RICERCA ITALIANA     

Sviluppo di metodologie innovative per lo studio della risposta metabolica a stress abiotici da parte di piante normali ed a struttura ormonale geneticamente modificata.

Università di Pisa

Abstract

Il programma di ricerca proposto sarà pianificato e condotto in stretta collaborazione tra tutte le altre Unità di Ricerca (U.R.), con lo scopo di integrare le competenze scientifiche di ogni U.R. al fine di raggiungere l’obiettivo comune: valutare la risposta metabolica a stress abiotici da parte di un sistema test biologico mediante un set integrato di metodologie chimiche, bio-molecolari, metaboliche e fisiologiche.
A questo proposito, bisogna dire che un sistema test biologico per consentire lo studio degli effetti causati da stress abiotici deve essere ben noto e caratterizzato dal punto di vista genetico e fisiologico, disponibile in quantità sufficiente, allevabile in condizioni controllate ad evitare che altri fattori che non fanno parte del test influiscano sui vari esperimenti. Inoltre deve essere tale da permettere lo studio dell'effetto dello stress a molti livelli e cioè quello molecolare di attività genica, quello metabolico, quello fenotipico. Il sistema biologico su cui saranno effettuati gli esperimenti è costituito da genotipi della pianta Nicotiana langsdorffii e da genotipi transgenici della stessa pianta per il gene gr, codificante per il recettore degli ormoni glucocorticoidi di ratto, e per il gene rolC proveniente da Agrobacterium rhizogenes.
La Nicotiana langsdorffii transgenica per il gene gr del ratto, è già disponibile presso la U.R. 2 (Biologia Genetica, Università di Firenze), ed è stata già caratterizzata per il transgene inserito, il numero di copie e la sua espressione mediante tecniche PCR e RT-PCR. Per questa pianta è già noto che il bilancio ormonale è spostato verso le auxine nel genotipo normale, e verso le citochinine in quello transgenico. Mentre, la Nicotiana langsdorffii transgenica per il gene rolC dell’Agrobacterium rhizogenes sarà preparata appositamente per questo progetto. In particolare, la trasformazione sarà condotta mediante la tecnica di infezione del disco fogliare, e la caratterizzazione dei trasformati primari, selezionati in un mezzo contenente kanamicina, sarà effettuata attraverso la determinazione della presenza delle sequenze nel vettore di trasformazione (gene nptII e rolC) mediante tecniche di PCR.
Il materiale su cui eseguire i test è quindi omogeneo da tutti i punti di vista fatta eccezione per la presenza, nelle piante transgeniche ma non in quelle normali, di un gene che modifica l’equilibrio ormonale. Le vie metaboliche oggetto di questo studio saranno per questo motivo quelle alla base di tutte le risposte di difesa nonché quelle relative al controllo dello sviluppo. Questo rende il materiale proposto ideale per compiere uno studio approfondito e mettere appunto un set integrato di metodo di analisi molecolari, metaboliche e fisiologiche da utilizzare insieme per la valutazione complessiva degli effetti associati ai vari stress abiotici.
In particolare saranno oggetto di analisi le seguenti classi di fitormoni e metaboliti organici ed inorganici:
- fitormoni: auxine, citochinine, acido abscissico, gibberelline (AG4 e AG7);
- metaboliti specifici della risposta a stress abiotici: acido salicilico, acido jasmonico, acido scichimico, polifenoli, terpeni ed attività antiossidante;
- composti correlati direttamente allo stress idrico: malato, citrato, sodio, potassio, cloruri, nitrati e zuccheri;
- composti correlati direttamente allo stress termico: acidi grassi insaturi e non, fosfatidilglicerolo;
- macro- e micro costituenti inorganici, e metalli (Cd, Cu, Hg, CR, Co, Ni, Pb, Fe, Ca, etc.).
Indagini preliminari saranno, inoltre, condotte (U.R. 4) sulla risposta ormonale della Nicotiana langsdorffii in seguito all’esposizione a molecole organiche, come ad esempio i fitofarmaci.
Nella fase iniziale sarà pianificata l’attività relativa alla caratterizzazione del sistema biologico mediante la messa a punto e l’ottimizzazione delle procedure analitiche per la determinazione dei fitormoni e dei metaboliti sopra citati. A tale scopo saranno impiegate tutte le competenze e le strumentazioni analitiche già disponibili presso le varie U.R. per le analisi chimiche e bio-molecolari.
Nella seconda fase, saranno pianificati ed eseguiti gli esperimenti di esposizione, in condizioni controllate, delle piante di Nicotina langsdorffii, sia normali che transgeniche, a metalli tossici, stress idrico e stress termico. Tutti i campioni saranno analizzati mediante le varie procedure analitiche messa a punto.
I risultati ottenuti, valutati anche mediante idonei strumenti statistici, permetteranno di descrivere in modo completo il comportamento del sistema biologico, evidenziando similitudini e differenze non solo tra pianta normale e pianta modificata geneticamente, ma anche tra i due tipi di piante transgeniche. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Roger Fuoco Università degli Studi di PISA

