RICERCA ITALIANA     

Meccanismi molecolari ed effetti biologici della resistenza agli antibiotici in cocchi e bacilli Gram-positivi

Università degli Studi di Catania

Abstract

Questo progetto mira a promuovere le attuali conoscenze sui complessi meccanismi dell’espressione della resistenza ai macrolidi in streptococchi, l’epidemiologia molecolare delle resistenze nel genere Lactobacillus, e il ruolo chiave di alcuni antibiotici sulla immunomodulazione della funzionalità dei fagociti nei confronti di streptococchi e lattobacilli sensibili e antibiotico resistenti. Quattro gli obiettivi principali: A) Studiare il meccanismo regolatore dell’espressione inducibile o costitutiva dei geni erm(A) ed erm(B); B) L’epidemiologia molecolare delle resistenze agli antibiotici di ceppi del genere Lactobacillus e l’epidemiologia molecolare degli isolati nell’uomo; C) Lo studio della regolazione della resistenza ai macrolidi mediata dai geni mef e il ruolo giocato dai fagi nella loro diffusione; D) Valutare l’efficacia della funzionalità dei PMN e/o macrofagi nell’eradicare specie differenti di lattobacilli antibiotico-resistenti (vancomicina e chinoloni) e ceppi di S.pyogenes, con differenti profili di eritromicino-resistenza (fenotipi M, cMLS ed iMLS), paragonandola a quella dei rispettivi ceppi sensibili.
La ricerca è biennale, ne fanno parte 3 unità operative. I singoli sottoprogetti saranno così organizzati per unità operativa.
Unita operativa 1
Il progetto ha due principali obiettivi:
A) Lo studio del meccanismo regolativo dell’espressione inducibile o costitutiva dei geni erm(A) ed erm(B). Questo obiettivo sarà articolato nelle seguenti fasi: Fase 1: Analisi della sequenza delle regioni a monte dei “peptide segnale” e “ribosomal binding sequence” dei geni erm(B) ed erm(A). - Fase 2: Clonaggio dei geni di resistenza. - Fase 3: Studio dei promotori dei geni di resistenza e analisi della dominanza dei genotipi.
B) L’epidemiologia molecolare delle resistenze agli antibiotici di ceppi del genere Lactobacillus isolati dall’uomo. Questo obiettivo sarà articolato nelle seguenti fasi: Fase 1: Reperimento di isolati freschi ed analisi retrospettiva sui ceppi di collezione. - Fase 2: Epidemiologia molecolare di Lactobacillus spp in campioni biologici umani mediante tecniche coltura-indipendente. - Fase 3: Determinazione del pattern di attività/resistenza versus betalattamici, chinoloni, macrolidi e licosamidi, glicopeptidi, aminoglicosidi, e cloramfenicolo. Fase 4: Determinazione dei genotipi di resistenza .
Unità operativa 2
Il progetto si pone l'obiettivo di trovare una risposta utile a molteplici ed interessanti quesiti: quale è il reale grado di variabilità e il profilo di espressione del locus mef-msr? Quale è l'associazione di tali variabili con il fenotipo di resistenza mostrato dal batterio? C'è un contributo effettivo alla diffusione di questo meccanismo di resistenza da parte dei fagi temperati? Quale è l'effetto del background genetico del ceppo sulla determinazione del livello di resistenza mediata da mef-msr? Lo studio approfondito della resistenza ai macrolidi mediata da sistemi di efflusso amplierà la conoscenza delle basi genetiche e molecolari di questo meccanismo fornendo indicazioni preziose per la corretta conduzione degli studi di epidemiologia molecolare. Ciò potrà avere una ricaduta diretta sulla terapia delle infezioni sostenute da S. pyogenes resistente ai macrolidi.
