RICERCA ITALIANA     

Canali del sodio, calcio e potassio neuronali: ruolo fisiologico e canalopatie

Università degli Studi di Torino

Abstract

I canali ionici voltaggio-dipendenti sono proteine integrali di membrana attivate dal potenziale che consentono il passaggio di ioni quali Na, K, Ca e Cl, fra l’esterno e l’interno della cellula. Tutti gli animali, e naturalmente l’uomo, utilizzano nei vari tessuti la capacità dei canali ionici di condurre ioni attraverso la membrana in entrambe le direzioni e quindi di generare potenziali d’azione capaci di sostenere l’eccitabilità cellulare, controllando processi cruciali per la vita, quali la trasmissione nervosa, la trasduzione sensoriale, la contrazione muscolare, la plasticità sinaptica e i processi di apprendimento e memoria. Il controllo di queste funzioni fisiologiche richiede normalmente un numero assai limitato di canali ionici, che è di molto inferiore al numero di geni che il nostro genoma possiede (più di 60 geni per i canali del K, 10 per i canali del Ca e 9 per i canali del Na). Capire il ruolo e la funzione di ciascuno di essi è stata, e rimane, la grande sfida dei neuroscienziati interessati a questo tipo di problematica.

Oltre a ciò, esiste un ulteriore ordine di complessità legata al fatto che: 1) il funzionamento delle strutture proteiche che formano il poro è spesso associato ad altre strutture proteiche (subunità accessorie) che regolano il grado di espressione e di funzionalità del canale, 2) alcuni secondi messaggeri attivati da specifici recettori di membrana sono in grado di interagire con i canali ionici modulandone l’attività, 3) il livello di espressione dei canali può aumentare fortemente a seguito di stimolazioni indotte da fattori di crescita neuronali o altri stimoli esterni, quali l’ipossia. E’ ovvio quindi che il mal funzionamento di uno qualsiasi di questi fattori e/o semplici mutazioni geniche (canalopatie) in grado di indurre cambiamenti al funzionamento del canale o all’interazione con le subunità accessorie possano indurre gravi neuropatologie. In tal caso, capire le cause delle canalopatie e le conseguenze delle mutazioni geniche che codificano per i canali ionici può portare ad importanti scoperte sul ruolo dei canali voltaggio-dipendenti nei fenomeni di eccitabilità neuronale.

In questo progetto un gruppo internazionalmente qualificato di neuroscienziati italiani ha deciso di coordinarsi col duplice scopo di studiare il ruolo funzionale dei canali neuronali del Na, Ca e K e le origini di importanti canalopatie ad essi associate. Ciò permetterebbe di progettare nel prossimo futuro specifiche terapie di trattamento o prevenzione per gravi neuropatologie. In tal senso verrebbe continuato il lavoro iniziato già da precedenti progetti PRIN (1997-2007) precedentemente coordinati dal prof. Wanke (Unità di Milano-Bicocca) e più recentemente dal prof. E. Carbone che hanno portato ad eccellenti risultati sul piano delle pubblicazioni scientifiche (48 lavori negli ultimi 4 anni su riviste ad alto impact factor) e ad un’accresciuta immagine a livello internazionale dell’elettrofisiologia dei canali ionici testimoniati dagli aumentati inviti a meeting internazionali e nazionali dei partecipanti al progetto.

Le competenze specifiche che i responsabili delle cinque Unità operative hanno acquisito in questi anni hanno rappresentato la base di partenza per definire gli obiettivi dei singoli progetti scientifici. L’aspetto più caratterizzante di questo progetto è infatti l’omogenea professionalità dei partecipanti, tutti esperti di canali ionici, canalopatie e problematiche elettrofisiologiche che hanno deciso di collaborare scambiandosi le loro competenze su diversi tipi di canali (Na, Ca, K), preparati neuronali (cervelletto, ippocampo, neocorteccia, locus coeruleus, gangli trigeminali), canalopatie (emicrania, atassia, epilessia, Alzheimer, stress), topi transgenici, KI e KO per vari canali (Cav2.1, Cav1.3, Cav3.2, Kv1.1, Kir5.1, herg1-3) e, soprattutto, utilizzando diverse metodologie di misura disponibili nelle varie Unità (correnti ioniche di membrana, potenziali d’azione misurati con matrici di microelettrodi, segnali post-sinaptici evocati e in miniatura, capacitanza, Ca imaging, microscopia confocale). Se il progetto verrà finanziato sarà possibile guardare al ruolo dei canali ionici e alle canalopatie in maniera più dettagliata, con approcci diversificati e tecniche d’avanguardia già utilizzate a livello internazionale. Come principale risultato del progetto ci aspettiamo di identificare il ruolo funzionale che un certo numero di canali del Na, Ca e K svolge nella genesi di importanti neuropatologie quali, l’emicrania, l’epilessia, l’Alzheimer e lo stress. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Emilio Carbone Università degli Studi di TORINO

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il progetto nazionale che viene proposto per il biennio 2007-2009 è il naturale proseguimento di quello già proposto e finanziato per il periodo 1997-2007 (coordinato prima dal Prof. E. Wanke e poi dal prof. E. Carbone) con le stesse cinque Unità ed un comune obiettivo focalizzato sul ruolo dei canali neuronali del Na, Ca e K e sulle principali canalopatie ad essi associati. La selezione dei partecipanti, fatta in precedenza, ha il duplice scopo di focalizzare meglio la problematica dei canali ionici sul sistema nervoso centrale e di permettere un più proficuo scambio di conoscenze su diversi preparati neuronali (neuroni in coltura, preparati monosinaptici, reti neuronali e fettine di cervello) e sulle più moderne metodologie utilizzate per la registrazione di segnali elettrici. Quindi l’elemento unificante di questo progetto è proprio la possibilità per le varie Unità di collaborare proficuamente mettendo in comune le proprie esperienze sperimentali sui vari preparati neuronali e su alcune complesse metodologie che non potrebbero essere assolutamente sviluppate in un unico laboratorio di ricerca di dimensioni Universitarie e che sono indispensabili per ottenere informazioni complete sul ruolo dei canali e le cause delle canalopatie a vari livelli di complessità cellulare: singolo neurone, reti neuronali, cervello intero.

