RICERCA ITALIANA     

ANTAGONISTI DEI RECETTORI DI BV8/PROCHINETICINE: MODELLI PER NUOVI FARMACI ANALGESICI, ANTIINFIAMMATORI ED IMMUNOMODULATORI

Università degli Studi di Roma "La Sapienza"

Abstract

Sarà sintetizzata una nuova famiglia di antagonisti non-peptidici dei recettori delle prochineticine (PKR) per approfondire le nostre conoscenze sul ruolo funzionale delle prochineticine (PK) e dei loro recettori nella percezione del dolore, nell’infiammazione e nell’immunità e per realizzare modelli molecolari di nuovi farmaci utili nella terapia di malattie croniche infiammatorie e autoimmuni. Le molecole sintetizzate saranno derivati triazinici e piridimidinici con alta affinità, selettività ed attività antagonista per PKR. Insieme all’antagonista peptidico [Ala24]Bv8 saranno impiegate nel progetto per: (1) valutare il ruolo funzionale delle prochineticine endogene nella nocicezione acuta ed in modelli animali di dolore cronico; (2) definire il ruolo delle prochineticine endogene nella modulazione centrale discendente del dolore; (3) delucidare il ruolo funzionale di PKR espressi dalle cellule immunitarie; (4) studiarne l’attività antiiperalgesica e antiinfiammatoria in topi e ratti con lesioni infiammatorie e neuropatiche; (5) studiarne l’attività immunomodulatoria in risposte immunitarie invitro e in modelli animali di malattie autoimmuni.
In accordo con i punti 1 e 4, il ruolo del sistema PK/PKR nella nocicezione sarà valutato, in assenza dell’attività modulatoria dei sistemi endogeni oppioide e prostanoide, in animali sani e in modelli animali di dolore in cui il sistema oppioide è stato inibito dalla somministrazione cronica di naloxone e la biosintesi delle prostaglandine è stata bloccata dalla delezione dei geni per COX-1 e COX-2. Nel topo, come modello di dolore infiammatorio, useremo l'infiammazione della zampa da CFA (adiuvante completo di Freund) e come modello di dolore neuropatico, la legatura lassa unilaterale del nervo sciatico secondo Bennett. Le risposte nocifensive saranno valutate con il test di Hargreaves di retrazione della zampa da uno stimolo nocivo termico, e misurando la soglia tattile alla stimolazione con i filamenti di von Frey e la soglia termica con il test di retrazione della zampa o della coda da un bagno di acqua. Il grado di edema sarà valutato con metodo pletismometrico. Nelle cellule infiammatorie infiltranti la zampa, raccolte e separate mediante FACS, si misurerà l’espressione di PK e PKR, mediante RT-PCR. L’attività anti-iperalgesica ed anti-infiammatoria dei PKR-antagonisti, in presenza ed assenza di antagonisti oppioidi, sarà valutata nel ratto portatore dei seguenti modelli di artrite: (i) osteoartrite prodotta dalla iniezione intra-articolare di monoiodoacetato (MIA) e (ii) artrite di tipo reumatoide prodotta dall’iniezione intra-articolare di CFA. In questi animali, il comportamento nocifensivo e l’allodinia saranno determinati mediante: (i) test di incapacitanza posturale che misura la distribuzione asimmetrica del peso corporeo sulle due zampe posteriori; (ii) test di allodinia misurata con i filamenti di von Frey. L’infiammazione sarà valutata dalla misura della circonferenza del ginocchio e dal danno istologico osseo e cartilagineo. I composti saranno somministrati agli animali per via endovenosa, intratecale e sottocutanea e successivamente anche per via orale.
In accordo con il punto 2, per valutare il ruolo modulatorio di PK e PKR nel controllo centrale discendente della trasmissione nocicettiva e nella modulazione del firing delle cellule ON e OFF nel RVM, studieremo gli effetti della somministrazione intra-PAG dei PKR-antagonisti, da soli o in combinazione con Bv8, (i) sulla risposta nocifensiva al calore, misurata con il test di Hargreaves; (ii) sui i livelli di glutamato e di GABA nel PAG; (iii) sull’attività spontanea e tail-flick-correlata delle cellule ON e OFF nel RVM.