Unità operativa 3
Scopo di questa ricerca è valutare l’efficacia della funzionalità dei PMN e/o macrofagi nell’eradicare specie differenti di lattobacilli antibiotico-resistenti (vancomicina e chinoloni) e ceppi di S.pyogenes, con differenti profili di eritromicino-resistenza (fenotipi M, cMLS ed iMLS), paragonandola a quella dei rispettivi ceppi sensibili,al fine di mettere in luce le eventuali differenze nella sensibilità batterica ai fagociti in relazione al loro diverso profilo di resistenza. In particolare, saranno valutate sia l’attività fagocitaria che la capacità battericida intracellulare dei fagociti nei confronti di lattobacilli e di streptococchi sia sensibili che resistenti. Nella seconda fase della ricerca sarà valutata l’influenza esercitata dai più recenti macrolidi a 14, 15 e 16 atomi di C e dai ketolidi sul binomio S.pyogenes (ER ed ES)/PMN e Lactobacillus spp. (S/R)/macrofagi, per mettere in evidenza la loro eventuale capacità di modulare i meccanismi di difesa dell’ospite. In particolare, si valuterà l’effetto di questi farmaci sulla fagocitosi, sull’attività microbicida intracellulare nei confronti di alcuni ceppi di S. pyogenes e Lactobacillus spp. resistenti e sensibili, e l'effetto sul rilascio di citochine infiammatorie ed anti-infiammatorie da parte dei fagociti provenienti da soggetti immunocompetenti. Inoltre, l’influenza di questi farmaci sui sistemi di difesa aspecifici sarà valutata utilizzando anche PMN provenienti da pazienti uremici (emodializzati e trapiantati renali), dove il forte indebolimento della risposta fagocitaria, conseguente al grave stato di deficit immunitario, li rende particolarmente sensibili alle infezioni batteriche ad elevata morbilità e mortalità <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Pio Maria Furneri Università degli Studi di CATANIA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Questo progetto mira a promuovere le attuali conoscenze sui complessi meccanismi dell’espressione della resistenza ai macrolidi in streptococchi, dell’epidemiologia molecolare delle resistenze nel genere Lactobacillus, e del ruolo chiave di alcuni antibiotici sulla immunomodulazione della funzionalità dei fagociti nei confronti di streptococchi e lattobacilli sensibili e antibiotico resistenti.
Per raggiungere questi obiettivi il progetto pone le sue basi sull’interazione di 3 UO, ognuna dotata di conoscenze specifiche in settori diversi ma complementari, tutte caratterizzate da una riconosciuta competenza ed autorevolezza a livello internazionale nel campo della microbiologia. Il progetto si articola su diversi sottoprogetti che mirano ad approfondire diversi aspetti epidemiologici, molecolari e aspetti immunologici.
Le attuali conoscenze sulla diffusione dell’antibiotico-resistenza ne evidenziano un costante e progressivo aumento in modo preponderante in tutto il mondo. A causa di queste variazioni nella sensibilità ai farmaci da parte dei microrganismi patogeni,si rende sempre più necessario prendere in considerazione strategie terapeutiche innovative e alternative. Tuttavia, la completa efficacia di un agente antimicrobico in vivo non può essere soltanto determinata dai test di sensibilità in vitro, in quanto non sempre sono in grado di predire con certezza l’esito clinico dell’infezione. Essi, infatti,da soli risultano incompleti e insufficienti poiché non tengono conto di alcuni elementi fondamentali che giocano un ruolo chiave nell’infezione in vivo e nelle interazioni con il sistema immunitario dell’ospite,quali l’attività battericida del siero umano,la funzionalità e l’efficienza delle cellule di difesa dell’organismo spesso modulate dal farmaco somministrato,il rilascio di citochine indotto dalla presenza dell’antibiotico,la capacità dei fagociti di potenziare l’attività microbicida intracellulare dei farmaci e,ancora,l’effetto diretto esercitato da alcuni antibiotici sui fattori di virulenza dei batteri, parametri tutti molto importanti nell’impedire a un potenziale patogeno di innescare un processo infettivo e di diffonderlo. Recentemente il concetto emergente di immunomodulazione da parte degli agenti antimicrobici ha ricevuto un interesse mondiale. Pertanto,l’attuale strategia terapeutica richiede l’uso di farmaci che associno,oltre ad un’elevata attività antibatterica in vitro,anche la capacità di stimolare le difese immunitarie dell’ospite o,se non altro,di non interferire negativamente con esse.