Per dare un’idea delle problematiche che verranno affrontate e della loro estrema omogeneità, di seguito sono elencati i titoli dei progetti delle cinque Unità partecipanti, mentre nello schema grafico sono riassunti gli aspetti caratteristici di ciascun progetto, indicando i tipi di canali, le canalopatie, i neuroni e le metodologie utilizzate.

E. Carbone (Torino):
RUOLO FUNZIONALE DEI CANALI DEL CALCIO L E T NEURONALI NEL CONTROLLO DELL'ATTIVITÀ PACEMAKER E NEUROSECRETORIA: IMPLICAZIONI NELLE CANALOPATIE E ALTERAZIONI DELL'ECCITABILITÀ NEURONALE.

BASI MOLECOLARI DI CANALOPATIE E ANALISI FUNZIONALE IN SINGOLI NEURONI E IN RETI NEURONALI

D. Pietrobon (Padova):
CANALI DEL CALCIO NEURONALI ED EMICRANIA.

F. Tempia (Torino):
RUOLO DEI CANALI DEL POTASSIO IN MODELLI ANIMALI DI MORBO DI ALZHEIMER E DI EPILESSIA

M. Pessia (Perugia):
STUDIO DELLE FUNZIONI FISIOLOGICHE REGOLATE DAI CANALI DEL K+ VOLTAGGIO-DIPENDENTI ED "INWARDLY-RECTIFYING" E DELLE LORO IMPLICAZIONI IN CANALOPATIE UMANE




Come appare evidente dai titoli e dallo dalla figura esistono due principali obiettivi comuni all’interno del progetto, uno rivolto al ruolo dei canali del K (Kv1.1, Kv3.4, Kir5.1 ed erg) nel quale sono coinvolte le Unità di Milano, Torino (Tempia) e Perugia e l’altro rivolto al ruolo dei canali del Ca nella trasmissione sinaptica (P/Q, L, T) e al coinvolgimento del canale P/Q in alcune forme di emicrania emiplegica nel quale sono implicati le Unità di Torino (Carbone) e Padova. Un terzo obiettivo riguarda invece il ruolo dei canali del Na nell’attività dei neuroni centrali e il loro ruolo in alcune forme di epilessia nel quale è principalmente coinvolto il gruppo di Milano con la collaborazione di un gruppo clinico.

Sebbene focalizzati su temi originali e ben precisi i cinque gruppi tuttavia collaboreranno tra loro in maniera coordinata per dare il supporto necessario a ciascun partner affinché venga identificato meglio il ruolo fisiologico dei diversi tipi di canali studiati. In quest’ottica le tre linee di ricerca sui canali del Na, Ca e K procederanno in parallelo interagendo tra loro attraverso progetti che prevedono collaborazioni basate sullo scambio di modelli animali (topi transgenici, KI e KO) e di metodologie di tipo strumentale (MEA, registrazioni di correnti postsinaptiche, Ca imaging, microscopia confocale, capacitanza, amperometria), di tipo fisiologico (preparati cellulari di diverse regioni del SNC) e di tipo biologico (RT-PCR su singola cellula, chimere proteiche, immunoistochimica).

Le Unità che studieranno i canali del K (Milano, Perugia, Torino) sono orientate ad approfondire i possibili ruoli dei canali Kv3, Kv1.1, Kir5.1 ed erg le cui funzioni sono quelle di determinare la fase di ripolarizzazione, la frequenza e la durata dei bursts dei potenziali d’azione. Tutti e tre i tipi di canali appaiono anche implicati in svariate malattie neurologiche che vanno dalla atassia episodica a vari tipi di epilessie, all’Alzheimer. Le Unità di Milano e Torino che in passato hanno già studiato il canale erg sia nel tessuto nervoso (Tempia) che in quello neuroendocrino (Wanke), collaboreranno strettamente per identificare meglio le funzioni di erg nelle cellule del Purkinje in fettine di cervelletto e con l’uso dei MEA il ruolo di erg nell’eccitabilità di reti neuronali ippocampali. Per questi studi saranno utilizzati anche modelli animali della malattia di Alzheimer a cui parteciperà anche l’Unità di Perugia. Questa ultima Unità, focalizzerà invece la sua attenzione sulle proprietà del canale Kv1.1 largamente espresso nel cervelletto ed implicato in varie forme di atassia episodica, in alcuni casi associate a stati epilettici. L’Unità utilizzerà il topo KO Kv1.1 universalmente accettato come un buon modello animale di EA-1 e il topo KO Kir5.1 che sarà usato come modello animale di disordini psichiatrici, come gli attacchi di panico. Per completare questi studi è prevista anche una stretta collaborazione con l’Unità di Torino (Carbone) per evidenziare il ruolo di Kir5.1 nel controllo della trasmissione sinaptica in cellule ippocampali di topi WT e KO.

Le Unità che studieranno i canali del Ca (Torino e Padova) focalizzeranno la loro attenzione sul ruolo dei canali del Ca T (Cav3.2) ed L (Cav1.3) (Carbone) e P/Q (Cav2.1) (Pietrobon) nel controllo della trasmissione nervosa in cellule ippocampali (Carbone) e nei neuroni corticali e trigeminali e sulle mutazioni dei canali P/Q associate alla emicrania di tipo 1 (FHM1), che causa l'emicrania con aura (Pietrobon). Lungo questa linea di ricerca, l’Unità di Padova continuerà gli studi sui topi KI con la mutazione FHM1 e analizzerà la neurotrasmissione eccitatoria e inibitoria nella corteccia cerebrale suscettibile della “cortical spreading depression” (CSD) e responsabile dei sintomi dell’emicrania con aura. L’Unità focalizzerà i suoi studi specificamente sugli effetti che la mutazione Cav2.1 esercita sui neuroni trigeminali implicati nella trasmissione del dolore emicranico, oltre che sull’azione di droghe antiemicraniche e sull’NO (che è un mediatore dell’emicrania).

