RICERCA ITALIANA     

Ruolo fisiopatologico di poli(ADPR)polimerasi (PARP) e sue implicazioni terapeutiche.

Università degli Studi di Napoli "Federico II"

Abstract

L’organizzazione di una rete nazionale di unità di ricerca interessate allo studio della poli(ADP-ribosilazione) potrà migliorare il loro contributo alla comprensione, delle implicazioni fisio-patologiche della reazione di poli(ADP-ribosilazione). La natura pleiotropica dei processi biologici e dei meccanismi in cui la poli(ADPribosilazione) é coinvolta richiede approcci multidisciplinari che derivano da azioni congiunte di diversi gruppi di ricerca. I gruppi di ricerca partecipanti a questo progetto nazionale hanno una riconosciuta esperienza nei settori della biochimica, biologia molecolare e farmacologia che si affiancherà nello svolgimento del progetto sia per quanto riguarda le metodologie sperimentali che la conoscenze scientifiche. Tramite un’azione sinergica verranno analizzati i meccanismi con cui le poli(ADP-ribosio)polimerasi (PARP-1, PARP-2) e la poli(ADP-ribosio)glicoidrolasi (PARG) agiscono nella segnalazione del danno al DNA e nella modulazione della trascrizione genica, utilizzando metodologie innovative (RNAi, microarray di DNA e proteine, proteomica, risonanza plasmonica di superficie) che sono in uso nei diversi laboratori. Inoltre, il progetto prevede lo studio del coinvolgimento di PARP-1 nell’angiogenesi tumorale e nella crescita e progressione del tumore nonché lo studio del potenziale uso degli inibitori di PARP in combinazione inibitori dell’angiogenesi e chemioterapici.
Infine, le singole unità hanno allo studio diverse patologie (cancro, asma, diabete) in cui PARPs e PARG risultano essere coinvolte ed in cui si verificherà l’efficacia terapeutica dell’inibizione degli enzimi sia per via farmacologica che per genetica inversa. Gli sforzi coordinati di tutti i partecipanti aumenterà la possibilità di successo del progetto nel disegnare nuovi e mirati approcci terapeutici. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Pierina Maria Quesada Università degli Studi di NAPOLI "Federico II"

Obiettivo del Programma di Ricerca

I principali obiettivi della ricerca qui proposta sono: 1) la comprensione a livello molecolare delle implicazioni fisio-patologiche della reazione di poli(ADP-ribosilazione); 2) la definizione del potenziale ruolo della inibizione delle poli(ADP-ribosio)polimerasi 1 e 2 (PARPs) della poli(ADP-ribosio)glicoidrolasi (PARG) in diverse strategie terapeutiche.
Le PARPs e la PARG, grazie alla versatilità del loro meccanismo d’azione ed in modo concertato, svolgono un ruolo pleiotropico sia come segnalatori dei livelli di lesione del DNA a effettori a valle, sia come modulatori dell’espressione genica in risposta a specifici segnali cellulari. Verrà quindi preso in esame il ruolo di tali enzimi come componenti dei macchinari enzimatici adibiti alla riparazione del DNA, e dei complessi promotori/enhancer adibiti alla regolazione della trascrizione. Inoltre, il coinvolgimento di PARPs e PARG nell’infiammazione é stato descritto in numerosi studi ma non é ancora chiaro il meccanismo molecolare che vi sottende, mentre l’uso di inibitori di PARP-1 come adiuvanti chemioterapici é ormai in fase preclinica per certe combinazioni di farmaci. Ci si propone quindi di approfondire il ruolo della poli(ADP-ribosilazione) in situazioni di stress genotossico e patologie infiammatorie quali asma e diabete. In particolare nelle patologie cancro, diabete, asma, già oggetto di studio dei singoli gruppi, si valuterà l’efficacia terapeutica dell’inibizione per via farmacologica o mediante genetica inversa (RNAi) di PARP(s) e PARG. Un obiettivo d’avanguardia può essere considerato quello di studiare il coinvolgimento di PARP-1 nell’angiogenesi associata al tumore e di esplorare il potenziale uso terapeutico di inibitori di PARP-1 in combinazione con agenti anti-angiogenici e chemioterapici.
L’insieme di tali informazioni rappresentano l’obiettivo finale del progetto poiché contribuirà ad ideare nuove strategie terapeutiche. <<<

