RICERCA ITALIANA     

TECNICHE AVANZATE DI IMAGING MOLECOLARE ED INGEGNERIA GENETICA PER LO STUDIO DELLA DISTRIBUZIONE E DELLA DINAMICA DEL MAGNESIO CELLULARE: NUOVI APPROCCI PER ASSOCIARE LA OMEOSTASI DEL MAGNESIO CON LE FUNZIONI CELLULARI.

Università Cattolica del Sacro Cuore

Abstract

Il magnesio è un importante cofattore di molte attività enzimatiche ed è essenziale nelle funzioni cellulari vitali quali sintesi di DNA e sintesi proteica. Diverse rilevanti patologie umane sono associate a una diminuzione di magnesio tissutale e/o sistemico, e in alcune malattie cardiovascolari e in particolare nei traumi cerebrali la supplementazione di magnesio viene utilizzata di routine come supporto terapeutico. Nonostante la molteplicità di dati scientifici e clinici riguardo l’importanza di questo catione nelle principali funzioni cellulari, i meccanismi della sua omeostasi cellulare sono ancora alquanto oscuri. Le principali carenze conoscitive riguardano principalmente i meccanismi di trasporto e il significato funzionale della compartimentalizzazione sub cellulare. Tali limitazioni conoscitive sono dovute sia alla mancanza di una adeguata caratterizzazione molecolare dei trasportatori del magnesio che alla scarsa disponibilità di approcci metodologici per misurare con elevata specificità e sensibilità i movimenti di magnesio intracellulare.
Il presente progetto è finalizzato allo sviluppo di nuovi approcci metodologici per lo studio della distribuzione intracellulare di magnesio combinando tecniche avanzate di imaging molecolare con la biologia molecolare e la ingegneria genetica. In particolare si intende studiare la applicazione di una nuova classe di fluorocromi (DCHQ) derivati dalla 8-idrossichinolina, caratterizzati da alta affinità e specificità per il magnesio che sono in grado di misurare il contenuto intracellulare di magnesio e che possono essere applicati a studi di "live cell imaging" per mappare la distribuzione intracellulare di magnesio ed evidenziare movimenti transienti di magnesio intracellulare con la microscopia confocale a due fotoni. Intendiamo allargare lo studio anche ad altri derivati della famiglia DCHQ aventi caratteristiche fotochimiche e biologiche ulteriormente perfezionate per la mappatura intracellulare del magnesio. Inoltre estenderemo l’applicazione dei fluorocromi DCHQ alla determinazione del magnesio totale intracellulare delle cellule del sangue in uno studio clinico controllato effettuato con la spettroscopia di risonanza magnetica in vivo e finalizzato alla valutazione della distribuzione tissutale del magnesio in una patologia caratterizzata da malassorbimento intestinale (IICB).
Un ulteriore approccio consiste nell'applicazione allo studio del magnesio di tecniche avanzate di imaging a raggi-X che consentono una straordinaria risoluzione spaziale dell'ordine di poche centinaia di nm, e che permetteranno di evidenziare sia la distribuzione del magnesio che la ripartizione intracellulare dei diversi stati di ossidazione del magnesio con una accuratezza senza precedenti.
Lo studio della omeostasi del magnesio sarà eseguito in: a) diverse linee cellulari in condizioni basali; b) cellule opportunamente stimolate; c) cellule adattate a crescere in mezzi ad alto e basso contenuto di magnesio e d) cellule ingegnerizzate per l'espressione dei canali della famiglia dei TRPM (7 e 6) che sono responsabili dell'influsso del magnesio all'interno delle cellule.
La probabilità di successo di questo progetto è favorita dalla complementarietà e interdipendenza delle competenze delle quattro UR, che interessano la biochimica, la risonanza magnetica nucleare in vivo, la fluorimetria, la biologia cellulare, metodiche analitiche di misurazione del magnesio, il “live cell imaging”, la biologia e genetica molecolare, la fisica della materia e le nanotecnologie. Inoltre, tre delle quattro UR impegnate in questo progetto hanno esperienza pluriennale nello studio di diversi aspetti del magnesio cellulare, e la pregressa nonché consolidata collaborazione tra questi gruppi testimonia la funzionalità reciproca delle loro competenze. Il contributo della UR del CNR infine, sarà decisiva per l'applicazione allo studio del magnesio di tecniche all'avanguardia di imaging a raggi-X, che solo di recente hanno trovato una applicazione nella biologia cellulare e che rappresentano una nuova frontiera nello studio della topografia cellulare. Riteniamo che questo progetto potrà dare un contributo di altissimo livello allo sviluppo delle ricerche e all’ampliamento delle conoscenze su un catione come il magnesio che, sebbene così importante, è ancora talmente poco conosciuto da meritarsi l’appellativo di “ione dimenticato”. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Federica Wolf Università Cattolica del Sacro Cuore

