RICERCA ITALIANA     

Strategie antiapoptotiche nelle degenerazioni retiniche: un approccio multidisciplinare

Università di Pisa

Abstract

La Retinite Pigmentosa (RP) comprende una famiglia di malattie ereditarie caratterizzate dal progressive deterioramento e degenerazione dei fotorecettori della retina. I sintomi della RP tipica sono lo sviluppo della cecità notturna e il progressivo restringimento del campo visivo, fino alla perdita completa della vista. L’incidenza stimata della RP è di 1:3,500 e tuttora la malattia è senza una cura possibile. Molti laboratori stanno attivamente sviluppando strategie sperimentali per attaccare la RP, o, quantomeno, per rallentarne la progressione. Uno strumento promettente per affrontare questa patologia consiste nel tentativo di interferire con le vie cellulari di degenerazione dei fotorecettori che eventualmente conducono alla cecità.
La degenerazione dei fotorecettori nella RP avviene per apoptosi, una forma attiva di suicidio cellulare che comprende l’esecuzione di uno specifico programma. Le fasi di tale programma sono stretto controllo cellulare ma possono anche essere modulate dall’esterno.
Il nostro progetto si centra sulla comprensione dei meccanismi cellulari che determinano l’apoptosi dei fotorecettori nella RP. In particolare, abbiamo ottenuto risultati preliminari che sostengono l’ipotesi di un coinvolgimento dello sfingolipide ceramide nella degenerazione dei fotorecettori nella RP sperimentale. Ceramide è un potente induttore dell’apoptosi attivo in varie malattie neurodegenerative, incluse la malattia di Alzheimer, il Parkinson e la malattia di Batten.
Ci proponiamo di dimostrare che è possibile prevenire la degenerazione dei fotorecettori in modelli animali di RP mediante l’uso di molecole mirate a prevenire la sintesi di questo importante sfingolipide nei fotorecettori. Vogliamo saggiare l’efficacia di queste molecole somministrandole in vivo (per iniezione intravitreale o mediante colliri opportunamente formulati) ad un mutante murino, il topo rd10, che sviluppa una degenerazione progressiva dei fotorecettori analoga alla RP umana a trasmissione autosomico recessiva.
Verificheremo l’efficacia di tale trattamento in vivo mediante a) il dosaggio biochimico dei livelli retinici di ceramide dopo il trattamento, verosimilmente accertando un decremento di questo sfingolipide; b) valutando l’effetto del trattamento sul numero dei fotorecettori picnotici (apoptotici) e verificando l’integrità morfologica dei fotorecettori che sopravvivono, in modo particolare dei coni; c) saggiando le proprietà funzionali della retina tramite registrazioni dell’elettroretinogramma (ERG) sia scotopico che fotopico, in analogia con le metodiche usate dagli oftalmologi per valutare la funzionalità visiva nei pazienti umani.
Come effetto del trattamento, ci attendiamo di trovare un decremento nei livelli retinici di ceramide, una diminuzione del numero di fotorecettori che vanno incontro ad apoptosi, un aumento del numero di fotorecettori intatti e, conseguentemente, una migliorata risposta funzionale della retina.

L’approccio combinato delle nostre tre unità, che integrano l’esperienza di un affermato laboratorio di neuroanatomia retina, quella di un team di esperti biochimici degli sfingolipidi, con un laboratorio di approfondita conoscenza di elettrofisiologia del sistema visivo, confidiamo di chiarire alcuni dei meccanismi della degenerazione dei fotorecettori nella RP, con la prospettiva immediata di sviluppare nuovi mezzi terapeutici per attaccare questa devastante patologia. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Maria Claudia Gargini Università degli Studi di PISA