Alla luce di queste considerazioni le varie linee di ricerca presenti in questo progetto si prefiggono i seguenti obiettivi principali: A) Studiare il meccanismo regolatore dell’espressione inducibile o costitutiva dei geni erm(A) ed erm(B); B) L’epidemiologia molecolare delle resistenze agli antibiotici di ceppi del genere Lactobacillus e l’epidemiologia molecolare degli isolati nell’uomo; C) Lo studio della regolazione della resistenza ai macrolidi mediata dai geni mef e il ruolo giocato dai fagi nella loro diffusione; D) Valutare l’efficacia della funzionalità dei PMN e/o macrofagi nell’eradicare specie differenti di lattobacilli antibiotico-resistenti (vancomicina e chinoloni) e ceppi di S.pyogenes, con differenti profili di eritromicino-resistenza (fenotipi M, cMLS ed iMLS), paragonandola a quella dei rispettivi ceppi sensibili
La ricerca è biennale ed il raggiungimento degli obiettivi specifici avviene attraverso la collaborazione con tutte le UO afferenti al progetto, che presentano specifiche competenze. Per lo studio dei meccanismi regolatore dell’espressione della resistenza mediata dai geni erm e mef (obiettivo A e C) saranno coinvolte le UO 1 e 2.
La UO 1 e 2, con specifiche competenze nel campo della biologia molecolare, intendono definire i meccanismi regolativi delle espressione dei geni erm (UO 1) e le modalità della resistenza ai macrolidi mediata dai geni mef e il ruolo giocato dai fagi nella la loro diffusione (UO 2). Dal punto di vista microbiologico, la ricerca condotta dalla UO 1 potrà fornire interessanti informazioni sulla modalità dell’espressione dei geni erm grazie allo studio dei promotori, nonché chiarire il ruolo dei singoli geni quando ritrovati associati tra loro e/o con quelli mef. Infatti, mentre è facile desumere il funzionamento/spegnimento del gene erm in associazione con mef in presenza di fenotipo compatibile con un solo gene, risulta più difficile evidenziare il ruolo dei singoli geni in presenza di fenotipi non compatibili con il genotipo. La ricerca condotta dall’UO 2 potrà, invece, chiarire: il reale grado di variabilità e il profilo di espressione del locus mef-msr; quale sia ruolo dell'associazione di tali variabili con il fenotipo di resistenza mostrato dal batterio; il ruolo del contributo alla diffusione di questo meccanismo di resistenza da parte dei fagi temperati; quale sia l'effetto del background genetico del ceppo sulla determinazione del livello di resistenza mediata da mef-msr. E’ di fondamentale importanza che tali informazioni provengano dallo studio di isolati clinici, e che i risultati ottenibili possano avere una ricaduta generale sulla miglior comprensione dell’evoluzione dei meccanismi di resistenza e di come certe strategie evolutive diano ai batteri un maggior successo adattativo.
L’UO 1 (obiettivo B), inoltre intende effettuare in una prima fase del progetto l’analisi retrospettiva dei ceppi di collezione presenti nelle collezioni batteriche dei rispettivi Dipartimenti per procedere, in seguito alla raccolta dei ceppi clinici di Lactobacillus spp., alla loro caratterizzazione dal punto di vista bio-molecolare dell’antibiotico-resistenza e la loro speciazione mediante metodiche biochimiche e molecolari. Una selezione di questi ceppi sarà fornita all’UO 3 per gli scopi del progetto. Inoltre, l’UO 1 studiando i campioni biologici umani mediante tecniche coltura-indipendente, intende ottenere una valutazione completa della circolazione epidemiologica delle varie specie comprese le non coltivabili.