L’Unità di Torino (Carbone) studierà il ruolo dei canali L e T nel controllo dell’attività spontanea dei potenziali d’azione in cellule ippocampali e cromaffini in due modelli animali: i topi KO Cav1.3 e Cav3.2. Il primo è sordo, bradicardico e meno suscettibile allo stress mentre il secondo è normalmente usato come modello per studi di iperalgesia ed epilessia. Entrambi i canali si attivano a potenziali relativamente bassi e sono pertanto implicati nel controllo della genesi del potenziale d’azione in molti tipi di neuroni. Il gruppo studierà anche il ruolo che questi canali svolgono nei neuroni ippocampali e nelle cellule cromaffini di topi KO e WT e verificherà anche l’esistenza di effetti opposti che potrebbero verificarsi se i due canali sono up-regolati o reclutati da modulatori endogeni (cAMP e ipossia) o fattori di crescita neuronale.
Tutti e cinque i gruppi metteranno a disposizione la loro competenza nelle tecniche che hanno recentemente sviluppato. Il gruppo di Milano metterà a disposizione degli altri partners la tecnica dei MEA in fettine e in reti neuronali in coltura. Il gruppo offrirà anche un servizio di screening e mutagenesi puntuale. I due gruppi di Torino collaboreranno mettendo a disposizione la loro esperienza in tecniche amperometriche e capacitative per misurare la neurosecrezione (Carbone) e nel trovare le condizioni ottimali per misure di RT-PCR quantitativa su singola cellula (Tempia). <<<

Risultati parziali attesi

Come menzionato in precedenza, il principale risultato che ci si aspetta da questo progetto nazionale è l’identificazione del ruolo funzionale che i canali del Na, Ca e K svolgono nella generazione di importanti neuropatologie come l’emicrania, l’epilessia, l’Alzheimer e i disordini psichiatrici. Ci sono comunque, molti tipi di risultati potenzialmente ottenibili da ciascuna Unità nei loro progetti e, data la specifica rilevanza del lavoro di ciascun gruppo, di seguito elencheremo i principali risultati che siamo in grado di prevedere:


TORINO (CARBONE): “RUOLO FUNZIONALE DEI CANALI DEL CALCIO L E T NEURONALI NEL CONTROLLO DELL'ATTIVITÀ PACEMAKER E NEUROSECRETORIA: IMPLICAZIONI NELLE CANALOPATIE E ALTERAZIONI DELL'ECCITABILITÀ NEURONALE”

Obiettivo #1 – Ruolo del canale L nell’attività pace-maker nel rilascio di neurotrasmettitori in neuroni ippocampali e cellule cromaffini in condizioni fisiologiche e patologiche

Da questo progetto ci si aspetta di quantificare il ruolo i canali di tipo L svolgono nell’attività pace-maker e nel rilascio ormonale in cellule cromaffini e neuroni ippocampali di topo. In particolare, ci aspettiamo di identificare se l’isoforma Cav1.3 è il canale L maggiormente coinvolto e se la sua up- o down-regolazione da modulatori esterni si riflette in un cambio di frequenza dei potenziali d’azione e nell’esocitosi. Ci aspettiamo anche di osservare aumentati livelli di canali di tipo L in neuroni ippocampali trattati per lungo tempo con NGF e di valutare il loro possibile ruolo nel controllo del rilascio di neurotrasmettitori da terminali GABAergici e glutammatergici. Gli effetti dell’ipossia sui canali L sono meno chiari di quelli osservati per i canali T e pertanto valuteremo le condizioni ottimali per poterli reclutare ad alte densità.

Obiettivo #2 – Esistenza di percorsi modulatori convergenti o distinti mediati da agonisti endogeni sui canali L neuronali

Utilizzando topi WT, Cav1.3 e Cav1.2 KO ci aspettiamo di discriminare se i due tipi di modulazioni dei canali L (Cav1.2 e Cav1.3) convergono sullo stesso canale o seguono percorsi paralleli su due canali distinti. La chiarificazione di questi importanti meccanismi permetterà di capire fenomeni analoghi in cellule di tessuti diversi dal neuronale e neuroendocrino.

Obiettivo #3 – Reclutamento di canali T in neuroni ippocampali esposti a ipossia cronica o altre condizioni di stress in topi WT e KO Cav1 e Cav3: implicazioni in varie forme di epilessia

Utilizzando topi WT e KO, in questa parte del progetto prevediamo di capire il ruolo che i canali T esercitano sull’attività spontanea in neuroni centrali quando questi canali sono up-regolati dall’ipossia cronica o da aumentate condizioni di stress. Un’aumentata attività dei potenziali d’azione spontanei associata al reclutamento di canali T (Cav3.2) sarà rilevante per l’ipotesi parzialmente accettata che I canali di tipo T svolgono un ruolo importante nella generazione di varie forme di epilessia.


MILANO-BICOCCA (Wanke): “BASI MOLECOLARI DI CANALOPATIE E ANALISI FUNZIONALE IN SINGOLI NEURONI E IN RETI NEURONALI”

Obiettivo #1.1 - Analisi funzionale di una mutazione missenso (R542Q) presente in pazienti GEFS+ sul gene SCN1A, mai studiata fino ad ora, ma già riportata in letteratura come associata all’autismo;

I risultati delle ricerche potranno chiarire se le caratteristiche funzionali di mutazioni che portano a differenti fenotipi neurologici possono essere classificate in classi analoghe o differenti. E’ noto infatti che diversi tipi di mutazioni causanti epilessie GEFS+ hanno caratteristiche funzionali diverse (loss-of-function, traffiking, etc). Diversi tipi di composti farmacologicamente attivi potranno essere studiati per applicazione terapeutica.