Obiettivo del Programma di Ricerca

La capacità di studiare processi e comprendere meccanismi relativi a sistemi reali nei vari settori applicativi, dipende strettamente dalla possibilità di ottenere informazioni accurate e precise sulla presenza di sostanze chimiche che devono essere riconosciute e quantificate a livelli di concentrazione sempre più bassi in matrici sempre più complesse. Questa attività di ricerca è caratterizzata per sua natura dalla necessità di un approccio “problem-solving” estremamente mirato e differenziato a seconda dei casi di studio. Risulta quindi fondamentale la collaborazione con altri settori disciplinari allo scopo di individuare correttamente quegli aspetti in cui il “riconoscimento molecolare” sia alla base di un avanzamento delle conoscenze.
L’obiettivo principale del programma di ricerca proposto riguarda la valutazione della risposta metabolica a stress abiotici da parte di un sistema test biologico costituito da piante normali e piante transgeniche. La proposta rappresenta il primo tentativo di studiare in modo approfondito un tale sistema biologico mediante lo sviluppo di un set integrato di metodologie chimiche, bio-molecolari, metaboliche e fisiologiche: un argomento questo di grande attualità e che pone allo stesso tempo sfide molto impegnative a chimici e biologi. Inoltre, uno studio accurato delle modificazioni del contesto metabolico indotte dalla integrazione di geni chiave per la struttura ormonale delle piante avrà anche rilevanza rispetto al problema generale del controllo di eventuali effetti imprevisti della ingegneria genetica delle piante, di notevole importanza per la discussione in corso sulla biosicurezza.
Il sistema biologico su cui saranno effettuati gli esperimenti è costituito da genotipi della pianta Nicotiana langsdorffii e da genotipi transgenici della stessa pianta per il gene gr, codificante per il recettore degli ormoni glucocorticoidi di ratto, e per il gene rolC proveniente da Agrobacterium rhizogenes.
Varie metodologie analitiche saranno ottimizzate per la determinazione delle seguenti classi di fitormoni e metaboliti:
- fitormoni: auxine, citochinine, acido abscissico, gibberelline (AG4 e AG7);
- metaboliti specifici della risposta a stress abiotici: acido salicilico, acido jasmonico ed acido scichimico, polifenoli, terpeni ed attività antiossidante;
- composto correlatiti direttamente allo stress idrico: malato, citrato, sodio, potassio, cloruri, nitrati e zuccheri;
- composti correlati direttamente allo stress termico: acidi grassi insaturi e non, fosfatidilglicerolo;
- macro- e micro costituenti inorganici, e metalli (Cd, Cu, Hg, CR, Co, Ni, Pb, Fe, Ca, ecc.).
A tale scopo saranno impiegate tutte le competenze e le strumentazioni già disponibili presso le varie U.R. per le analisi chimiche e bio-molecolari.
Successivamente saranno pianificati ed eseguiti gli esperimenti di esposizione in condizioni controllate delle piantine di Nicotina langsdorffii, sia normali che transgeniche, a metalli tossici, a stress idrico ed a stress termico. I risultati ottenuti, valutati anche mediante idonei strumenti statistici, permetteranno di descrivere in modo completo il comportamento del sistema biologico, evidenziando similitudini e differenze non solo tra pianta normale e pianta modificata geneticamente, ma anche tra i due tipi di piante transgeniche. <<<