L’UO 3 (obiettivo D), con specifiche competenze nello studio delle complesse interazioni tra antibiotici, patogeni e meccanismi immunitari di difesa, intende valutare l’efficacia della funzionalità dei PMN e/o macrofagi nell’eradicare specie differenti di lattobacilli antibiotico-resistenti (vancomicina e chinoloni) e ceppi di S.pyogenes, con differenti profili di eritromicino-resistenza (fenotipi M, cMLS ed iMLS), paragonandola a quella dei rispettivi ceppi sensibili,al fine di mettere in luce le eventuali differenze nella sensibilità batterica ai fagociti in relazione al loro diverso profilo di resistenza. Saranno valutate sia l’attività fagocitaria che la capacità battericida intracellulare dei fagociti nei confronti di lattobacilli e di streptococchi sia sensibili che resistenti. Nella seconda fase della ricerca sarà valutata l’influenza esercitata dai più recenti macrolidi a 14, 15 e 16 atomi di C e dai ketolidi sul binomio S.pyogenes (ER ed ES)/PMN e Lactobacillus spp. (S/R)/macrofagi, per mettere in evidenza la loro eventuale capacità di modulare i meccanismi di difesa dell’ospite. Quindi, si valuterà l’effetto di questi farmaci sulla fagocitosi, sull’attività microbicida intracellulare nei confronti di alcuni ceppi di S. pyogenes e Lactobacillus spp. resistenti e sensibili, e l'effetto sul rilascio di citochine infiammatorie ed anti-infiammatorie da parte dei fagociti provenienti da soggetti immunocompetenti. Inoltre, l’influenza di questi farmaci sui sistemi di difesa aspecifici sarà valutata utilizzando anche PMN provenienti da pazienti uremici (emodializzati e trapiantati renali), dove il forte indebolimento della risposta fagocitaria, conseguente al grave stato di deficit immunitario, li rende particolarmente sensibili alle infezioni batteriche ad elevata morbilità e mortalità. <<<

Risultati parziali attesi

Questo progetto mira a promuovere le attuali conoscenze sui complessi meccanismi dell’espressione della resistenza ai macrolidi in streptococchi, l’epidemiologia molecolare delle resistenze nel genere Lactobacillus, e il ruolo chiave di alcuni recenti antibiotici sulla immunomodulazione della funzionalità dei fagociti nei confronti di streptococchi e lattobacilli sensibili e antibiotico resistenti.
Per raggiungere questi obiettivi il progetto ha posto le sue basi sull’interazione di 3 UO, ognuna dotata di conoscenze specifiche in settori diversi ma complementari, tutte caratterizzate da una riconosciuta competenza ed autorevolezza a livello internazionale nel campo della microbiologia. Il progetto è stato articolato su diversi sottoprogetti che hanno mirato ad approfondire diversi aspetti epidemiologici, molecolari e immunologici.
Le varie linee di ricerca presenti in questo progetto si sono prefisse i seguenti obiettivi principali: A) Studiare il meccanismo regolatore dell’espressione inducibile o costitutiva dei geni erm(A) ed erm(B); B) L’epidemiologia molecolare delle resistenze agli antibiotici di ceppi del genere Lactobacillus e l’epidemiologia molecolare degli isolati nell’uomo ; C) Lo studio della regolazione della resistenza ai macrolidi mediata dai geni mef e il ruolo giocato dai fagi nella loro diffusione; D) Valutare l’efficacia della funzionalità dei PMN e/o macrofagi nell’eradicare specie differenti di lattobacilli antibiotico-resistenti (vancomicina e chinoloni) e ceppi di S.pyogenes, con differenti profili di eritromicino-resistenza (fenotipi M, cMLS ed iMLS), paragonandola a quella dei rispettivi ceppi sensibili.
Per meglio presentare i risultati essi saranno descritti per singolo obiettivo.

Obiettivo A.
Sin da quando scoperti i geni erm hanno riscosso un particolare interesse per il loro meccanismo di induzione. I risultati attesi dallo studio possono essere così descritti:
a)il meccanismo induzione e il ruolo del promotore;
b)l’organizzazione della struttura, completa, del promotore dei geni erm(A) ed erm(B);
c)il ruolo dei singoli geni (dominanza e/o codominanza) quando si riscontrano insieme, associati con mef, e insieme tra loro associati con mef;
d)organizzazione strutturale del promotore e suo ruolo nell’espressione costitutiva o inducibile.

Obiettivo B.