Obiettivo del Programma di Ricerca

Lo studio della omeostasi cellulare del magnesio, viste le sue caratteristiche chimiche e biologiche (concentrazione, idratazione, binding a diverse specie molecolari), implica la necessità di poter analizzare contemporaneamente, o in parallelo i diversi pools intracellulari (libero/legato, compartimentalizzato o citosolico). Ciò necessita lo sviluppo di approcci investigativi sofisticati che sono oggi resi possibili dalle tecniche avanzate di imaging, come quelle proposte in questo progetto.
Il progetto ha quindi come obiettivo finale quello di contribuire ad una conoscenza più approfondita della distribuzione e dei movimenti del magnesio cellulare al fine di correlare la omeostasi cellulare del magnesio con le sue funzioni biologiche.
A tale scopo si intendono sviluppare nuove tecniche di imaging molecolare per lo studio del magnesio cellulare consistenti in:

- una nuova classe di sonde fluorescenti caratterizzate da alta affinità e selettività per il magnesio da applicare a tecniche di citofluorimetria e live cell imaging. L’alta sensibilità dei metodi fluorimetrici presenta infatti il notevole vantaggio di permettere di analizzare quantità di materiale estremamente ridotta, al contrario delle metodiche classiche utilizzate per la determinazione di questi ioni, prima tra tutte l’assorbimento atomico. Inoltre l’approccio citofluorimetrico e di microfotometria di fluorescenza permette di lavorare su campioni non omogenei, purchè siano applicabili controcolorazioni selettive, come l’utilizzo di anticorpi specifici per le diverse sottopopolazioni cellulari, in modo da potere identificare le cellule di interesse senza dovere procedere alla purificazione e quindi ad una manipolazione del campione. Questo può portare a sviluppare una metodologia che porti sia ad estendere le conoscenze di base della biologia cellulare del magnesio che avere una applicazione di tipo diagnostico su larga scala.


Per correlare il magnesio cellulare con le funzioni biologiche si intendono utilizzare diversi tipi cellulari:
1) cellule adattate a proliferare in un mezzo contenente alto o basso magnesio,
2) cellule geneticamente modificate per i trasportatori del magnesio (TRPM6 e 7).
3) cellule del sangue circolante di pazienti affetti da Insufficienza Intestinale Cronica Benigna (IICB) e soggetti normali comparabili per età e sesso.
Questi modelli, caratterizzati in diverso modo da modificazioni della omeostasi cellulare, forniranno specifiche informazioni che permetteranno di interpretare i meccanismi della omeostasi cellulare di questo catione.
Inoltre si prevede di portare avanti uno studio dell’omeostasi tissutale del magnesio misurando in vivo e in vitro con diverse tecniche spettroscopiche, tra cui 31P-MRS, le concentrazioni di magnesio in diversi tessuti. Infatti correlando i dati così acquisiti si potranno ottenere importanti informazioni sui meccanismi di regolazione nei diversi tessuti utilizzabili nella valutazione degli scompensi a carico di questo ione.
In conclusione, le attività svolte dalle diverse UR, caratterizzate da competenze complementari, che spaziano dalla fisica della materia e biochimica fino alla biologia e genetica molecolare, oltre all'esperienza consolidata nello studio del magnesio, consentiranno di mettere a punto, per la prima volta in Italia, un sistema coerente di protocolli sperimentali di imaging molecolare, alcuni dei quali ad altissima risoluzione spaziale fino a poche centinaia di nm, per la determinazione della distribuzione spaziale intracellulare di elementi essenziali alle funzioni della cellula, portando un contributo metodologico e cognitivo di avanguardia. Inoltre il chiarimento del suo meccanismo d’azione a livello cellulare e tissutale e della sua omeostasi potrà rendere un approccio terapeutico e di prevenzione più mirato. <<<