Risultati parziali attesi

L’obiettivo principale del programma di ricerca proposto riguarda la valutazione della risposta metabolica a stress abiotici da parte di un sistema test biologico costituito da piante normali e piante transgeniche. La proposta rappresenta il primo tentativo di studiare in modo approfondito un tale sistema biologico mediante lo sviluppo di un set integrato di metodologie chimiche, bio-molecolari, metaboliche e fisiologiche finalizzate alla valutazione complessiva degli effetti associati ad uno specifico stress abiotico e se avrà successo fornirà un rilevante contributo all’avanzamento delle conoscenze in questo settore. Infatti,lo studio degli effetti degli stress abiotici sugli esseri viventi, assume particolare rilevanza in questo periodo storico in connessione con i grandi cambiamenti climatici in corso e con la conseguente necessità di acquisire un maggiore controllo degli impatti umani sugli ecosistemi. E' importante a questo riguardo lo sviluppo di sistemi modello che permettano di analizzare le interazioni dinamiche fra i vari tipi di stress ed organismi biologici con caratteristiche fisiologiche diverse, in grado di rispondere in modo differenziato e controllabile a cambiamenti drastici del contesto ambientale. Le piante geneticamente modificate, per geni chiave del metabolismo e dello sviluppo, rappresentano uno dei migliori strumenti potenziali per studiare l’interazione piante/stress. Inoltre, uno studio accurato delle modificazioni del contesto metabolico indotte dalla integrazione di geni chiave per la struttura ormonale delle piante avrà anche rilevanza rispetto al problema generale del controllo di eventuali effetti imprevisti della ingegneria genetica delle piante, di notevole importanza per la discussione in corso sulla biosicurezza.
Alla conclusione del progetto sono attesi i seguenti risultati:

1) Disponibilità di un sistema test biologico omogeneo e ben caratterizzato costituito dalla pianta Nicotiana langsdorffii e da genotipi transgenici della stessa pianta per il gene gr, codificante per il recettore degli ormoni glucocorticoidi di ratto, e per il gene rolC proveniente da Agrobacterium rhizogenes.

2) Protocolli per l’esposizione controllata di piante a stress abiotici (esposizione a metalli tossici, stress idrico e stress termico)

3) Procedure analitiche ottimizzare per la determinazione delle seguenti classi di fitormoni e metaboliti organici ed inorganici in campioni di piante:
- fitormoni: auxine, citochinine, acido abscissico, gibberelline(AG4 e AG7);
- metaboliti specifici della risposta a stress abiotici: acido salicilico, acido jasmonico ed acido scichimico, polifenoli, terpeni ed attività antiossidante;
- composto correlatiti direttamente allo stress idrico: malati, citrati, sodio, potassio, cloruri, nitrati e zuccheri;
- composti correlati direttamente allo stress termico: acidi grassi insaturi e non, fosfatidilglicerolo;
- macro- e micro costituenti inorganici, e metalli (Cd, Cu, Hg, CR, Co, Ni, Pb, Fe, Ca, ecc.).