In accordo con i punti 3 e 5, studieremo l’attività biologica dei PKR-antagonisti sulla risposta immunitaria dei macrofagi e dei linfociti Th attivati. Poiché l’attivazione di PKR di queste cellule stimola la chemiotassi macrofagica e la secrezione di citochine Th1 infiammatorie e inibisce la produzione di citochine Th2 antiinfiammatorie, possiamo prevedere che i PKR-antagonisti saranno in grado di invertire queste risposte. Come modello di malattia autoimmune indurremo nel topo una encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) mediante immunizzazione con la glicoproteina mielinica degli oligodendrociti (MOG 35-55) e studieremo l’effetto della somministrazione cronica dei PKR-antagonisti sullo sviluppo clinico della patologia. Inoltre, verrà studiato l’effetto dei PKR-antagonisti sul rapporto fra citochine tipiche Th1/Th2, in linfociti e splenociti ottenuti da linfonodi e milze di animali con EAE.
Le nuove molecole dotate di proprietà antagonista selettiva per i recettori delle prochineticine e di attività analgesica, anti-infiammatoria ed immunomodulatoria saranno brevettati alla fine del progetto. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Lucia Negri Università degli Studi di ROMA "La Sapienza"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il sistema endogeno delle prochineticine (PK) e loro recettori (PK-R1 e PK-R2), è coinvolto nella percezione del dolore, e nelle reazioni infiammatorie e immunitarie. E’ un sistema fisiologico recentemente identificato, che apre la strada a strategie innovative per lo sviluppo di farmaci analgesici, antiinfiammatori ed immunomodulatori.
Questo proggetto di ricerca si propone di investigare le propietà antinocicettive, antiinfiammatorie ed immunomodulatorie di antagonisti dei recettori delle prochineticine . Gli obbiettivi finali di questo proggetto sono:
1. Sintetizzare nuovi composti, a struttura triazinica e pirimidinica che, in studi preliminari, si sono dimostrati validi modelli per lo sviluppo di antagonisti non-peptidici dei PKR.
2. Valutare l’affinità e selettività recettoriale e le propietà PKR-antagoniste dei nuovi composti di sintesi, in paragone all’antagonista peptidico [Ala24]Bv8.
3. Localizzare, mediante “binding in situ” di PKR-antagonisti marcati, i recettori delle prochineticine nei DRG, nel sistema nervoso centrale, nel midollo osseo, negli organi linfoidi, nelle cellule ematiche e nelle cellule immuno-infiammatorie.
4. Utilizzare i PKR-antagonisti di sintesi per meglio delucidare il ruolo delle PKs endogene e dei loro recettori nella modulazione centrale e periferica della percezione del dolore, nelle risposte immunitarie, nella produzione di citochine da cellule gliali e da cellule immunitarie infiltranti e residenti.
5. Valutare le propietà analgesiche, antiinfiammatorie ed immunomodulatorie, di alcuni selezionati PK-antagonisti, in modelli animali di dolore infiammatorio cronico, dolore neuropatico e malattie autoimmuni.
Noi ci proponiamo di contribuire, mediante questi approcci sperimentali, allo sviluppo di molecole innovative che, modulando il sistema Bv8/PKs, possano essere terapeuticamente utili per controllare condizioni patologiche caratterizzate da dolore e importante componente immunitaria, come le malattie infiammatorie croniche ed autoimmuni. <<<

Risultati parziali attesi

I risultati di questo progetto allargheranno le nostre conoscenze sul ruolo funzionle delle prochineticine e dei loro recettori nella percezione del dolore, nell’infiammazione e nell’immunità e forniranno modelli molecolari di antagonisti dei recettori delle prochineticine per lo sviluppo di nuovi farmaci che, avendo come bersaglio il sistema a prochineticine, possono essere utili nella terapia di patologie caratterizzate da dolore e da componenti immunitarie come le malattie croniche infiammatorie e autoimmuni.