Per molti anni lo studio della selezione e della diffusione dell'antibiotico resistenza è stato condotto su batteri di rilevanza clinica. Di recente, molti ricercatori ritengono che batteri commensali, fra quali quelli lattici, potrebbero rappresentare un serbatoio di geni di antibiotico resistenza al pari dei batteri patogeni. Il pericolo maggiore associato ad una tale condizione è quello che essi possano trasferire tali geni a batteri patogeni. Del resto è noto che geni di resistenza per tetraciclina, eritromicina, e vancomicina sono stati riscontrati in Lactobacillus spp. isolati dall'uomo e dai cibi. Un certo numero di iniziative sono state approntate per affrontare le preoccupazioni di biosicurezza dall'uso di colture starter e microrganismi probiotici, anche perché vi sono numerose evidenze che dimostrano come in ambienti sotto stress di antibiotico i lattobacilli umani partecipino, al pari di altri batteri, a "sistemi di comunicazione" che trasferiscono geni di resistenza al di sopra del limite di specie e di genere. Alla luce di ciò i risultati previsti sono:
a) L’epidemiologia delle resistenza agli antibiotici dei ceppi appartenenti al genere Lactobacillus isolati dall’uomo.
b) L’epidemiologia delle specie di frequente riscontro umano sia quelle coltivabili che quelle non coltivabili

Obiettivo C.
I principali risultati prevedono l’ampliamento delle nostre conoscenze: sul grado di variabilità e il profilo di espressione del locus mef-msr; sull'associazione di tali variabili con il fenotipo di resistenza mostrato dal batterio; sul contributo effettivo alla diffusione di questo meccanismo di resistenza da parte dei fagi temperati; sull'effetto del background genetico del ceppo sulla determinazione del livello di resistenza mediata da mef-msr.
Lo studio approfondito della resistenza ai macrolidi mediata da sistemi di efflusso amplierà la conoscenza delle basi genetiche e molecolari di questo meccanismo fornendo indicazioni preziose per la corretta conduzione degli studi di epidemiologia molecolare. Ciò potrà avere una ricaduta diretta sulla terapia delle infezioni sostenute da S. pyogenes resistente ai macrolidi.

Obiettivo D.
A causa delle sempre più frequenti variazioni nella sensibilità ai farmaci da parte dei microrganismi patogeni, si rende sempre più necessario approfondire i diversi aspetti del comportamento dei microrganismi per approntare strategie terapeutiche innovative e, soprattutto, alternative.
In quest’ottica si colloca il nostro progetto. Per meglio presentare i risultati essi saranno descritti per singolo obiettivo.
Solo recentemente il concetto emergente di immunomodulazione da parte degli agenti antimicrobici ha ricevuto un interesse mondiale. Pertanto, l’attuale strategia terapeutica richiede l’uso di farmaci che associno, oltre ad un’elevata attività antibatterica in vitro, anche la capacità di stimolare le difese immunitarie dell’ospite, o se non altro, di non interferire negativamente con esse.
Questo progetto si prefigge come obiettivo principale quello di individuare fra i più recenti macrolidi e ketolidi quelli in grado di agire come veri “biological response modifiers” sul binomio batterio antibiotico resistente/ospite. In particolare, la potenziale attività immunomodulante di questi antibiotici sui vari meccanismi antimicrobici messi in atto dai fagociti di soggetti sani ed immunocompromessi verrà caratterizzata valutando parametri fondamentali quali la fagocitosi, il killing intracellulare e il rilascio di citochine pro e anti-infiammatorie,nei confronti di ceppi di lattobacilli resistenti a vancomicina e chinoloni e ceppi di S.pyogenes, con differenti profili di eritromicino-resistenza (fenotipi M, cMLS ed iMLS).
I risultati di questo progetto permetteranno quindi di incrementare le attuali conoscenze sui complessi meccanismi patogenici dell’infezione batterica sostenuta da patogeni antibiotico-resistenti e ad individuarne nuove strategie terapeutiche. E’ da sottolineare inoltre che il grave stato di compromissione immunitaria per difese alterate o anomalie sistemiche a livello di immunità umorale o cellulare,rende il paziente immunodefedato particolarmente sensibile alle infezioni microbiche sostenute da patogeni antibiotico-resistenti, a diagnosi spesso difficoltosa, gestione frustrante e prognosi severa tanto da costituire attualmente la causa più rilevante di morbilità e mortalità. Poiché in questi casi risulta difficile garantire un trattamento terapeutico opportuno ed ottimale, si ipotizza che i farmaci individuati da questo studio potranno rappresentare una valida applicazione per ottenere il ripristino del profilo immunologico di questi soggetti e la remissione totale della sintomatologia correlata. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Nel corso degli ultimi due decenni la diffusione dell’antibiotico-resistenza è andata aumentando in tutto il mondo [16]. Ciò rende necessario studiare approfonditamente i diversi aspetti del comportamento dei microrganismi per approntare strategie terapeutiche innovative e, soprattutto, alternative.