Obiettivo #1.2 - Una mutazione epilettogena umana sul gene KCNH7 e il suo ruolo funzionale negli etero-canali della famiglia ERG presenti nel SNC

I risultati delle ricerche potranno chiarire se le caratteristiche funzionali della mutazione (gain-of-function) che portano all’epilessia con assenze, ipoteticamente presente in neuroni inibitori, è comune anche ad altre mutazioni scoperte per questo fenotipo neurologico. Diversi tipi di composti farmacologicamente attivi potranno essere studiati per applicazione terapeutica.

Obiettivo #1.3 - Caratteristiche funzionali di reti corticali di topi knockin per canalopatie e malattie degenerative

I risultati di queste ricerche saranno le prime in assoluto che permetteranno di indicare le possibili relazioni tra cambiamenti delle proprietà biofisiche e relativi cambiamenti dell’attività di rete nel tessuto nervoso. Fino ad ora i cambiamenti dell’attività del tessuto nervoso erano stati indirettamente studiati, solo a livello comportamentale e solo su modelli murini. Le potenzialità applicative saranno saggiate a livello farmacologico.

Nel secondo anno sono previsti i seguenti obiettivi:

Obiettiov #2.1 - Ricerca di nuove mutazioni sul gene SCN1A in un database di migliaia di pazienti presenti presso ospedali lombardi

I risultati delle ricerche potranno estendere notevolmente la casistica neurologica e le proprietà funzionali della mutazione in relazione alle patologie da cui esse provengono, in modo da chiarire se le caratteristiche funzionali delle mutazioni trovate (loss-of-function, traffiking, etc) hanno delle relazioni specifiche con le malattie. Diversi tipi di composti farmacologicamente attivi potranno essere studiati per applicazione terapeutica.

Obiettivo #2.2 - Studi funzionali di modelli di canalopatie umane ottenuti con tecniche di trasferimento genico

I risultati di queste ricerche dovrebbero avere un notevole impatto applicativo perchè una diretta ricostruzione, in una rete neuronale, del difetto genetico permetterebbe applicazioni di screening famacologico a larga scala per individuare e sviluppare composti utilizzabili a livello curativo.



PADOVA (Pietrobon): “CANALI DEL CALCIO NEURONALI ED EMICRANIA”

Obiettivo #1 - Analisi della neurotrasmissione corticale eccitatoria e inibitoria e dell’eccitabilità dei circuiti corticali in topi WT e FHM1 knockin

L’Unita’ si aspetta di comprendere come il guadagno di funzione dei canali CaV2.1 indotto dalle mutazioni FHM1 alteri la trasmissione sinaptica e la plasticità a breve termine di connessioni eccitatorie ed inibitorie tra neuroni identificati della corteccia cerebrale, e come queste alterazioni influenzino l’eccitabilità complessiva dei circuiti corticali locali e il bilancio tra gli inputs inibitori ed eccitatori globali sui neuroni piramidali. Ci aspettiamo che queste informazioni possano chiarire i meccanismi alla base dell’aumentata suscettibilità alla cortical spreading depression (CSD) nella FHM1. Poiché la CSD è alla base dell’aura emicranica e (in accordo con crescenti evidenze sperimentali) è una disfunzione cerebrale chiave nella generazione degli attacchi emicranici, i risultati che ci attendiamo forniranno importanti chiarimenti sulla controversa causa primaria dell’emicrania e potrebbero aiutare a definire nuove strategie terapeutiche e sviluppare farmaci efficaci nella prevenzione dell’emicrania (di cui c’e’ tanta necessita’). Inoltre, I risultati che ci aspettiamo stabiliranno il ruolo fisiologico svolto dai canali CaV2.1 nel controllo della trasmissione sinaptica e nella plasticità a breve termine di sinapsi eccitatorie ed inibitorie identificate nella corteccia somatosensoriale, così come il loro ruolo fisiologico nel mantenimento dell’equilibrio fra eccitazione ed inibizione, determinante per il comportamento della rete nei circuiti corticali.

Obiettivo #2 Effetti di mutazioni FHM1, di mediatori dell'emicrania e di farmaci antiemicranici sui neuroni nocicettivi trigeminali

L’Unita’ si aspetta di chiarire l'impatto delle mutazioni FHM1 e dell’NO sulla fisiologia dei neuroni dei gangli trigeminali (TG), in particolare sui neuroni del sistema trigeminovascolare che innervano le meningi, dato il loro ruolo chiave nella generazione del dolore emicranico. I risultati potrebbero chiarire alcuni aspetti della neurobiologia del dolore emicranico e i meccanismi ancora ignoti alla base dell’accoppiamento fra la CSD e l’attivazione dei nocicettori meningei. Ci aspettiamo inoltre di approfondire la nostra conoscenza del meccanismo d'azione dei farmaci attualmente utilizzati nel trattamento acuto dell’emicrania; questo potrebbe favorire lo sviluppo di farmaci antiemicranici più efficaci (il 20-30% dei pazienti non risponde ai farmaci utilizzati attualmente e il mal di testa ricorrente è un problema comune).


TORINO (Tempia): “RUOLO DEI CANALI DEL POTASSIO IN MODELLI ANIMALI DI MORBO DI ALZHEIMER E DI EPILESSIA”

Per l’Unità di Torino (Tempia) gli obiettivi immediati del progetto proposto riguardano nel primo anno:

Obiettivo #1: Eccitabilità di membrana e canali del potassio in modelli di morbo di Alzheimer

Obiettivo #1.1 - studio delle alterazioni della scarica di potenziali d’azione spontanea ed evocata in neuroni coinvolti nel morbo di Alzheimer

Nei modelli di morbo di Alzheimer, tramite uno screening completo di tutti i parametri associati alla scarica di potenziali d’azione, la ricerca identificherà tutte le alterazioni dell’eccitabilità di membrana causate da ogni meccanismo ionico coinvolto. Le alterazioni possono essere diverse in vari tipi di neuroni e nelle varie regioni del sistema nervoso coinvolte nella malattia.