Il ruolo funzionale di PKR e di PK2 nella percezione del dolore è sostenuto da argomentazioni robuste, ma basate prevalentemente sulla osservazione che i topi mancanti di uno o dell’altro dei due recettori o della PK2 sono meno sensibili dei corrispettivi topi selvaggi a svariati stimoli algici. Pertanto la estrapolazione di questi risultati ad animali intatti va considerata criticamente.
Il cancellamento di un gene durante la vita embrionale può portare all’espressione compensatoria di altri geni sia durante la vita embrionale che postnatale. Ci sono molti esempi in cui deficienze funzionali osservate in topi KO per un recettore non si verificano nel topo intatto in seguito allo spegnimento dell’attività recettoriale con un antagonista. Non essendo disponibili topi mancanti di entrambi i recettori delle prochineticine è difficile valutare la partecipazione di questi recettori in svariate risposte nocicettive. Infine non è possibile definire chiaramente il ruolo di PK-R2 nella nocicezione a causa dei molti difetti periferici e centrali che presentano i topi PK-R2-KO.
Un’altra importante limitazione ad estrapolare i risultati ottenuti nei topi PKR-KO a sindromi dolorose croniche è che i dati disponibili dipendono da una delezione genica non tessuto-specifica. Nei nostri topi PKR-KO, i PKR mancano sia nel sistema nervoso centrale che periferico così come nelle cellule immunoinfiammatorie. Perciò non possiamo capire se la ridotta sensibilità al dolore infiammatorio riportata nei topi KO dipende da una ridotta nocicezione centrale o periferica o piuttosto da una deficiente risposta immunoinfiammatoria.
Con i PKR-antagonisti noi potremo bloccare uno solo o entrambi i recettori PKR, localmente o sistemicamente, nel sistema nervoso centrale o in periferia (gli antagonisti peptidici non attraversano la barriera emetoencefalica). L’antagonismo recettoriale è reversibile e la funzione del recettore recupera dopo l’eliminazione dell’antagonista. Mediante binding in situ di una molecola fluorescente potremo evidenziare la localizzazione di ciascun PKR nel sistema nervoso centrale e in periferia, a livello tissutale e cellulare. Combinando opportunamente l’antagonismo recettoriale con la delezione di uno o dell’altro gene potremo studiare il ruolo fisiologico del sistema a prochineticine in sindromi dolorose acute e croniche e in risposte immunoinfiammatorie e potremo mettere in luce l’utilità terapeutica del sistema a prochineticine come bersaglio per farmaci analgesici, anti-infiammatori ed immunomodulatori.
Durante questo progetto saranno sintetizzati nuovi antagonisti selettivi per i recettori delle prochineticine. Tali molecole saranno anche brevettate. Questi composti si propongono come una nuova famiglia di farmaci analgesici anti-infiammatori e immunomodulatori riunendo in una sola molecola diverse azioni selettive ma nel contempo additive. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Malattie infiammatorie ed immunitarie gravi sono spesso associate a dolori incontrollabili. Nonostante i grandi progressi nella conoscenza dei meccanismi molecolari coinvolti in questi processi cronici dolorosi e i considerevoli investimenti devoluti nella ricerca farmaceutica e lo sviluppo raggiunto in questo campo, ci sono pochi farmaci innovativi e la maggior parte di questi è associata ad importanati effetti avversi. I molteplici mediatori del dolore e della infiammazione sono prodotti della espressione genica indotta dal processo patologico che porta a modifiche plastiche nelle risposte del sistema nervoso e immunitario. Validi bersagli per nuovi farmaci si potrebbero individuare proprio fra quelle molecole che sono sovra-espresse in patologie dolorose croniche e che sono capaci di riprodurre la sensibilizzazione nocicettiva in animali da esperimento. Recentemente abbiamo identificato nuove molecole che inducono sensibilizzazione nocicettiva negli animali di laboratorio e che sono sovra-espresse in malattie infiammatorie ed in alcuni tumori (Negri et al., 2007). Si tratta di piccole proteine, identificate come Bv8/Prochineticin(PK) che attivano due recettori a G-proteine (PK-R1 e PK-R2) nel sistema nervoso centrale (CNS), nei gangli delle radici spinali dorsali (DRG) ed in cellule infiammatorie ed immunocompetenti.