Risultati parziali attesi

I risultati attesi da questo progetto di ricerca riguardano diversi aspetti dello studio e della valutazione del magnesio a livello cellulare utilizzando tecnologie di imaging molecolare associate ad ingegneria genetica, che dovrebbero dare un contributo fondamentale alla interpretazione dei molti lati oscuri della sua omeostasi cellulare. In particolare:

1) DOSAGGIO DEL MAGNESIO. Utilità e vantaggi forniti dalle sonde fluorescenti della famiglia dei DCHQ per la valutazione quantitativa del magnesio cellulare. La alta specificità e selettività di queste sonde fa presupporre che esse possano essere utilizzate in alternativa alla spettrometria ad assorbimento atomico per la quantificazione del magnesio cellulare in campioni biologici, sopratutto nel caso che questi consistano in quantità minime di cellule o tessuti. In particolare ciò sarà verificato in uno studio caso-controllo di insufficienza intestinale cronica benigna (IICB) associando questo nuovo metodo con il classico assorbimento atomico e correlando i risultati con la valutazione del magnesio ionizzato nel muscolo e nel cervello tramite risonanza megnatica nucleare. Se la validità del metodo proposto verrà confermata dallo studio previsto in questo progetto, si sarà ottenuto uno strumento di grande rilevanza applicativa nel campo delle indagini diagnostiche proprie della biochimica clinica. In pratica, si potrebbe realizzare un analisi del contenuto di magnesio delle varie cellule del sangue con pochi cc di campione, in maniera rapida e con un protocollo di facile esecuzione.

2) DISTRIBUZIONE SUBCELLULARE. Applicabilità di alcuni derivati delle sonde DCHQ per la misura della distribuzione del magnesio a livello sub-cellulare con tecniche di imaging (confocale con sorgente a due fotoni, eventualmento abbinato a indagini più specifiche quali FLIM e FRAP). Le sonde in questione sembrano in grado di mappare con molta sensibilità zone specifiche della cellula. Questa mappatura, se confermata da ulteriori studi previsti dal progetto, tra i quali l'applicazione delle tecniche di imaging a raggi-X, potrebbero descrivere per la prima volta la reale distribuzione del magnesio cellulare, identificando "pools" intracellulari correlabili al loro significato funzionale.

3) STUDI CINETICI Utilizzo di alcuni derivati delle sonde DCHQ per lo studio dei flussi di magnesio con tecniche di live cell imaging. In particolare, la sonda esterificata che rimane intrappolata nel citoplasma dovrebbe essere sufficientemente sensibile e specifica da misurare fluttuazioni del magnesio cellulare indotte da stimoli specifici, quali sostanze che interferiscono con l'attività mitocondriale, stimoli mitogenici o stimoli apoptotici. Una conferma e una più specifica caratterizzazione di queste fluttuazioni di magnesio ssarebbe essenziale per confermare le poche osservazioni disponibili in letteratura e per chiarire il meccanismo con cui il magnesio influenza importati funzioni biologiche come attivazione, proliferazione, e morte cellulare.

4) TRASPORTO CELLULARE DEL MAGNESIO Il ruolo della espressione dei trasportatori specifici del magnesio quali TRPM7 o 6 e Na/Mg antiporter in alcuni modelli cellulari quali epitelio mammario e cellule endoteliali. Effetti sulla funzionalità cellulare. Correlazione diretta tra espressione dei trasportatori e flussi di magnesio, utilizzando le linee cellulari con alterata espressione dei trasportatori gia disponibili (UR Roma: HC11 Low e High) o da selezionare con modificazioni della espressione genica (UR Milano: HUVEC ingegnerizzate)

5) DISFUNZIONE ENDOTELIALE. Utilizzazione delle cellule endoteliali geneticamente modificate per lo studio dei meccanismi responsabili della disfunzione endoteliale indotta da carenza di magnesio precedentemente descritta dalla UR di Milano.