Obiettivo del Programma di Ricerca

L'obiettivo finale di questo progetto è la comprensione del ruolo dei mediatori sfingolipidici nella genesi e nella progressione della Retinite Pigmentosa e la sperimentazione di un approccio farmacologico basato su queste molecole per il trattamento delle degenerazioni retiniche ereditarie. L'ipotesi alla base del presente studio è che, indipendentemente dal difetto originale che determina la degenerazione retinica, la via finale comune che porta all'apoptosi cellulare coinvolge un'alterazione del metabolismo degli sfingolipidi. Risultati preliminari che necessitano conferma ed estensione dimostrano che nel topo rd10, un mutante con un difetto genetico autosomico recessivo che causa la morte completa dei bastoncelli retinici entro P30, i livelli di nuova sintesi della ceramide sono aumentati rispetto a quelli del topo wt.
Allo scopo di raggiungere l'obiettivo centrale del progetto, l'attività coordinata delle tre unità proponenti sarà focalizzata sui seguenti punti specifici:
a) confermare i risultati preliminari che dimostrano un aumento dei livelli di ceramide nella retina rd10 in concomitanza con la progressione della patologia e correlare questi risultati con i livelli di ceramide nel wt a diverse età.
b) stabilire se la myriocina, un inibitore della reazione limitante la catena di sintesi della ceramide, catalizzata dalla serina palmitolo transferasi (SPT1), e fumosina b1, inibitore di un diverso stadio della stessa via metabolica, catalizzato dalla sfingosina N- acil transferasi, sono in grado di ridurre accumuli di ceramide nella retina di rd10.
c) dimostrare che il trattamento in vivo del topo rd10 con inibitori della biosintesi della ceramide riduce l'apoptosi dei fotorecettori e mantiene la funzione visiva. Questo aspetto cruciale sarà affrontato mediante iniezioni intravitreali delle sostanze attive (studi acuti) o dalla loro somministrazione topica mediante colliri.
La valutazione delle condizioni funzionali della retina veranno effettuate principalmente mediante registrazione di ERG.
Un ulteriore obiettivo collatarele è quello di sviluppare un procedimento efficace e non invasivo per convogliare le sostanze attive alla retina. Cercheremo di sviluppare un veicolo adeguato a base di nanosfere lipidiche, caricate con le molecole capaci di interferire con la biosintesi degli sfingolipidi, capaci di attraversare le membrane esterne dell'occhio e diffondere alla retina.
La fattibilità del progetto si basa sulla composizione multidisciplinare dei tre gruppi partecipanti le cui rispettive competenze sono complementari e adeguate all' approccio sperimentale proposto.
L'unità di ricerca I, che coordina l'intero progetto, ha una esperienza consolidata in elettrofisiologia retinica e in modo particolare nella registrazione e analisi dell'ERG ed è pertanto nelle condizioni di poter valutare nei dettagli lo stato funzionale della retina sia in condizioni normali che patologiche. L'unità di ricerca II ha una lunga esperienza sulla morfologia, l'immunoistochimica e l'organizzazione funzionale della retina e sarà responsabile della valutazione della sopravvivenza e della conservazione strutturale dei fotorecettori e in generale della retina. Le competenze dell'unità III comprendono vari aspetti biochimici quali le metodologie radio e immuno enzimatiche e la determinazione, purificazione e cinetica degli enzimi e, soprattutto, dei lipidi, la cui misura può essere effettuata solo con metodi molto specializzati.
Il principale obiettivo di questo progetto è attuale e rilevante: va infatti notato che l'approccio neuroprotettivo alla terapia delle degenerazioni retiniche è tra i piu' promettenti. Nel presente contesto il trattamento anti apoptotico potrebbe rappresentare uno strumento efficace per rallentare la morte dei bastoncelli e la perdita dei coni, le uniche cellule visive su cui si basala funzione visiva residua dei pazienti con retinite pigmentosa. <<<

Risultati parziali attesi

Le ricerche proposte potranno evidenziare il ruolo svolto dalla via di segnalazione degli sfingolipidi nella Retinite Pigmentosa, una famiglia di malattie ereditarie che conducono a cecità e finora incurabili. Sebbene sia noto che nella RP la degenerazione dei fotorecettori della retina avvenga per apoptosi, le vie intracellulari che attivano ed eseguono il programma di apoptosi sono ancora in larga parte sconosciute. Ciascun componente molecolare di tali vie costituisce un potenziale target di altrettante terapie antiapoptotiche che possono essere messe in atto dall’esterno allo scopo di rallentare la morte dei fotorecettori.
E’ da notare che, sebbene una terapia antiapoptotica possa essere ritenuta di interesse limitato nei casi in cui lo stimolo che porta le cellule a morire persista nel tempo, come avviene nel caso della presenza di mutazioni geniche, questa stessa terapia sia invece da considerarsi efficace quando ci si trovi in presenza di patologie a decorso particolarmente lento, come appunto la Retinite Pigmentosa. Considerando che la degenerazione dei bastoncelli, nella RP tipica, avviene nel corso di molti anni, un rallentamento ulteriore del processo di disgregazione dei fotorecettori verrebbe a rappresentare una conservazione di forme residue di visione per un tempo percepibile in termini di miglioramento della qualità di vita dei pazienti. Inoltre, essendo nota la dipendenza dei coni dai bastoncelli, il mantenimento in vita di questi ultimi, anche se scarsamente funzionanti, eserciterebbe un’azione neuroprotettiva secondaria sui coni, con conservazione di visione diurna residua ancora efficace.
Pertanto, tra i risultati di interesse generale del presente progetto di ricerca, è da collocarsi la possibilità reale di prolungare la sopravvivenza dei fotorecettori retinici nella RP, e quindi la visione utile dei pazienti colpiti da tale patologia.
In tal senso riveste particolare valore applicativo la possibilità di instaurare trattamenti cronici somministrando colliri contenenti molecole in grado di inibire la sintesi de novo degli sfingolipidi, basati su preparazioni di nanosfere liposolubili. Sebbene tali preparazioni siano già in corso di brevettazione per l’impiego in oftalmologia, l’elemento innovativo della nostra proposta consiste proprio nel particolare target molecolare prescelto, ossia la via di sintesi del ceramide. Infatti, questo è il primo studio nel quale si propone un trattamento in vivo con molecole che abbiano le proprietà biochimiche, finora testate solamente su sistemi in vitro, di inibire la sintesi degli sfingolipidi. Se trovassimo risultati positivi a seguito delle somministrazioni croniche nei modelli animali di RP, si potrebbe pensare ad una estensione delle possibilità di trattamento a tutti i sistemi in cui è stato dimostrato che la via di segnalazione degli sfingolipidi è coinvolta nel processo di sviluppo della condizione patologica. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La morte cellulare programmata di tipo apoptotico riveste un ruolo determinante in numerose malattie neurodegenerative, comprese il morbo di Parkinson e la sclerosi laterale amiotrofica, così come in varie affezioni acute, tra cui l’ischemia e il trauma cerebrale e del midollo spinale (Waldmeier, 2003).