Le prokineticine sono piccole proteine di secrezione (8-11 kD) (Mollay et al., 1999; Wechselberger et al., 1999; LeCouter et al., 2001; Li et al., 2001) che abbassano la soglia di sensibilità ad un ampio spettro di stimoli nocivi sia di natura fisica che chimica (Negri et al., 2002) . In colture primarie di neuroni di DRG di ratto, Bv8, a concentrazioni nanaomolari, produce mobilizzazione, dose-dipendente, di CA++ intracellulare e traslocazione in memebrana di PKCe, sensitizzando i nocicettori termici TRPV1 all’azione degli attivatori endogeni ed esogeni. L’esposizione delle colture di DRG a GDNF (glial cell line-derived neurotrofic factor) induce espressione “de novo” di PKR funzionali, suggerendo una possibile up-regulation dei PKRs dopo infiammazione o danno tissutale (Vellani et al., 2006). I topi mancanti del gene codificante per il recettore 1 delle PK (PK-R1-KO) e quelli mancanti del gene codificante per la PK2 mostrano, una minore risposta agli stimoli nocivi termici, meccanici e chimici, rispetto ai corrispondenti topi selvaggi (WT) (Negri et al., 2006, Hu et al., 2006). I topi PK-R1-KO sono meno sensibili a Bv8 e capsaicina (agonista del recettore vanillioide TRPV1) ma mostrano normali risposte iperalgesiche a bradichinina e PGE2. Inoltre, questi topi mostrano ridotta iperalgesia termica dopo infiammazione acuta da olio di mostarda e dopo infiammazione cronica da adiuvante completo di Freund (CFA) (Negri et al., 2006). Studi precedenti (Lattanzi et al., 2001) hanno dimostrato che la prochineticina 2 (PK2) è altamente espressa nei granulociti e che la PK2 estratta dai granulociti infiammatori è un potente fattore pronocicettivo (Negri et al., 2006). In macrofagi murini, granulociti infiammatori e cellule HL60, PK2-mRNA è espresso come doppia variante di splicing tessuto-specifico (Negri et al., 2007): la forma corta codifica per una proteina (PK2) simile al Bv8 anfibio ma la forma lunga (PK2L) codifica per un dominio addizionale di 21 aa, inserito tra i residui 47-48. Questo inserto è fortemente basico, ricco in lisine e arginine che costituiscono potenziali siti di clivaggio. La PK2L secreta dà luogo, per proteolisi, ad un peptide più piccolo (PK2beta;) che perde affinità per PK-R2 ma mantiene una significativa affinità per PK-R1 (Chen et al., 2005). PK2 è sovra-espressa in tessuti infiammati (tonsille e appendice) associata a neutrofili infiltranti (LeCouter et al., 2004). L’infiammazione cronica indotta da CFA aumenta l’espressione di PK2, PK2L e PKRs nella pelle della zampa del ratto. Tale sovra-espressione correla temporalmente con la iperalgesia indotta dall’infiammazione (Negri et al., 2006). La delezione del gene per PK-R1 riduce sensibilmente sia la sovra-regolazione di PK2 che la ipersensibilità termica, senza influenzare significativamente l’aumento di IL-1, indotte dall’infiammazione (Negri et al., 2006). Macrofagi e splenociti di topo esprimono elevate quantità di PK-R1. Bv8 e PKs inducono un fenotipo macrofagico di tipo infiammatorio stimolando la migrazione del macrofago e la produzione delle citochine proinfiammatorie IL-1 e IL-12, mentre diminuisce la citochina antinfiammatoria IL-10 (Martucci et al., 2006). Abbiamo inoltre dimostrato che Bv8 è in grado di agire anche sui linfociti T in quanto influenza l’equilibrio tra i linfociti T-helper (Th) di tipo 1, coinvolti nell’immunità cellulo-mediata e nell’infiammazione, e