Obiettivo #1.2 - Identificazione delle correnti ioniche e delle subunità proteiche responsabili delle alterazioni dell’eccitabilità di membrana e della scarica di potenziali d’azione

In questa parte della ricerca ci aspettiamo di scoprire i meccanismi ionici e i tipi di correnti ioniche responsabili per ogni alterazione trovata con l’obiettivo 1.1. Questi risultati ci permetteranno di restringere il campo dei canali candidati e di identificare quali famiglie e sottofamiglie cono coinvolte.

Obiettivo #1.3 - Analisi dell’espressione genica dei canali alterati nei modelli di morbo di alzheimer, mediante real-time RT-PCR e immunoistochimica

Questa parte finale della ricerca concernente l’obiettivo 1, condurrà all’identificazione delle subunità di canali la cui espressione, a livello di mRNA o di proteina, è alterata nei modelli di morbo di Alzheimer.

Per l’Unità di Torino (Tempia) gli obiettivi immediati del progetto proposto riguardano nel secondo anno:

Obiettivo #2 - Alterazioni dell’eccitabilità di membrana e dei canali del potassio della sottofamiglia erg nell’epilessia.

Obiettivo #2.1 - Alterazioni dell’espressione dei canali erg in seguito a crisi epilettiche sperimentali

I risultati di questa serie di esperimenti indicheranno per quali geni di canali erg l’espressione è up- o down-regolata in seguito a crisi epilettiche. Tale risultato indica, per uno o più geni, un coinvolgimento secondario che è la base per progettare strategie terapeutiche innovative agenti sulle correnti erg.

Obiettivo #2.2 - Alterazioni dell’eccitabilità in seguito ad inibizione o potenziamento delle correnti erg in fettine acute di tessuto nervoso

Dato che i canali erg sono espressi in neuroni sia eccitatori sia inibitori, solo esperimenti di questo tipo possono fornire informazioni sul loro ruolo nell’eccitabilità complessiva di rete. I risultati distingueranno i ruoli dei canali erg in diversi tipi cellulari in circuiti complessi come l’ippocampo o la talamo-corteccia, definendo il ruolo specifico di popolazioni neuronali distinte nella diffusione dell’eccitabilità durante le crisi.

Obiettivo #2.3 - Alterazioni comportamentali ed elettrofisiologiche di topi transgenici portanti la mutazione epilettogena nel gene KCNH7

Una volta che sia disponibile il modello murino di epilessia con assenze collegata al gene KCNH7, il nostro studio definirà, con un’analisi comportamentale, quali sintomi sono presenti. Gli esperimenti elettrofisiologici scopriranno alcuni dei meccanismi nervosi responsabili dei sintomi.


PERUGIA: “STUDIO DELLE FUNZIONI FISIOLOGICHE REGOLATE DAI CANALI DEL K+VOLTAGGIO-DIPENDENTI ED "INWARDLY-RECTIFYING" E DELLE LORO IMPLICAZIONI IN CANALOPATIE UMANE”.

Obiettivo #1.1 – Meccanismi molecolari e neurofisiologici di EA1

Per quanto concerne lo studio dei meccanismi molecolari di EA1, i risultati preliminari ottenuti e quelli forniti dagli esperimenti proposti, mediante l’uso di avanzate tecniche di biologia cellulare e di elettrofisiologia, potrebbero dimostrare che le mutazioni nel gene KCNA1 causano maggiormente, se non unicamente, loss-of-function. Mentre, lo stato attuale delle conoscenze indica che queste mutazioni provocano un effetto misto di loss- e gain-of-function del canale. Quindi, si prevede che l’impatto di queste nuove conoscenze sarà di notevole importanza sia nell’ambito dell’EA1 che, generalmente, per altre canalopatie umane.
D’altra parte, gli esperimenti riguardanti lo studio dei meccanismi neurologici dell’EA1, mediante l’impiego topi Kv1.1KO, potrebbero permetterci di comprendere le cause dei sintomi cerebellari dell’EA1, quali l’atassia ed i tremori. Inoltre, potrebbero contribuire a chiarire maggiormente anche: i) il ruolo delle cellule canestro nella circuitistica cerebellare; ii) la dinamica delle risposte elettriche dei vari tipi cellulari in condizioni normali e in assenza dei canali Kv1.1; iii) il ruolo dei canali Kv1.1 nella plasticità cerebellare a breve e a lungo termine.

Obiettivo #1.2 – Studio del ruolo fisiologico dei canali del potassio Kir5.1 di tipo “inwardly-rectifying

Gli esperimenti proposti ed i risultati preliminari ottenuti (utilizzando topi Kir5.1KO, i quali sono stati generati in collaborazione con il Dr.Tucker che opera presso la prestigiosa Università di Oxford) potrebbero dimostrare che i canali Kir5.1 svolgono un ruolo molto importante come regolatori dei flussi di potassio e della eccitabilità dei neuroni del locus coreuleus (LC) durante l’alcalosi e l’acidosi. Inoltre, questo studio potrebbe chiarire i meccanismi cellulari che contribuiscono a scatenare gli attacchi di panico, indotti da acidosi ipercapnica, in soggetti predisposti. Questa modulazione, però, potrebbe avvenire non solo nel locus coeruleus ma anche nell’ippocampo, nel cervelletto, etc. Alcuni degli esperimenti proposti saranno svolti in stretta collaborazione con i partners di questo progetto e potrebbero dimostrare che i canali Kir5.1 modulano sia l’eccitabilità di queste cellule che le secrezioni ormonali dalle cellule delle isole del Langherans o dlle ghiandole surrenaliche. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