4) Sistema integrato di analisi per la valutazione delle variazioni metaboliche in piante normali e transgeniche sottoposte a stress abiotici. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Lo studio degli effetti degli stress abiotici sugli esseri viventi, assume particolare rilevanza in questo periodo storico in connessione con i grandi cambiamenti climatici in corso e con la conseguente necessità di acquisire un maggiore controllo degli impatti umani sugli ecosistemi. E' importante a questo riguardo lo sviluppo di sistemi modello che permettano di analizzare le interazioni dinamiche fra i vari tipi di stress ed organismi biologici con caratteristiche fisiologiche diverse, in grado di rispondere in modo differenziato e controllabile a cambiamenti drastici del contesto ambientale.
Le piante sono potenzialmente uno strumento molto utile per questo tipo di studi in quanto sono sottoposte per interi cicli vitali a stress biotici ed abiotici a cui devono fare fronte modificando la loro interazione con l’ambiente non potendo spostarsi, come gli animali, alla ricerca di nicchie più confacenti alla loro sopravvivenza. Per questo durante l’evoluzione si sono dotate di sofisticati meccanismi di risposta agli stress , che vengono attivati al momento del bisogno, basati sulla ricezione di segnali e sulla espressione da questi indotta, dei geni che controllano una serie di strumenti difesa. Anche se alcuni di questi sono specifici di un certo tipo di stress, ve ne sono altri che vengono comunque attivati sia in caso di attacco da patogeni che in presenza di condizioni ambientali sfavorevoli. All’inizio di molte della vie metaboliche attivate da stress vi sono senza dubbio una serie di composti ad azione ormonale che fungono da “chiavi” per l’induzione della risposta generale di difesa. Figurano fra questi tutte le maggiori classi di fitormoni, fra cui le auxine, le citochinine e le gibberelline il cui rapporto è alla base di gran parte dei processi di sviluppo e di difesa delle piante ed altri , ancora più specifici delle riposta a stress come l’acido salicilico ( SA) , l’acido jasmonico ( JA), l’etilene ( ET) e l’acido abscissico ( ABA) (Mauch-Mani B. , Mauch F. 2005). La struttura “gerarchica” della organizzazione dei sistemi di difesa attraverso scambi di segnali (“signaling cross talks”) facilita notevolmente lo studio delle interazioni pianta-stress attraverso l’analisi degli effetti dell’esposizione ad un determinato stress su piante a diverso equilibrio ormonale. In particolare, i metodi del DNA ricombinante permettono di lavorare in questo campo con precisione attraverso la manipolazione genetica di geni chiave del sistema complesso dei fitoregolatori (Kakimoto, 2001; Takei et al.,.2001). Geni per la sintesi di alcune classi di fitoregolatori vegetali sono meglio conosciuti nei batteri del genere Agrobacterium che nelle piante (Gaudin et al., 1994). A. tumefaciens e A. rhizogenes sono batteri fitopatogeni induttori di neoplasie nelle piante (Gaudi net al., 1994; Binns and Costantino, 1998; Meyer et al., 2000) e gli oncogeni di A. tumefaciens sono coinvolti nella sintesi di auxine e di citochinine per cui la loro integrazione nel genoma dell’ospite porta a modificare gli equilibri di soglia alterando i livelli dei fitoregolatori endogeni, ivi inclusi quelli che hanno a che fare con la risposta a stress abiotici. La trasformazione di specie diverse con tutto il complesso genico dei batteri o con singoli geni induce modificazioni nei processi di crescita e di sviluppo (Schmülling et al., 1993; Faiss et al., 1996; Nilsson et al., 1996) e nella risposta delle piante a stress (Bettini et al. 2003). Inoltre è stato dimostrato che l’integrazione attraverso l’infezione naturale di geni di Agrobacterium rhizogenes ha avuto effetti drastici sull’evoluzione dell'intero genere Nicotiana (Intrieri e Buiatti, 2001). Infine, molto recentemente è stato osservato (Kung et al., 2006) come l’integrazione , ancora in Nicotiana langsdorffii, di parte di un gene per il recettore di glucocorticoidi abbia determinato interessanti modificazioni nel pattern di sviluppo della pianta, confermando alcuni risultati ottenuti in precedenza (Bogani et al., risultati non pubblicati; Irdani et al., 2003). Tali studi