, plausibilmente attraverso ovuli di pianta madre infetta piuttosto che non da polline, data la relativa autogamia del genere Vitis. Resta da definire con maggior accuratezza se tale frequenza sia funzione anche delle varietà o specie infette e di eventuali determinanti legate ai diversi ceppi virali. <<<