6) APPLICAZIONE DI TECNICHE DI IMAGING A RAGGI-X. Per quanto riguarda le tecniche di microfluorescenza e microimaging, i risultati attesi sono duplici: da un lato la messa a punto di protocolli sperimentali e di analisi dati per il problema generale della localizzazione, della quantificazione e dello stato di ossidazione di elementi nell'ambiente cellulare, e dall'altro lo specifico problema della localizzazione sub-cellulare del Mg. L’utilizzo di diverse tecniche (microfluorescenza, microimaging e assorbimento differenziale utilizzando sia un microscopio a raggi X, sia una geometria “lens-less) , consentirà il confronto tra le diverse tecniche ed una comprensione più approfondita delle loro effettive possibilità im imaging cellulare ad alta risoluzione spaziale. Il fatto che queste siano tecniche emergenti, ancora poco utilizzate ma sicuramente di elevata potenzialità, richiede una validazione con tecniche complementari, come appunto previsto in questo progetto. Il successo di questo approccio consentirà di far conoscere queste tecniche nell’ambito di una comunità scientifica più vasta, e di applicare i protocolli messi a punto nel progetto ad altre problematiche molto attuali (basti pensare allo studio dell’interazione delle nano-particelle con l’ambiente cellulare), sia in ambito bio-medico, che in altri campi scientifici quali ad es. problemi ambientali, studio e conservazione di beni culturali, paleontologia, scienza e ingegneria dei materiali, nanoscienze, ecc. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il magnesio è un importante catione bivalente intracellulare coinvolto in una vasta gamma di reazioni biochimiche (cofattore in più di 300 attività enzimatiche) e di importanti funzioni biologiche (impulso nervoso, contrazione muscolare, sintesi di DNA e proteine, metabolismo energetico). Malgrado la sua abbondanza (concentrazione millimolare nei tessuti), esistono diverse importanti patologie umane quali malattie cardiovascolari, diabete e sindrome metabolica e alcune malattie neurologiche, caratterizzate da una carenza di magnesio, in alcuni casi tessuto-specifica, in altri sistemica. Recenti studi mostrano specifiche modificazioni ioniche a livello cellulare in pazienti con ipertensione essenziale (Kosch,2001). In ratti caratterizzati da ipertensione essenziale si osserva una diminuzione del magnesio nelle cellule muscolari lisce e una supplementazione di Mg nella dieta ritarda l'insorgenza e la gravità della patologia ipertensiva (Touyz,1999). In pazienti con malattia coronarica la terapia con supplementazione di Mg migliora la funzionalità endoteliale valutata come vasodilatazione endotelio-mediata della arteria brachiale (Shechter,2000). A conferma di queste osservazioni alcuni dati suggeriscono che diete ricche in K, Mg e Ca, ma non Na, sarebbero in grado di ridurre la pressione ed il rischio di episodi ischemici (Massey,2001). Nel paziente diabetico si riscontra spesso una tendenza alla deficienza di magnesio (Valk,1999) imputabile all'aumentata escrezione di magnesio indotta dalla iperglicemia (Djurhuus, 2000), ma anche il trasporto di glucosio mediato dall'insulina è legato al trasporto e alla disponibilità di magnesio (Romani,2000; Barbagallo,2001). Il magnesio riveste un ruolo particolarmente importante nel danno neuronale come antagonista dei recettori per il glutammato. Diversi studi descrivono l'effetto protettivo della supplementazione di magnesio per prevenire fenomeni degenerativi neuronali (Turkyilmaz, 2002; Lin, 2004)e la risonanza magnetica in vivo ha dimostrato che alcune malattie neurologiche sono caratterizzate da diminuzione di disponibilità di magnesio nel tessuto nervoso (Lodi, 2001). L’endotelio, tessuto molto sensibile alle variazioni di magnesio rappresenta un modello di studio molto interessante per le sue svariate funzioni (controllo dell’emostasi, del tono vascolare della proliferazione delle cellule muscolari lisce della tonaca media), tanto che la disfunzione endoteliale è un momento patogenetico rilevante in numerose condizioni patologiche sopra-descritte (aterosclerosi, ipertensione, diabete e trombosi). Data la loro localizzazione strategica all’interfaccia tra sangue e tessuti, le cellule endoteliali sono continuamente esposte a fattori meccanici, microbi e a varie molecole tra