Di recente, l’impiego terapeutico di sostanze antiapoptotiche nella neurodegenerazione ha ottenuto considerevole credito. In particolare, studi di biochimica e biologia cellulare hanno contribuito notevolmente ad identificare le vie cellulari coinvolte nell’apoptosi, aprendo la prospettiva di disegnare composti che interferiscono con il processo patologico senza effetti indesiderati. In vari modelli animali, i deficit funzionali causati dalla morte apoptotica possono oggi essere ritardati o almeno parzialmente prevenuti da trattamenti adeguati (si veda, ad esempio, Sugai e al., 2004). Sebbene molto debba ancora essere fatto nell’ambito dell’esplorazione terapeutica delle sostanze antiapoptotiche, la prospettiva che tale categoria di molecole possa incidere sul trattamento terapeutico delle condizioni neurodegenerative, e forse influire anche su quello del trauma e dell’ischemia cerebrali, è da considerarsi senz’altro positiva. Più che agire in modo acuto come sintomatici, ci si aspetta che i farmaci antiapoptotici possano rallentare ulteriormente la progressione di malattie neurodegenerative già intrinsecamente lente.

Tra le patologie che colpiscono aree del Sistema Nervoso Centrale e che presentano una componente rilevante di morte neuronale apoptotica, rientra la Retinite Pigmentosa (RP), una famiglia di patologie ereditarie caratterizzata dal progressivo deterioramento e dalla degenerazione dei fotorecettori. La RP è una delle maggiori cause di cecità nel mondo e la forma più frequente di grave degenerazione retinica, con una incidenza stimata di 1 su 3,500 nati.
Nella RP tipica (la forma più comune), una mutazione, di solito a carico di un gene specifico dei fotorecettori, quale la rodopsina, causa la degenerazione primaria dei bastoncelli, con conseguente cecità notturna. Con la progressione della patologia, anche i coni degenerano, i vasi sanguigni della retina si attenuano e anche la visione diurna è compromessa. L’epitelio pigmentato della retina mostra segni di anormalità; depositi di pigmento si formano nella retina neurale. Nel tempo, i pazienti perdono qualsiasi forma di visione utile. Al momento attuale, non c’è cura possibile per questa malattia.

A dispetto della tremenda eterogenicità genetica della RP (sono note più di 100 differenti mutazioni in 40 geni diversi, responsabili dei vari fenotipi), la degenerazione dei fotorecettori è riconosciuta essere di tipo apoptotico (Chang et al., 1993; Wenzel et al., 2005). In effetti, la sovraespressione del gene antiapoptotico bcl-2 nei fotorecettori per rallentarne la morte in un modello murino di RP ha rappresentato uno dei primi tentativi di interferire geneticamente con l’apoptosi in una condizione patologica di un mammifero (Bennett et al., 1998).