Gli streptococchi e i lattobacilli sono dei microrganismi che negli ultimi anni hanno riscosso un particolare interesse, i primi per l'aumentata resistenza verso i macrolidi, i secondi per il fatto che i batteri commensali potrebbero contribuire alla diffusione di geni di resistenza agli antibiotici. Sono tre i principali temi che tratteremo: a) Il meccanismo di resistenza all'eritromicina si conosce da 50 anni, tuttavia, non si conoscono tutti i meccanismi di regolazione dell'espressione; b) Quale ruolo,essendo commensali, ricoprono i Lattobacilli nella diffusione dei geni di resistenza agli antibiotici? c) Quali i nuovi approcci nella valutazione dell’attività antimicrobica degli antibiotici?
La resistenza ai macrolidi negli streptococchi, negli ultimi anni, è in aumento nella maggior parte dei paesi del mondo, e in Italia il livello di eritromicino-resistenza, in aumento dagli anni ’90, si aggira attorno a valori del 25% [3,15,52], e questo fenomeno ha fortemente attratto l'attenzione dei microbiologi clinici [40].
La resistenza ai macrolidi in S. pyogenes può svilupparsi secondo due meccanismi: modificazione del target [53-54] ed efflusso attivo del antibiotico [45].
Il primo è dovuto alla produzione di un enzima ad attività metilasica codificato dai geni della classe erm [53-54]. La metilazione ribosomiale è stato il primo meccanimo di resistenza all'eritromicina descritto. Il gene codifica una dimetilasi che agisce su una adenina in posizione 2058 dell'rRNA 23S [53-54]. La metilazione, riducendo l'affinità dell'antibiotico per il bersaglio comune, determina una resistenza crociata fra macrolidi, lincosamidi e streptogramine (MLSB) [53-54]. Il gene erm(B)codifica per una metilasi sia in modo costitutivo che inducibile. Se l'espressione è costitutiva, l'mRNA è attivo, e la traduzione porta alla metilazione della base ribosomiale [54]. Se è nella forma inducibile l'mRNA è sintetizzato in forma inattiva e necessità delle presenza di un induttore per essere attivato [54]. Nonostante, si conosca poco sui meccanismi regolativi dell'induzione di erm(B), alcune ipotesi sono state dedotte dal comportamento della regolazione traduzionale del gene erm(C)[54] tuttavia la regione regolatrice di erm(B) è più complessa [24]. Per spiegare l'espressione costitutiva sono stati invocati cambiamenti dell'attenuatore [24] o duplicazioni di basi alla fine del peptide segnale [34]. Un nuovo gene, erm(TR)[46], è stato isolato in Europa dal 38% nei ceppi di S.pyogenes eritromicin-resistenti [22,25,46]. Esso mostra l'82,5% di omologia con il gene stafilococcico erm(A) [33], ed è stato assegnato alla stessa classe di metilasi di tipo A [39]. Esso possiede delle sequenze segnale che sono coinvolte nella sua espressione [46,55]e sembra sia regolato come erm(C)[54-55]. L'espressione della metilasi è stata, inizialmente, considerata come inducibile, cioè resistenza solo contro i macrolidi, ma non ai lincosamidi[22]. Studi recenti hanno dimostrato l'espressione costitutiva di erm(A)[13,17-19,21, 55], e che l'estensione della resistenza ai ketolidi è dovuta al livello di metilazione [18]. L'espressione costitutiva è stata associata a delezioni di 163 e 6 bp, come pure a duplicazioni di 101 bp, nella porzione regolatrice del gene erm(A). Tuttavia, 2 ceppi costitutivi non hanno mostrato alcuna mutazione nell'attenuatore né nel gene, lasciando inspiegato il fenomeno[19]. Un'altro studio ha analizzato 10 differenti regioni a monte del gene: 3 mostravano modificazioni non significative della zona regolatrice, mentre 7 differenti organizzazioni della zone regolatrici erano presenti in ceppi cMLSB [17]. In S.agalactiae, il sequenziamento della regione a monte del gene erm(A) ha mostrato due differenti alterazioni. La maggior parte dei ceppi mostrava delle mutazioni puntiformi nel 2° peptide segnale e, in 4 ceppi, un frammento d'inserzione con elevata omologia a IS1381 e ad un gene per una trasposasi. Tutte queste mutazioni sono ritenute in grado di sovra-esprimere o rendere costitutiva l'espressione del gene erm(A) [13].