I canali ionici sono strutture proteiche centrali per il funzionamento del sistema nervoso e ne condizionano fortemente lo sviluppo, la maturazione e l’insorgere di patologie. Nell’ultimo ventennio abbiamo assistito ad un continuo fiorire di lavori mirati all’identificazione molecolare e funzionale delle varie classi di canali del Na, Ca e K, tanto che al momento si conoscono un numero elevatissimo di canali del K (più di 60), 10 tipi di canali del Ca e 9 tipi di canali del Na, con specifiche peculiarità molecolari e funzionali.
Molte funzioni sono note ma molte restano da chiarire, come ad esempio: 1) le basi molecolari del gating dei canali del Na, Ca e K, 2) il ruolo dei diversi tipi di canali del Na che supportano il firing di neuroni centrali, 3) il contributo di nuovi canali del Ca e Na reclutati da vari stimoli che abbassano la soglia di attivazione del potenziale d’azione in varie forme di iperalgesia e epilessia, e 4) la distribuzione ed il ruolo dei diversi tipi di canali del Ca presinaptici responsabili della deplezione e del ripristino delle vescicole secretorie. Questi sono solo alcuni dei tanti problemi ancora insoluti, relativi al ruolo dei canali ionici voltaggio-dipendenti. Su tutto questo si è aperto recentemente un ulteriore vasto capitolo di interesse clinico che riguarda un numero crescente di patologie strettamente associate a mutazioni strutturali dei canali (le canalopatie) che sono identificate e classificate in base al tipo di canale mutato e al tipo di patologia causata. E’ così stretto il legame tra “funzioni” e “disfunzioni” dei canali che studiare un aspetto equivale a studiare l’altro.

1) RUOLO FUNZIONALE DEI CANALI DEL CALCIO L E T NEURONALI NEL CONTROLLO DELL'ATTIVITÀ PACEMAKER E NEUROSECRETORIA: IMPLICAZIONI NELLE CANALOPATIE E ALTERAZIONI DELL'ECCITABILITÀ NEURONALE

La maggior parte di canali del Ca può essere effettivamente modulata da una varietà di secondi messaggeri attraverso percorsi spazialmente e cineticamente distinti in grado di causare up- o down-regolazione dei flussi di Ca, e malfunzionamento cellulare. Di particolare interesse per questo progetto è la doppia modulazione dei canali L osservata nelle cellule cromaffini di ratto (RCC) quando sono stimolate da agonisti recettoriali: una veloce inibizione mediata da proteine Gi e un lento potenziamento mediato da cAMP/PKA (Cesetti et al., 2003). Una possibilità è che i due meccanismi convergano su un unico tipo di canale L, ma è anche possibile che ciascun percorso proceda in parallelo su due canali distinti espressi nelle RCC (Cav1.2 e Cav1.3). L’esistenza di queste due isoforme nei neuroni centrali e il ruolo chiave che i canali L svolgono nella patogenesi della memoria, depressione, Alzheimer e Parkinson (Chan et al., 2007) rendono estremamente interessante lo studio di questi meccanismi di modulazione in neuroni ippocampali.

I canali del Ca possono essere efficacemente reclutati da trattamenti che prevedono l’esposizione a breve e lungo termine di fattori neurotrofici, secondi messaggeri, neurotrasmettitori e modulatori endogeni che generano segnali trascrizionali al nucleo e ne stimolano la sintesi e l’incorporazione in membrana. Il reclutamento e la modulazione dei canali del Ca sono meccanismi importanti che condizionano il funzionamento neuronale e possono indurre rilevanti cambiamenti delle funzioni cellulari (Carbone et al., 2006). Recentemente abbiamo dimostrato che trattamenti a lungo termine dei neuroni ippocampali con NGF causano una selettiva up-regolazione dei canali L che accelera i processi di maturazione delle sinapsi GABAergiche (Baldelli et al, 2005). In parallelo, abbiamo anche dimostrato che singole applicazioni di cAMP o stimolazioni beta-adrenergiche sono in grado di reclutare canali T di tipo alfa1H (Cav3.2) in RCC dopo 3-4 giorni di incubazione. Il reclutamento dei canali T stimola una forte esocitosi a bassa soglia con una calcio-efficienza simile a quella indotta dai canali L. Il reclutamento dei canali T avviene anche durante condizioni di ipossia cronica via HIF (hypoxia-inducible factors) (Carabelli et al, 2007). Ciò suggerisce che condizioni di stress stimolano il reclutamento di canali T in RCC, possibilmente attraverso un meccanismo trascrizionale comune che porta alla sintesi di nuovi canali di tipo T funzionanti.

A causa dell’importanza strategica dei canali L e T nel funzionamento dei neuroni ippocampali e nelle cellule cromaffini, l’attività di ricerca di questo progetto si focalizzerà su tre obiettivi: 1) il ruolo che svolgono i canali L nell’attività pace-maker e nel rilascio dei neurotrasmettitori in neuroni ippocampali e cellule cromaffini, 2) l’esistenza di percorsi modulatori mediati da agonisti endogeni sui canali neuronali L, e 3) il reclutamento di canali T in neuroni ippocampali esposti a condizioni di ipossia o di stress in topi WT e KO Cav3.


2) BASI MOLECOLARI DI CANALOPATIE E ANALISI FUNZIONALE IN SINGOLI NEURONI E IN RETI NEURONALI

Il presente progetto non solo prosegue le ricerche già iniziate negli anni precedenti finanziate con fondi PRIN-COFIN) sui geni SCN1A (Nav1.1) e KCNH7 (Kv11.1), ma prevede l’inizio di una nuova serie di studi utilizzando una nuova tecnica elettrofisiologia d’avanguardia, la registrazione multielettrodo (MEA).