Risultati parziali attesi

L'obiettivo finale comune é rappresentato dallo sviluppo di strategie preventive o terapeutiche che si basino sulla regolazione dell'azione degli enzimi poli(ADP-ribosilanti). Gli sforzi comuni saranno diretti alla definizione dell'efficacia terapeutica dell'inibizione di PARP in patologie quali il cancro, l'asma ed il diabete.
Ci si aspetta di ottenere un avanzamento delle conoscenze circa:
•il chemiopotenziamento da inibizione/silenziamento di PARP/PARG di farmaci citotossici in cellule di melanoma, glioma e seminoma;
•il ruolo di PARP-1 nell’angiogenesi associata al tumore e nella crescita e progressione tumorale;
•il potenziamento da inibizione/silenziamento di PARP dell'azione anti-tumorale di composti anti-angiogenici;
•il ruolo predittivo di PARP-1 nel diabete di tipo 2;
•il ruolo di inibitori di PARP-1 nell'attivazione trascrizionale e nell'espressione genica correlate all'insorgenza dell'asma. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Negli ultimi anni é stato indirizzato un crescente interesse allo studio della reazione di poli(ADP-ribosilazione) allo scopo di spiegare il ruolo fisio-patologico degli enzimi poli(ADPR)polimerasi (PARPs) e poli(ADPR)glicoidrolasi (PARG) e la potenzialità della loro modulazione in diverse strategie preventive e terapeutiche. Le conoscenze più recenti e rilevanti nel campo sono riportate nel libro edito da Burkle A. 2006 per Landes-Bioscience, col contributo di gruppi di ricerca di differenti paesi.
In breve, la super-famiglia di enzimi PARP comprende ad oggi 17 membri e ciò indica un alto livello di complessità nella definizione del sistema di poli(ADP-ribosilazione) delle proteine. Tuttavia, tutti gli enzimi PARP condividono le principali caratteristiche catalitiche, quali il substrato beta-NAD, il prodotto poli(ADP-ribosio) (PAR), mentre può differire la natura delle proteine accettrici (le PARPs stesse, istoni, enzimi nucleari, fattori di trascrizione etc). Le due forme di PARP meglio caratterizzate, PARP-1 e PARP-2, co-operano in vie di segnalazione tramite diversi meccanismi d’azione: 1) modificazione covalente delle proteine accettrici; 2) interazione non-covalente del PAR legato alle PARPs con proteine bersaglio; 3) coinvolgimento in complessi multi-proteici.
Tramite uno o più di questi meccanismi d’azione le PARPs giocano un ruolo come regolatori chiave della riparazione e trascrizione del DNA. Ad esempio, é stato dimostrato il loro coinvolgimento nella riparazione del DNA per escissione di basi (BER) o di nucleotidi (NER).
Inoltre, PARP-1 può avere effetti sia positivi che negativi in processi di trans-attivazione a seconda del partner considerato (p53, AP1, YY-1 e Oct-1) e agisce da co-fattore nel sistema mediato da NF-kB .
La poli(ADP-ribosio) glicoidrolasi (PARG) é il principale enzima responsabile del catabolismo del PAR.
E’ stato proposto un ruolo pleiotropico di PARP(s) e PARG in risposta allo stress genotossico, essendo stato dimostrato che entrambi gli enzimi agiscono sia da fattori di sopravvivenza nella segnalazione di bassi livelli di danno al DNA ad effettori a valle, sia come fattori pro-apoptotici in caso di lesioni irrecuperabili.
E’ sempre più chiaro che la regolazione della poli(ADP-ribosilazione) contribuisce ad un vasto numero di funzioni cellulari e che PARPs e PARG devono essere considerati enzimi multifunzionali. Alterazioni del metabolismo del PAR mediante inibitori o per silenziamento genico hanno chiarito ulteriormente le funzioni della poli(ADP-ribosilazione) ed hanno fornito l’interessante prospettiva dell’uso degli inibitori in diverse patologie umane. Tuttavia i meccanismi che sottendo gli effetti terapeutici osservati sopprimendo l’attività di PARP(s) e PARG non sono stati ancora chiariti.

Una più dettagliata analisi della base di partenza scientifica del progetto é riportata nelle singole proposte delle diverse unità, in relazione agli specifici interessi scientifici.
Segue l’illustrazione del contributo alle conoscenze dovuto al precedente lavoro dei partecipanti a questo progetto, che rappresenterà una base di scambio culturale fondamentale ad un’azione concertata.