cui citochine, metaboliti, ioni, che possono influenzare la funzionalità cellulare. Tra questi un’attenzione particolare merita il magnesio che risulta essere deficitario nei paesi occidentali in quanto studi in vitro indicano che le cellule endoteliali sono sensibili al magnesio. Basso Mg inibisce la crescita e la migrazione di cellule endoteliali umane e murine sia micro- sia macrovascolari, stimola l’adesione dei monociti, modula la sintesi di citochine infiammatorie e induce la sintesi di molecole pro-coagulanti inibendo quella di anticoagulanti, eventi cruciali nell’aterosclerosi e nelle sue complicanze (Maier,2003,2004). È stato anche dimostrato che la carenza di Mg rende le cellule endoteliali più sensibili allo stress ossidativo per compromissione dei sistemi scavenger (es.GSH).
A fronte di tanti dati che correlano il metabolismo del magnesio con diverse condizioni patologiche le conoscenze sulla sua omeostasi cellulare sono frammentarie e incomplete. Sebbene il gradiente di concentrazione intra/extracellulare di magnesio non sia molto elevato, evidenze biochimiche e molecolari suggeriscono la presenza di meccanismi specifici di controllo dell'influsso e dell'efflusso di magnesio a livello delle membrane e la possibilità che il magnesio sia compartimentalizzato all'interno della cellula. In particolare, l'efflusso è regolato da un antiporto che scambia primariamente Na/Mg, mentre l'influsso è regolato da alcuni tipi di canali ionici della famiglia dei TRPM (Transient Receptor Potential Melastatin 6 e 7) che presentano la peculiarità di possedere una attività chinasica nel dominio citoplasmatico ( "chanzymes") (Cahalan, 2001; Takezawa,2004; Wolf,2004). Recenti studi hanno infatti caratterizzato dal punto di vista molecolare questi canali e hanno mostrato che in cellule geneticamente modificate per i TRPM7, la proliferazione cellulare nonché la sopravvivenza erano strettamente legate alla espressione di questi canali e alla loro capacità di trasportare magnesio (Nadler,2001; Schmitz,2003). In malattie rare caratterizzate da ipomagnesiemia e ipocalcemia secondaria si è riscontrata una anomalia nel gene che codifica per il TRPM6, specifico per i tubuli renali (e per l'intestino) e deputato al riassorbimento renale di magnesio (Schlingmann,2002; Chubanov,2004). Nonostante gli innumerevoli dati clinici che correlano diverse patologie alla disponibilità di magnesio sistemico o tessutale e nonostante la caratterizzazione molecolare di alcuni dei maggiori trasportatori del catione, mancano dati diretti di associazione tra gli eventi fisiopatologici, le evidenze molecolari e i flussi nonchè la compartimentalizzazione del magnesio intracellulare. La maggior parte degli studi su cellule modificate per l'espressione dei TRPM sono stati eseguiti misurando correnti ioniche con tecniche di patch clamp, mentre gli studi degli efflussi sono stati estrapolati indirettamente dalle misure del Magnesio totale intra o extracellulare tramite spettrometria ad assorbimento atomico su estratti cellulari. D'altro canto, le valutazioni dinamiche dei movimenti di magnesio in vivo sono difficili da interpretare in quanto i fluorocromi disponibili in commercio presentano una serie di limitazioni. Le sonde fluorescenti commerciali per lo studio del magnesio sono derivate da quelle per il calcio (fura, indo, quin, fluo) che presentano (Kd) per il calcio nell'ordine di grandezza dei 100 nanoM. Tali sonde sono state modificate con l'intento di aumentarne la selettività nei confronti del magnesio, ottenendo indicatori quali il mag-fura e il mag-fluo con Kd intorno ai 2-3 mM. Tuttavia, entrambi conservano una certa affinità per il calcio (Kd dell'ordine di 20 microM) e sono sensibili al pH, producendo dei risultati spesso contaminati da queste componenti (Schachter,1990; Hurley,1992). Nello studio del magnesio citosolico bisogna tener presente che:
1) la concentrazione basale del magnesio è molto più alta di quella del calcio (sub-mM vs sub-microM);
2) le modificazioni del magnesio sono molto meno ampie di quelle del calcio (x1 o x2 volte superiori vs Ca x10 e più);
3) le modificazioni del magnesio sono generalmente più lente rispetto a quelle del calcio.