hanno evidenziato profonde modificazioni nello sviluppo della pianta e significative alterazioni della sua risposta di difesa nei confronti dei nematodi. Tutti questi dati, quindi individuano nelle piante geneticamente modificate, per geni chiave del metabolismo e dello sviluppo, uno dei migliori strumenti potenziali per studiare l’interazione piante/stress. Inoltre, uno studio accurato delle modificazioni del contesto metabolico indotte dalla integrazione di geni chiave per la struttura ormonale delle piante avrà anche rilevanza rispetto al problema generale del controllo di eventuali effetti imprevisti della ingegneria genetica delle piante, di notevole importanza per la discussione in corso sulla biosicurezza.
Le piante contengono diversi metalli nei loro tessuti, e quindi sono incapaci di escluderli totalmente, ma reagiscono diminuendone l’assorbimento e/o la traslocazione. I meccanismi di difesa possono essere riassunti come segue: (a) sequestro o complessazione dei metalli con sostanze organiche appositamente prodotte; (b) collocazione in specifici compartimenti cellulari; (c) eliminazione, (d) essudazione di leganti organici. All’interno della cellula, proteine come le ferritine e le metallotionine, e le fitochelatine, partecipano allo stoccaggio di metalli in eccesso e quindi alla detossificazione, Quando questi sistemi sono sovraccaricati vengono attivati meccanismi di difesa allo stress ossidativo. La tossicità relative dei diversi metalli nei riguardi delle piante varia con il genotipo e con le condizioni sperimentali, i metalli che sono considerati generalmente più tossici per le piante e per i microrganismi sono: Hg, Cu, Ni, Pb, Co, Cd ma anche Ag, Be and Sn (Kabata-Pendias and Pendias,1984).
L’acqua è elemento fondamentale per la crescita delle piante e per il mantenimento della struttura delle cellule, delle membrane fosfolipidiche e delle proteine attive al loro interno. Composti chimici che la pianta utilizza per contrastare la disidratazione delle cellule sono prolina, glutammato, glicina-betaina, carnitina, mannitolo, sorbitolo, fruttani, trealosio, saccarosio e oligosaccaridi. Sebbene chimicamente diversi, questi composti impediscono tutti la perdita di acqua mantenendo le proteine preferenzialmente idratate. La glicin-betaina tuttavia è tipica solo delle piante resistenti al freddo e allo stress salino. Questi composti si accumulano all’interno delle cellule, senza venire facilmente metabolizzati e senza provocare alcun danno alla fisiologia della cellula. Il ruolo esatto di queste sostanze non è ben chiaro, ma probabilmente agiscono provocando l’aumento della pressione osmotica interna alla cellule e impedendo la perdita di acqua. In risposta alla disidratazione le piante accumulano questi soluti, sia che la disidratazione sia causata da siccità, freddo o shock osmotico. Altri soluti direttamente correlati allo stress idrico sono malati, citrati, sodio, potassio, cloruri e nitrati. La risposta allo stress idrico è sicuramente diretta dall’azione degli ormoni, che controllano il metabolismo dell’azoto e quindi la disponibilità di sostanze come nitrati, prolina e acido gamma-aminobutirrico. Una prima risposta allo stress idrico da parte della pianta sembra infatti essere l’alterazione dei ritmi di assimilazione, sintesi, utilizzo ed interconversione degli aminoacidi, L’ormone che tra tutti sembra giocare un ruolo chiave nella risposta a stress ambientali è l’acido abscissico (ABA). La sintesi dell’ABA è infatti indotta da mancanza d’acqua e porta alla chiusura degli stomi, e la sua concentrazione è stata osservata aumentare nello xilema in funzione della disponibilità di acqua. In risposta a stress da freddo a cambiare è anche la composizione delle membrane: in particolare il rapporto tra acidi grassi e fosfatidilglicerolo. Come il fosfatidilglicerolo, anche gli acidi grassi insaturi sembrano necessari perché la pianta riesca a sviluppare tolleranza al freddo. Per gli acidi grassi trienoici invece sembra valido il discorso inverso: la loro diminuzione è correlabile ad una maggiore tolleranza alle alte temperature. In generale la tolleranza alle alte temperature viene raggiunta aumentando il livello di acidi grassi con un alto grado di saturazione. Acidi grassi, come gli a-linolenici, possono giocare un ruolo come precursori dello jasmonato, molecola implicata nella risposta a stress ambientali quali ferite, stress salino, ed infezione da patogeni. In alcuni casi la produzione di questi acidi grassi è controllata e diretta dall’azione sinergica di ormoni quali le auxine, le citochinine e l’acido abscissico.