I componenti dell’Unità I hanno una consolidata esperienza biochimica nell’ambito di ricerca ed hanno contribuito alla definizione di alcune delle caratteristiche della reazione enzimatica. I principali risultati ottenuti in precedenza riguardano gli studi sui livelli e la localizzazione cellulare di PARPs e PARG e la caratterizzazione delle proteine accettrici di PAR: in particolare hanno portato alla identificazione delle prime proteine bersaglio della interazione non-covalente col PAR.
La maggior parte dei risultati sono stati ottenuti nel sistema di cellule germinali maschili dove elevati livelli di PARP-1, PARP-2 e PARG sono funzionalmente legati alla fase di pachitene della divisione meiotica durante la spermatogenesi e richiesti per la riparazione di lesioni al DNA indotta da agenti genotossici (ipertermia, radiazioni-gamma, radicali ossigeno). Le cellule germinali sono risultate un utile sistema per la definizione degli specifici ruoli di PARP1, PARP2. Sebbene sia riportato che, PARP-1 and PARP-2 sono entrambe coinvolte nella segnalazione del DNA danneggiato, il loro contributo relativo a tale processo rimane sconosciuto, per la mancanza di inibitori isoforma- specifici che precludono studi in vivo.
L’insieme di tali evidenze sono in accordo col ruolo proposto per il poli(ADP-ribosio) nella via di segnalazione del DNA danneggiato. Inoltre, un recente lavoro sulla protezione da shock ossidativo (H2O2) osservata in seguito a silenziamento di PARG per siRNA ci spinge a proseguire con l’uso di tale innovativo metodo di analisi.
Tali conoscenze hanno stimolato la collaborazione del gruppo biochimico con oncologi volta alla definizione del potenziale uso di inibitori di PARP(s) come adiuvanti chemioterapici in diversi tipi di cellule tumorali. E’ stato dimostrato il coinvolgimento di PARP-1 nel ripristino dell’apoptosi in cellule di carcinoma KB trattate con IFN-alfa. Altri risultati sono a favore della segnalazione da parte di PARP(s) del danno al DNA derivante dall’inibizione della DNA topoisomerasi I (TOPO I) in cellule di glioblastoma che sono in accordo con la recente pubblicazione che dimostra come PARP-1 e -2 cooperino nel segnalare il danno al DNA derivante dalla inibizione della TOPO I.
L’insieme di tali risultati rappresenteranno la base di collaborazioni future con altre unità di ricerca, relativamente ad interessi scientifici condivisi

La responsabile scientifica dell’Unità II ha dato un notevole contributo alla conoscenza dei meccanismi coinvolti negli effetti apoptotici e antiproliferativi del metilante temozolomide (TMZ), un farmaco antitumorale di notevole interesse clinico utilizzato di recente per il trattamento dei tumori recidivanti del SNC, e allo sviluppo di strategie terapeutiche per superare la resistenza a questo composto. In questo settore il gruppo ha fornito la prima evidenza preclinica in modelli sperimentali in vivo che gli inibitori di PARP possono aumentare l’efficacia della TMZ nei confronti di tumori primari e secondari. In particolare, il trattamento per via orale, endovenosa o intracerebrale con potenti inibitori di PARP in associazione a TMZ ha aumentato la sopravvivenza, rispetto al trattamento con la sola TMZ, di topi con glioblastoma multiforme, melanoma o linfoma a localizzazione cerebrale. Inoltre, la somministrazione per via sistemica di inibitore di PARP e TMZ ha ridotto la diffusione metastatica del melanoma al polmone. Il suo gruppo ha, inoltre, dimostrato che la somministrazione orale di un inibitore di PARP aumenta l’attività antitumorale della TMZ usata in combinazione con l’inibitore di TOPO I irinotecano (CPT-11) in modelli di xenotrapianto di carcinoma del colon. È interessante notare che l’inibizione di PARP non aumenta la tossicità dei chemioterapici verso i tessuti normali, ma riduce la gravità degli effetti avversi. Inoltre, ha osservato che l’inibizione di PARG può portare ad un aumento della chemiosensibilità dei tumori alla TMZ; infatti il trattamento con inibitore di PARG in associazione a TMZ ha ridotto in maniera significativa la crescita del melanoma, ha aumentato la sopravvivenza degli animali portatori di melanoma a livello del SNC e diminuito la capacità delle cellule del melanoma di formare metastasi polmonari. Recentemente, il suo gruppo ha dimostrato il coinvolgimento diretto di PARP-1 nell’angiogenesi utilizzando modelli “in vivo”. In particolare, in topi “knock-out” per PARP-1 si è osservata una riduzione della neo-formazione di vasi in risposta a stimoli angiogenici. Tale effetto era di entità simile a quello osservato in topi di controllo in presenza di inibitore di PARP. Da tali studi consegue che il responsabile scientifico di tale unità di ricerca ed il suo gruppo possiedono una notevole esperienza nel campo della ricerca preclinica in campo oncologico e degli inibitori di PARP. Tale expertise insieme al recente interesse per l’angiogenesi, dimostrato anche dalla generazione di una linea cellulare endoteliale umana immortalizzata, garantirà la realizzazione del progetto di ricerca proposto sul coinvolgimento di PARP-1 nell’angiogenesi tumorale e crescita e progressione del tumore nonché sul potenziale uso degli inibitori di PARP in combinazione a inibitori dell’angiogenesi e chemioterapici