Evidenze che una mutazione sul gene SCN1A riportata per l’autismo e’ presente anche in epilessie GEFS+

Durante una recente indagine abbiamo scoperto che una mutazione già nota per l’autismo è presente anche in una famiglia classificata a livello neurologico come epilessia GEFS+ (Weiss et al, 2003). Si tratta della mutazione R542Q che è stata individuata in una zona citoplasmatica della proteina-canale del Na. Questa mutazione è presente su un aminoacido (R) ben conservato fra gli altri più comuni canali al Na espressi nel sistema nervoso centrale. Inoltre, gli otto aminoacidi successivi sono stati considerati una sequenza consenso per un sito che è il sito di fosforilazione del canale. Poiché il canale può essere modulato mediante fosforilazione delle tirosine, la mutazione potrebbe alterare la regolazione dell’attività del canale. Appare quindi estremamente importante studiare la funzionalità del canale in queste condizioni.

Prosecuzione delle ricerche in atto (mutazioni su canali ionici K herg):

La famiglia dei canali erg (eag-related-gene) K nei mammiferi è composta da almeno 3 membri. Tutti i geni della famiglia sono anche espressi fortemente nei tessuti nervosi. Le correnti erg svolgono svariate funzioni fisiologiche studiate nei nostri laboratori (Chiesa et al, 1997), suggerendo un possibile ruolo anche nella proliferazione tumorale. Una mutazione individuata in un paziente con una forma di epilessia con assenze caratterizzata dai prof. Bianchi (Arezzo) e Zara (Gaslini, Genova) è stata trovata sul gene KCNH7 (erg3). L’espressione in cellule HEK292 ottenuta nei nostri laboratori mostra uno “shift” a sinistra della curva di attivazione del canale con conseguente “guadagno di funzione”.

Utilizzazione di tecniche elettrofisiologiche avanzate.

La registrazione multielettrodo (MEA) è una tecnica non-invasiva e nuova che permette di analizzare l’attività elettrica di centinaia di neuroni simultaneamente registrando extracellularmente. Le petri MEA permettono di studiare l’attività spazio-temporale strutturata in fettine o colture organotipiche e in reti nervose non strutturate (Tu et al, 2005). Abbiamo osservato come può essere alterata l’omeostasi extracellulare del GABA che deriva dal bilancio fra il GABA rilasciato e quello ricaptato dal trasportatore GAT1. Usando concentrazioni crescenti di un inibitore competitivo, il SKF89976A risulta che sia lo “spike rate” che il “burst rate” sono fortemente ridotti a causa dell’aumento di GABA extracellulare che produce un’inibizione tonica mediata dai recettori GABA extracellulari.
E’ noto inoltre che il carbenexolone (CBX) è in grado di bloccare le sinapsi elettriche associate alle gap junctions fra gli interneuroni inibitori. Anche in questo caso è possibile dimostrare il ruolo funzionale delle gap junctions presenti nelle reti neuronali e che a certe concentrazioni di CBX la sostanza è in grado di produrre effetti opposti in classi di neuroni diversi. Per illustrare la completa maturità del sistema GABAergico nelle nostre reti, e la presenza dei canali “pacemaker” nei neuroni, abbiamo potuto osservare i potenti effetti di disinibizione della rete prodotti dalla gabazina (GBZ, 20µM, un potente inibitore della inibizione fasica e tonica del GABA) e quelli dello ZD7288 (ZD, bloccante specifico del canale “pacemaker” HCN) che inibisce completamente l’attività della rete stessa.


3) CANALI DEL CALCIO NEURONALI ED EMICRANIA

Fra i vari tipi di canali del Ca voltaggio dipendenti, i canali P/Q (Cav2.1) svolgono un ruolo chiave nel controllo della trasmissione sinaptica veloce, particolarmente nelle sinapsi eccitatorie centrali (Pietrobon, 2005). Mutazioni nel gene che codifica per la subunità formante il poro in questi canali causano alcune malattie neurologiche autosomiche dominanti, tra cui l’emicrania emiplegica familiare di tipo 1 (FHM1), una rara forma di emicrania con aura. L’emicrania è tra le più diffuse malattie neurologiche, colpisce più del 10% della popolazione ed è classificata come una delle 20 malattie più debilitanti. Sembra assodato che i) l’aura visiva emicranica sia dovuta alla cortical spreading depression (CSD: un’onda di depolarizzazione neuronale che si propaga lentamente attraverso la corteccia cerebrale, seguita da soppressione dell’attività neurale) e ii) il dolore emicranico dipende dall’attivazione e sensibilizzazione delle fibre sensoriali nocicettive che innervano le meningi. Rimangono da chiarire la natura e i meccanismi della disfunzione cerebrale che causa l’emicrania, come anche il sito principale e i meccanismi di generazione e mantenimento del dolore emicranico. Studi recenti su modelli animali suggeriscono che la CSD sia una disfunzione cerebrale chiave nella generazione degli attacchi emicranici (van den Maagdenberg et al, 2004).

Abbiamo dimostrato che le mutazioni associate a FHM1 spostano a potenziali più negativi l’attivazione del canale ricombinante umano Cav2.1 e aumentano la densità di corrente Ca di tipo P/Q in un ampio intervallo di potenziali in neuroni cerebellari e corticali di topi KI portanti mutazioni FHM1, concludendo così che le mutazioni FHM1 producono un guadagno di funzione dei canali Cav2.1 umani e murini. Recentemente, abbiamo mostrato che il guadagno di funzione dei canali presinaptici P/Q porta ad un aumento della probabilità di rilascio di glutammato in sinapsi corticali di topi KI (Conti et al, 2007). Inoltre abbiamo dimostrato che topi FHM1 KI abbassano la solglia di induzione della CSD e una aumentano la velocità di propagazione della CSD, cona un’aumentata suscettibilità alla CSD.