L’azione di stress abiotici su organismi vegetali ha effetto anche sul contenuto di specie metalliche all’interno della pianta. Tali variazioni possono essere differenziate nei vari organi. Ad esempio, concentrazioni intracellulari adeguate di specie metalliche essenziali sono richieste per una crescita ottimale dei vegetali ma anche per la difesa contro gli agenti patogeni o gli stress fisici. Concentrazioni eccessive di tali elementi essenziali, o di micronutrienti possono però avere effetti dannosi, analogamente a quanto avviene in presenza di agenti tossici, come metalli pesanti xenobiotici che non hanno nessun ruolo noto nel metabolismo dei vegetali (cadmio, piombo, mercurio). Gli effetti fitotossici di questi metalli sono legati alla competizione con elementi essenziali, all’inibizione dell’attività enzimatica e all’interferenza nei normali processi metabolici.
Le piante hanno specifici meccanismi omeostatici che permettono loro di resistere, entro certi limiti, ad un eccesso di ioni metallici (Poschenrieder et al., 2006). In particolare, la risposta biochimica delle piante prevede modificazioni negli enzimi, fissaggio dei metalli nelle radici e detossificazione attraverso un’aumentata produzione di sostanze complessanti come fitochelatine, metallotionine e/o acidi organici (Poschenrieder et al., 2006; Candan et al., 2003; Patra et al., 2004). In conseguenza di tali meccanismi di difesa la pianta esplica nuove vie metaboliche diverse da quelle seguite in condizioni normali.
Tutto questo richiede, come condizione indispensabile, la definizione di indicatori organici e inorganici per gli stress ambientali nelle piante, ma sopratutto la messa a punto di metodi analitici innovativi, particolarmente accurati e precisi, per la determinazione di questi indicatori e per la valutazione delle modificazioni metaboliche che vengono indotte dallo specifico stress abiotico.
Per quanto riguarda le metodologie analitiche, sono già stati pubblicati alcuni lavori relativi all’identificazione di un numero limitato di fitormoni e metaboliti organici ed inorganici in organismi normali e modificati geneticamente mediante tecniche GC-MS e HPLC-MS (Pearce 2004; Stephan 1999; Chiwocha et al.,2003; Matamoros Fernandez et al., 2003; Matsuda et al., 2004; Bennett et al., 2004; Zhou et al., 2003; Heyer et al., 2004; Amaral Mdo et al., 2004; Dobrev et al., 2005). Tali metodiche richiedono un’estensione ad altre classi di metaboliti ed un’ottimizzazione dal punto di vista della accuratezza e precisione dei dati ottenuti, in considerazione dei livelli molto bassi di alcuni composti e della necessità di dover apprezzare spesso modeste variazioni nel contenuto relativo dei vari metaboliti.
Molto recentemente, i gruppi di ricerca coinvolti nella presente proposta, hanno condotto una serie di esperimenti su piante di Nicotiana langsdorffii, normali e trasformate con il gene GR del ratto, sottoposte ad esposizione a metalli tossici. I risultati sinora ottenuti, per quanto ancora preliminari, hanno permesso di confermare l'esistenza di drastiche alterazione dei processi di sviluppo e del sistema ormonale nella pianta trasformata e differenze nella risposta a stress rispetto ai controlli e rappresentano una base di partenza indispensabile per poter affrontare l’ulteriore approfondimento di tali problematiche oggetto della presente proposta.
Allo stato attuale non risultano studi sistematici sulla valutazione e comparazione dei meccanismi di difesa di un sistema biologico, costituito da un genotipo di controllo e dallo stesso trasformato con un singolo specifico gene, sottoposto a stress abiotici. La principale difficoltà di tali studi risiede nella disponibilità di un sistema biologico adeguato e nella possibilità di eseguire, sugli stessi campioni, un set integrato di analisi chimiche, bio-molecolari, metaboliche e fisiologiche mediante appropriate procedure analitiche.