i Th2, alla base delle risposte umorali e allergiche. La somministrazione in vivo ed in vitro di Bv8 sposta l’equilibrio Th1/Th2 verso i Th1, diminuendo le citochine tipiche Th2. Studi effettuati sui topi PK-R1-KO indicano che tutte queste attività sono mediate da PK-R1, suggerendo che questo recettore svolga un ruolo nella genesi e mantenimento delle risposte infiammatorie e del dolore. I livelli di espressione di PKs nel midollo osseo, organi linfoidi, leucociti e cellule ematopoietiche, e la presenza di PK-R1 e PK-R2 su queste cellule suggerisce fortemente che il sistema a PK partecipi ai processi infiammatori ed immunomodulatori (LeCouter et al., 2004; Dorsh et al., 2005; Martucci et al., 2006). Questi dati indicano che le PKs liberate nel tessuto infiammato aumentano la risposta dei nocicettori direttamente, agendo sui neuroni sensitivi primari, e/o indirettamente, attraverso la liberazione di citochine pronocicettive e modulando la risposta delle cellule immunitarie ed infiammatorie. L’attività pronocicettiva delle PKs non dipende solo dall’attivazione e sensibilizzazione dei nocicettori periferici. Infatti, i risultati ottenuti con iniezioni di Bv8, per via intra-celebroventricolare, endovenosa e sottocutanea in ratti e topi, ha dimostrato che anche il sistema nocicettivo centrale, può essere attivato e sensibilizzato dalle PK (Negri et al., 2002). E’ stata descritta la presenza di PK-R2 in vari nuclei del sistema nervoso centrale come per esempio, corteccia sensoriale, bulbo olfattorio, amigdala, ippocampo, nuclei periventricolari talamici ed ipotalamici, talamo laterale, abenula, organo subfornicale, nucleo soprachiasmatico, nucleo arquato, corpi mammillari, sostanza grigia periacqueduttale (PAG), nucleo del tratto solitario e mesencefalo rostro-ventrale (VRM) (Negri et al., 2006a; 2007; Cheng et al., 2006). L’iniezione di Bv8 nel PAG produce iperalgesia ed aumenta, nel RVM, l'attività delle cellule ON (pronocicettive) e riduce l'attività delle cellule OFF (antinocicettive), facilitando così la trasmissione nocicettiva (De Novellis et al., in press). PK e PKR sono espressi da cellule gliali (Koyama et al., 2006) che liberano citochine proinfiammatorie e che partecipano attivamente alla genesi e al mantenimento della sensibilizzazione nocicettiva indotta da infiammazione e lesione di tessuti periferici, nervi periferici e midollo spinale (DeLeo et al., 2006).
Tutti questi risultati suggeriscono che PK e PKR sono sovra-espressi in condizione di dolore infiammatorio, possono mediare la sensibilizzazione nocicettiva sia centrale che periferica e possono peggiorare la percezione del dolore in processi patologici cronici. La scoperta del sistema nocicettivo delle prokineticine indica pertanto una strategia innovativa per lo sviluppo di farmaci analgesici. Recenti studi hanno identificato alcuni antagonisti dei PKR (Bullock et al., 2004; Negri et al., 2005; Negri et al., 2007) che possono rappresentare un nuovo approccio per la terapia dei dolori cronici. Il nostro gruppo (brevetto RM2007A000182) e due importanti industrie farmaceutiche (Merck &amp; CO.INC., WO2007/067511A2; Janssen Pharmaceutica, WO2006/104713A1) hanno sviluppato e brevettato alcuni nuovi composti peptidici e non-peptidici che, in vitro, antagonizzano la attivazione dei PKR da parte di Bv8 e prochineticine.

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