Il secondo meccanismo conosciuto è quello dell'efflusso attivo del macrolide per la presenza di pompe proteiche [49]. Esso conferisce al batterio una resistenza a basso livello nei confronti dei soli macrolidi a 14 atomi (ad es. l’eritromicina) e 15 atomi (azitromicina). I valori della MIC oscillano tra i 4 e 16 mg/L. Questo fenotipo è indicato come “fenotipo M”. All'interno della resistenza generale nei confronti dei macrolidi quella dovuta al fenotipo M ha acquisito nel tempo un'importanza sempre maggiore. Dai numerosi studi condotti in diversi paesi del mondo [2,30,37], si evince che la percentuale di prevalenza del fenotipo M raggiunge punte del 70%, con una media intorno a valori pari al 30-40%. La situazione nel nostro paese ricalca essenzialmente quella mondiale [22]. Clinicamente si è evidenziato che la resistenza ai macrolidi mediata da efflusso, sebbene di basso livello, può determinare il fallimento della terapia nel trattamento di infezioni sostenute da Gram-positivi. Le proteine responsabili dell'efflusso attivo dei macrolidi sono associate a membrana e vengono codificate dai geni della famiglia mef e della famiglia msr. In S. pyogenes sono state descritte quattro varianti del gene mef, che individuano altrettante sottoclassi. La variante principale è il mef(A), seguito dal mef(E), dal mef(O) e, infine, dal mef(I) [10,42]. Tutte le varianti sono costituite da “open reading frame (ORF)” della medesima lunghezza (1218 bp) e, di conseguenza, codificano per una proteina di 405 aminoacidi. Il grado di omologia esistente tra le varianti oscilla tra l’88,2% della coppia mef(A)-mef(O), al 94,3% della coppia mef(E)-mef(I). Tale variabilità può indicare una evoluzione in atto all'interno di questa famiglia di geni. Ci si interroga se abbia senso mantenere tale suddivisione in sottoclassi [26]. Recenti studi hanno evidenziato un differente livello assoluto di resistenza all'eritromicina tra ceppi contenenti il mef(A) rispetto a quelli contenenti il mef(E). Sebbene il fenomeno sia stato osservato in S. pneumoniae, esso potrebbe caratterizzare anche altre specie all'interno dello stesso genere, per l’elevato grado di omologia esistente tra i geni mef di diverse specie di streptococco. Se ciò venisse confermato ci si troverebbe di fronte ad una evoluzione della classe di geni mef verso livelli di resistenza più elevati, fino al passaggio ad una resistenza ad alto livello (MIC&gt;32 mg/L). Dal punto di vista genetico, il gene mef è sempre associato al gene msr. Studi di espressione condotti nello S.pneumoniae hanno dimostrato che ambedue i geni sono essenziali al funzionamento del meccanismo d'efflusso attivo dei macrolidi [1]. Tuttavia, mancano, in S. pyogenes, conferme dell'associazione di variabilità esistente tra i due geni e di correlazione di questa variabilità con il fenotipo M espresso.
Questa coppia di geni è situata all'interno di trasposoni coniugativi e/o fagi temperati [5,7,43]. Diversi studi sostengono la trasposizione coniugativa come meccanismo di trasferimento genetico orizzontale della resistenza mediata dalle pompe di efflusso in S.pyogenes [43]. La presenza dei geni mef-msr e degli stessi trasposoni coniugativi che li veicolano all'interno di profagi funzionali indica che anche i fagi potrebbero essere i vettori di diffusione di questa resistenza. In effetti il genoma degli streptococchi di gruppo A è costellato di genomi di profagi (più o meno funzionali), i quali hanno contribuito in maniera sostanziale alla plasticità evolutiva del genoma di questa specie [4]. Alcuni studi hanno dimostrato in vivo il fenomeno della conversione lisogenica di ceppi non tossigenici da parte di fagi contenenti geni codificanti esotossine pirogeniche streptococciche [8].