La ricerca della responsabile scientifica dell’Unità III ha riguardato il coinvolgimento del processo di poli(ADP-ribosilazione) in differenti strutture ed eventi cellulari. In collaborazione con l’Unità I l’attenzione è stata in passato rivolta allo studio della localizzazione e della distribuzione delle proteine poli(ADP-ribosil)ate e dell’enzima PARP-1 nella matrice nucleare. Inoltre, è stata anche studiata l’influenza delle varianti dell’istone H1 e delle sue isoforme poli(ADP-ribosil)ate sulla metilazione del DNA. E’ stato anche dimostrato che in nuclei isolati, a seguito dell’inibizione della PARP il DNA è maggiormente sensibile all’azione della DNA metiltransferasi, indicando l’esistenza di una possibile regolazione negativa tra la poli(ADP-ribosil)azione e la metilazione del DNA.
Un ulteriore aspetto della ricerca è stato indirizzato allo studio dell’effetto della poli(ADP-ribosil)azione sulla struttura della cromatina mediante synchrotrone X-ray scattering (in collaborazione col Dr. M. Koch EMBL outstation in Hamburgh) e mediante Atomic Force Microsopy (in collaborazione col Prof. Carlos Bustamante, Univ. of Berkeley).
Più recentemente i componenti di questa unità sono impegnati in un progetto sull’influenza della poli(ADP-ribosil)azione sull’espressione dei geni del virus di EBV e stanno studiando il ruolo della PARP-1 in cellule mononucleate circolanti (MNC) ottenute da pazienti affetti da diabete di tipo 2. I dati ottenuti hanno dimostrato che, mentre si osserva un aumento del mRNA per PARP-1, i livelli e l’attività di tale enzima sono significativamente più bassi nei pazienti diabetici; risultati che sono stati correlati all’aumentata attività della caspasi-3.

La precedente ricerca dell’Unità IV ha riguardato lo studio delle interazioni tra PARP-1 ed i componenti delle vie di trasduzione di segnali infiammatori che portano all’attivazione della trascrizione e all’espressione genica. Tra questi, hanno proposto che STAT1 possa essere un bersaglio più promettente di NF-kB in quanto esso media l’azione di una sola citochina, l’IFN-gamma, con il coinvolgimento di un minor numero di eventi molecolari. Inoltre hanno pubblicato che l’estratto da tè verde, il principale polifenolo presente in esso, l’EGCG, e l’estratto da iperico perforatum esercitano una potente e specifica azione inibitoria in un grande numero di linee cellulari sull’attivazione di STAT-1 indotta da IFN-gamma mediante inibizione della fosforilazione in tirosina di STAT-1. Più recentemente, in diversi modelli animali, hanno osservato che alcuni di questi composti proteggono dai danni tissutali correlati a processi infiammatori come nel danno cardiaco dopo ipertrofia e riperfusione e nell’asma. D’altra parte, un loro lavoro mostra che PARP-1 e il fattore trascrizionale p53 vengono co-espressi in linfomi di tipo B mentre studi in vivo dimostrano che PARP-1 è capace di legarsi in modo specifico ad una sequenza del promotore del gene REG in un sistema murino di pleurite indotta da carragenina. Da studi sia in vitro che in vivo essi suggeriscono che PARP-1 possa legarsi a specifiche sequenze del DNA e che questo legame sia negativamente correlato all’attività di auto poli(ADP-ribosilazione).
Infine risultati recenti dimostrano che inibitori di PARP-1 diminuiscono i sintomi in un modello acuto di asma sulle cavie suggerendo che PARP-1 possa essere coinvolta nella patogenesi di questa malattia. <<<