Handa S. et al. (1983), Plant Physiol. 73: 834-843.
Kabata-Pendias, A., Pendias, H., 1984. Trace Elements in the Soils and Plants. CRC Press, Boca Raton.
Nisseron S., Chauvette C., Battard J.C., Porthault M (1984), Analusis 12(10): 523-534
Schmulling T, Schell J. (1993), Plant Mol Biol. 21(4):705-8.
Gaudin V, Vrain T, Jouanin L. (1994), Plant Physiol Biochem 32:11– 29.
Motyka V, Faiss M, Strand M, Kaminek M, Schmulling T. (1996), Plant Physiol. 112(3):1035-1043.
Nilsson O, Moritz T, Sundberg B, Sandberg G, Olsson O. (1996), Plant Physiol. 112(2):493-502
Binns AN, Costantino P. (1998). The Agrobacterium oncogenes. In: Spaink H, Kondorosi A, Hooykaas PJJ, editors. The Rhizobiaceae. Dordrecht7 Kluwer Press; 1998. p. 251– 66.
Stephan M. (1999), Plant growth regulation, 28, 55-60
Thomashow M.F.(1999), Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50:571–99.
Meyer A.D., Tempé J., Costantino P. (2000). Hairy root: A molecular overview functional analysis of Agrobacterium rhizogenes T-DNA genes. Plant Microbe Interactions. APS Press, St. Paul.
Browse J., Xin Z. (2001), Current Opinion in Plant Biology 4:241–246.
Hoekstra F.A., Golovina E.A., Buitink J. (2001), Trends in Plant Science 6(9): 431-438.
Intrieri MC, Buiatti M. (2001), Mol Phylogenet Evol. 20(1):100-10.
Kakimoto T. (2001), Plant Cell Physiol. 42(7):677-85.
Takei K., Sakakibara H, Sugiyama T. (2001), J Biol Chem. 276(28):26405-10.
Iba K. (2002), Annu. Rev. Plant Biol. 53:225-245.
Munns R. (2002), Plant, Cell and Environment 25: 239-250.
Wilkinson S., Davies W.J. (2002), Plant, Cell and Environment 25,195–210.
Bettini P, Michelotti S, Bindi D, Giannini R, Capuana M, Buiatti M. (2003), Theor Appl Genet. 107(5):831-6.
Candan N., Tarhan L., Plant Science, 165 (2003) 769-776
Chiwocha S.D., Abrams S.R., Ambrose S.J., Cutler A.J., Loewen M., Ross A.R., Kermode A.R. (2003), Plant J., 35: 405-417
Irdani T., Caroppo S:, Ambrogioni L., (2003), Redia, 86: 35-38
Matamoros Fernandez L.E., Obel N., Scheller H.V., Roepstorff P. (2003), J Mass Spectrom., 38: 427-437
Zhou R., Squires T.M., Ambrose S.J., Abrams S.R., Ross A.R., Cutler A.J. (2003), J. Chromatogr. A., 1010: 75-85
Amaral Mdo C., Faria A.D., Magalhaes A.F., Magalhaes E.G., Ruiz A.L. (2004), Phytochem Anal., 15: 125-129
Bennett R.N., Mellon F.A., Rosa E.A., Perkins L., Kroon P.A.(2004), J. Agric. Food Chem., 52: 5856-62
Heyer J., Parker B., Becker D., Ruffino J., Fordyce A., De Witt M., Bedard M., Grebenok R. (2004), Phytochemistry 65: 2967-2976
Matsuda F., Morino K., Miyazawa H., Miyashita M., Miyagawa H. (2004), Phytochem. Anal., 15: 121-124
Patra M., Bhowmikb N., Bandopadhyay B., Sharma A. (2004), Environ. Experim. Botany 52, 199-223
Pearce D.W. (2004), J. Chromatogr. A 658, 91-98
Gusta L.V., Trischuk R., Weiser C.J. (2005), J Plant Growth Regul 24:308–318.
Dobrev P.I., M. Kaminek (2005), Journal of Chromatography A, 1075 159-166
Mauch-Mani B., Mauch F. (2005), Curr Opin Plant Biol. 8(4):409-14.
HongBo et al., (2006), Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 47:132–139.
Poschenrieder C., Tolra R., Barcelò I. (2006), Trends in Plant Science 11, 288-295 <<<