Le conseguenze delle mutazioni che causano FHM1 sulle vie nocicettive trigeminovascolari rimangono in gran parte inesplorate. I canali P/Q controllano il rilascio di CGRP dai terminali perivascolari degli afferenti nocicettivi meningei e la vasodilatazione neurogenica in vivo, e noi abbiamo dimostrato che controllano il rilascio somatico da parte dei neuroni del ganglio trigeminale (TG) e contribuiscono alla lunga durata dei loro potenziali d’azione. Abbiamo identificato tre tipi di neuroni TG, basandoci sulle loro proprietà di firing, sensibilità alla capsaicina ed espressione di canali Ca a bassa soglia di attivazione, e abbiamo dimostrato un diverso guadagno di funzione della corrente Ca di tipo P/Q in tipi diversi di neuroni TG di topi FHM1 KI (Pietrobon et al, 2007).

4) RUOLO DEI CANALI DEL POTASSIO IN MODELLI ANIMALI DI MORBO DI ALZHEIMER E DI EPILESSIA

La prima parte del progetto (Obiettivo 1) è dedicata alle alterazioni dell’eccitabilità di membrana in modelli del morbo di Alzheimer, con speciale attenzione ai canali del potassio, che ne sono il principale meccanismo. Gli esperimenti di questa parte della ricerca si basano su scoperte finanziate dal precedente progetto COFIN-PRIN 2005, per l’aspetto riguardante le correnti Kv3. Più specificamente, la subunità Kv3.4 è sovraespressa in pazienti con morbo di Alzheimer (Angulo et al., 2004), suggerendo in ruolo in tale malattia. Questa conclusione è confermata da recenti dati in vitro implicanti la subunità Kv3.4 nell’apoptosi provocata dal peptide beta-amiloide. Nonostante questi studi indichino chiaramente che il peptide beta-amiloide induce un aumento della corrente Kv3.4, coinvolta nel processo neurodegenerativo, le conseguenze funzionali di tale aumento sul potenziale di membrana e sull’eccitabilità non sono state indagate. Per questi motivi, lo studio dei canali della sottofamiglia Kv3 proseguirà nel progetto PRIN-2007, in relazione al loro ruolo nel morbo di Alzheimer che non era un obiettivo dei progetti precedenti. Tuttavia, la questione delle alterazioni di eccitabilità di membrana in modelli di morbo di Alzheimer sarà studiata estesamente, comprendendo tutte le altre famiglie e sottofamiglie di canali del potassio. Attualmente esistono solo pochi studi su questo argomento, e ognuno indica l’alterazione di un diverso tipo di corrente del potassio: Kv3.4, Kir2.2, canali del K+ dipendenti dal Ca2+, correnti del K+ di tipo A o correnti del potassio responsabili dell’iperpolarizzazione postuma del potenziale d’azione.
La seconda parte del progetto (Obiettivo 2) è finalizzata alla scoperta del coinvolgimento dei canali del potassio di tipo erg nell’epilessia. Nei precedenti progetti (COFIN-PRIN-2003 e 2005) abbiamo dimostrato che la corrente erg riduce l’eccitabilità di un neurone del sistema nervoso centrale e che il profilo di espressione delle subunità erg è in linea con un ruolo nell’epilessia (Guasti et al., 2005).

5) STUDIO DELLE FUNZIONI FISIOLOGICHE REGOLATE DAI CANALI DEL K+VOLTAGGIO-DIPENDENTI ED "INWARDLY-RECTIFYING" E DELLE LORO IMPLICAZIONI IN CANALOPATIE UMANE

L’atassia episodica ti tipo-1 (EA1) è una malattia neurologica autosomica dominante che colpisce il sistema nervoso centrale. EA1 è caratterizzata da miochimia e da attacchi episodici di atassia con perdita di equilibrio. La patologia è caratterizzata da un numero di mutazioni puntuali nel gene del canale del K gene KCNA1 (hKv 1.1) nel cromosoma 12p13. EA1 channels hanno il gating modificato (D’Adamo et al. 1998). Recentemente, in collaborazione con neurologici e genetisti dell’Università di Ferrara, abbiamo identificato una nuova mutazione in una famiglia Siciliana affetta da EA1 ed epilessia. La caratterizzazione funzionale ha rivelato una completa perdita di funzione del canale omomerico mutato e un alterato gating di Kv1.1/Kv1.2 (Imbrici et al., 2003). In questo progetto proponiamo di studiare due problemi irrisolti relativi a EA1: le mutazioni associate a EA1 sono veramente responsabili della perdita o “guadagno di funzione” del canale? (obiettivo #1); quali alterazioni avvengono nei circuiti centrali che inducono atassia, tremor ed epilessia? (obiettivo # 2).

I canali del K “inwardly-rectifying” (Kir) sono presenti in quasi tutte le cellule dove regolano i flussi di K attravero la membrane a riposo (Pessia, 2004). Il ruolo fisiologico dei Kir5.1 rimane ancora sconosciuto. Kir 5.1 da solo non produce canali del K funzionali ma sembra in grado di co-assemblarsi con Kir4.1 e Kir4.2. L’alta sensibilità di Kir4/Kir5.1 ai protoni, suggerisce che questi canali svolgono un ruolo chiave come regolatori di flussi di KL durante l’alcalosi e l’acidosi. Questa regolazione può avvenire sia a livello centrale (locus coeruleus, ecc.) o in altri tessuti quali I tubuli renali, le cellule acinari pancreatiche, le isole di Langerhans, e le ghiandole surrenali. Per stabilire il ruolo fisiologico di questo canale, in collaborazione con Dr S. Tucker (Oxford, UK) è stato recentemente generato un topo KO per Kir5.1 che è al momento disponibile nella nostra Unità (obiettivo #3). <<<