Le vie cellulari biochimiche che determinano l’apoptosi dei fotorecettori nella RP sono ancora largamente sconosciute: nei mutanti della fosfodiesterasi dei bastoncelli, il sovraccarico di calcio è il trigger primario dell’apoptosi; nei mutanti del carbossi-terminale della rodopsina, l’accumulo di prodotti proteici citotossici causa stress del reticolo endoplasmatico e mitocondriale e porta alla morte cellulare.
Di recente, esperimenti condotti su modelli mutanti di Drosophila che mimano la RP, è stato dimostrato un coinvolgimento dello sfingolipide pro-apoptotico ceramide nel processo di morte dei fotorecettori (Ranganathan, 2003). L’espressione transgenica di ceramidasi, l’enzima che idrolizza ceramide a sfingosina e acidi grassi, previene la degenerazione dei fotorecettori nei mutanti di Drosophila per arrestina 2 o fosfolipasi C, abbassando i livelli di ceramide (Acharya et al., 2003). Similmente, il blocco genetico de macchinario di biosintesi de novo del ceramide sopprime la degenerazione dei fotorecettori in questi stessi mutanti (Acharya et al., 2003).
Gli Autori di questi studi suggeriscono, meccanicisticamente, che l’espressione di ceramidasi (e, conseguentemente il decremento nei livelli di ceramide, faciliti il turnover delle membrane e il turnover della rodopsina nei fotorecettori colpiti dalla mutazione (Acharya et al., 2004).
Il coinvolgimento di ceramide nella patogenesi della RP umana è stato confermato dalla recente scoperta in una famiglia spagnola di una mutazione di CERKL, un gene per la ceramide chinasi, quale causa di una forma di RP autosomico recessiva (Tuson et al., 2004).
Infine, German et al., nel 2006, hanno dimostrato che il danno chimico ossidativo aumenta i livelli di ceramide e causa apoptosi in neuroni di retina di ratto in coltura.
D’altra parte, è da notare che, prima del riconoscimento di un ruolo anche nella RP, il coinvolgimento del pathway degli sfingolipidi nella morte cellulare ha ricevuto notevole attenzione, portando appunto alla scoperta di ceramide quale effettore proapoptotico in numerosi sistemi normali e patologici (Hannun e Obeid, 2002). In particolare, la patogenesi di alcune gravi malattie neurodegenerative è stata ascritta ad un inizio inappropriato dell’apoptosi. Nel caso delle malattie di Parkinson, Alzheimer, Batten e sclerosi laterale amiotrofica, si è dimostrato che l’aumento di ceramide costituisce una causa di morte cellulare, che in ultima analisi conduce alla perdita di funzioni centrali o periferiche caratteristica di queste patologie (Lee et al, 2004; France-Lanord et al, 1997; Satoi et al,2005; Cutler et al, 2002; Puranam et al, 1999). L’accumulo di ceramide è generalmente dovuto alla attivazione della sua sintesi de novo, ad un’aumentata idrolisi della sfingomielina da parte della sfingomielinasi acida o, in alternativa, a diminuito consumo di ceramide tramite glicosilazione o fosforilazione (Hannun e Obeid, 2002).

Il presente progetto di ricerca mira a verificare l’ipotesi di un diretto coinvolgimento della via di segnalazione degli sfingolipidi nella degenerazione dei fotorecettori studiata in un modello murino di Retinite Pigmentosa.
A seguito di questa indagine, intendiamo interferire con la via di sintesi del ceramide per rallentare la morte dei fotorecettori e conseguentemente la progressione della malattia. Ciò è particolarmente rilevante in considerazione del fatto che, in genere, la RP ha una evoluzione naturalmente lenta. In effetti, una delle più promettenti strategie terapeutiche per aggredire la RP consiste nella neuroprotezione, ossia il tentativo si ritardare la degenerazione dei fotorecettori, e in particolare quella dei coni, le uniche cellule su cui si fonda la visione residua dei pazienti con RP.
Impiegheremo principalmente un mutante che abbiamo contribuito a caratterizzare di recente, ossia il topo rd10, che mima la RP a trasmissione autosomico recessiva (Gargini et al, 2007). Il topo rd10 esprime una mutazione missenso della subunità beta della fosfodiesterasi dei bastoncelli, associata ad una degenerazione di queste cellule che inizia intorno a P14. In seguito, si ha una più lenta degenerazione dei coni, con tipico gradiente centro-periferia.
La morte dei bastoncelli, che mostra un picco a P14, ha i segni distintivi dell’apoptosi, dal momento che le cellule mostrano nuclei condensati e picnotici, risultano positive per la tecnica Tunel ed alcune di loro esprimo una forma attivata di caspasi 3. Il modello risulta eccellente per lo studio della degenerazione sia dei bastoncelli che dei coni poiché le ondate di morte che colpiscono le due popolazioni cellulari risultano separate nel tempo; inoltre, in confronto al noto mutante rd1, la più tardiva insorgenza della morte dei bastoncelli rende possibile distinguere tra eventi correlati alla morte dei fotorecettori vera e propria e quelli invece dovuti ad un anormale sviluppo delle connessioni retiniche.

E’ da notare che abbiamo già ottenuto risultati preliminari molto promettenti nel mutante rd10, mostrando un aumento relativo dei livelli retinici di ceramide in concomitanza con il picco di morte dei fotorecettori, che suggerisce un coinvolgimento della via di sintesi degli sfingolipidi nel processo di degenerazione di queste cellule.

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