Se da un lato la resistenza agli antibiotici rappresenta un importante problema in campo terapeutico per debellare le infezioni da batteri patogeni, dall’altro assume un aspetto particolare se si prendono in considerazione quei batteri Gram-positivi considerati utili per la salute umana,come ad es. i lattobacilli: comuni commensali in molti distretti del nostro corpo, considerati utili per la nostra salute [47]. Questi batteri, che sono altamente resistenti a numerosi antibiotici [6,14,20], da un lato sopravvivono alla terapia esercitando la loro funzione probiotica, dall’altro, potrebbero rappresentare un serbatoio di geni di antibiotico-resistenza al pari dei batteri patogeni [28-29,31,36,38,41,44,50-51,56-57]. Il pericolo maggiore associato ad una tale condizione è quello che essi possano trasferire tali geni a batteri patogeni [29,31,38,41,44]. E’ noto che geni di resistenza per tetraciclina, eritromicina, e vancomicina sono stati riscontrati in Lactobacillus spp. isolati dall'uomo e dai cibi [31,44]. Lo studio di tale fenomeno e necessario poiché sono numerose l’evidenze che dimostrano come in ambienti sotto stress di antibiotico i lattobacilli umani partecipano, al pari di altri batteri, a "sistemi di comunicazione" che trasferiscono geni di resistenza al di sopra del limite di specie e di genere[31]. Inoltre, è noto che i lattobacilli, diffondendo nel sangue, possono anche causare gravi patologie [48].
Alla luce di queste considerazioni la completa efficacia di un agente antimicrobico in vivo non può essere soltanto determinata dalla valutazione della sua minima concentrazione inibente (MIC) e limitata a questa, in quanto i test di sensibilità in vitro non sempre sono in grado di predire con certezza l’esito clinico dell’infezione [9,57]. Essi, infatti, da soli risultano incompleti e insufficienti poiché non tengono conto di alcuni elementi che giocano un ruolo chiave nell’infezione in vivo, quali l’attività battericida del siero umano, la funzionalità delle cellule di difesa dell’ospite, l’eventuale capacità dei fagociti di potenziare l’attività microbicida intracellulare dei farmaci e, ancora, l’effetto diretto di alcuni antibiotici sui fattori di virulenza dei batteri - parametri questi tutti molto importanti nell’impedire a un potenziale patogeno di innescare un processo infettivo e, soprattutto, di diffonderlo [23]. La dicotomia tra la antibiotico-resistenza osservata in vitro e i dati clinici ottenuti in vivo dovrebbe essere “riesaminata”, in quanto attualmente i metodi a disposizione per predire l’efficacia clinica di un farmaco nei confronti di un batterio patogeno sono ancora molto empirici [35]. Fino a quando, infatti, non saranno presi in considerazione anche i fattori che intervengono in vivo, i meccanismi di difesa dell’ospite e l’azione dell’antibiotico direttamente nel sito dell’infezione, la scelta di somministrare un farmaco piuttosto che un altro continuerà a essere imprecisa, “difettosa” e pertanto inappropriata. Infatti, è noto che l’azione dei fagociti nella resistenza dell’ospite alle infezioni microbiche è di primaria importanza; ne consegue che un eventuale potenziamento della loro attività, indotto dalla somministrazione di un farmaco, può giocare un ruolo prevalente nel garantire l’esito dell’infezione [12,27]. Mentre queste proprietà immunomodulanti dell’antibiotico possono risultare additive nel paziente immunocompetente, esse diventano requisiti indispensabili nel paziente immunocompromesso, dove il grave stato di deficit immunitario, imputabile ad una forte compromissione della risposta fagocitaria, lo rende sensibile a gravi infezioni a diagnosi spesso difficoltosa e prognosi severa [11]. Quindi, per garantire una più completa valutazione dell’efficacia terapeutica di un farmaco, le sue potenzialità immunomodulanti dovrebbero essere sempre determinate in associazione all’attività antibatterica esercitata in vitro.
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