Questo implica che la sonda deve essere molto selettiva per e sensibile al magnesio e ben tollerata dalla cellula per consentire osservazioni relativamente lunghe. Un'altra questione molto dibattuta nello studio della omeostasi del magnesio è quella dei pools intracellulari e del significato biologico di questi pools. Il concetto deriva da due osservazioni fondamentali:
1) diverse specie chimiche abbondanti nell'ambiente intracellulare presentano alte affinità di legame per il catione (es.: adenin nucleotidi, soprattutto ATP4-, poliammine etc.);
2) in alcune circostanze si verificano sostanziali modificazioni dei pools intracellulari di magnesio associate o non a modeste modificazioni del contenuto di magnesio libero o di magnesio totale (Fatolahi,2000; Wolf 1998; Di Francesco and Wolf,1998). Ove si eccettui il pool legato agli adenin nucleotidi che può essere misurato con la risonanza magnetica, come possono essere identificati questi pools di magnesio, e come correlare modificazioni di questi con il significato biologico del catione? In pratica una sonda ideale per il magnesio deve presentare caratteristiche di alta specificità, sensibilità, stabilità, deve essere ben tollerata. Molto recentemente sono state proposte alcune nuove sonde per la misurazione del magnesio libero cellulare (Komatsu, 2004; Komatsu,2005) che hanno permesso di identificare movimenti intracellulari rapidi e abbastanza rilevanti indicativi di una attiva mobilizzazione dei pools di magnesio non conseguente ad idrolisi di ATP, al contrario di quanto si pensasse precedentemente (Kubota,2005). Il significato di questi movimenti di magnesio, siano essi qualitativi o quantitativi, attendono una interpretazione nell'ambito di funzioni cellulari quali l'apoptosi o la proliferazione. Nell’ultimo anno nuove sonde fluorescenti per il magnesio derivate dal benzo(h)chromene sono state utilizzate in microscopia confocale con eccitazione a due fotoni. Queste sonde presentano potenziali vantaggi molto interessanti: i) la possibilità di individuare lo stato di legame del magnesio intracellulare e conseguentemente la identificazione dei “pools” di magnesio libero e legato e ii) la possibilità di compiere osservazioni su campioni spessi di tessuto (Kim et al.2007). Queste nuove sonde aprono quindi le porte ad un nuovo filone di ricerca che sarà in grado di chiarire il meccanismo di regolazione ed il ruolo del magnesio in importanti situazioni fisiopatologiche. In collaborazione con alcuni colleghi del Dipartimento di Chimica "G. Ciamician" della Università di Bologna, sulla base di lavori precedenti in cui si caratterizzavano le proprietà fotochimiche di diversi derivati della 8-idrossichinolina coniugata ad un diaza-18-crown-6 (DCHQ) che mostravano una alta affinità per il magnesio (Prodi,1998), le UR di Roma e Bologna hanno studiato due derivati sostituiti in posizione 5 con 2 molecole di H (DCHQ1) o di Cl (DCHQ2) per la misura del magnesio cellulare. Queste sonde si sono rivelate specifiche per il Mg con alta affinità per il catione (Kd=44 o 75 microM), più bassa interferenza con il calcio rispetto alle sonde classiche, ben tollerate dalle cellule e in grado di rilevare transienti rapidi di magnesio intracellulare a seguito di stimoli che modificano la attività mitocondriale (Farruggia,2006). Queste sonde sembrano possedere dei buoni presupposti per sviluppare tecniche avanzate di imaging cellulare, rappresentando quindi lo strumento necessario per una corretta interpretazione del ruolo di questo catione in diverse condizioni fisiopatologiche, in particolare dati preliminari indicano che la sonda DCHQ1 potrebbe essere utilizzata per la misura quantitativa del magnesio cellulare in alternativa alla spettrometria ad assorbimento atomico, con il grande vantaggio di necessitare di pochi milioni di cellule, potendo quindi essere applicata per campioni biologici di quantità esigua (Farruggia et al. manoscritto sottomesso per la pubblicazione).
Le sorgenti di raggi X ad altissima brillanza, quali le grandi facilities di radiazione di sincrotrone di terza generazione, hanno consentito negli ultimi anni l’accesso a metodologie innovative di grande valore e potenzialità in molti campi scientifici, tra cui in primissimo piano le scienze biomediche. Tra le tecniche di maggior interesse vi sono quelle di imaging, che grazie agli enormi progressi nelle ottiche per raggi x, e alla corta lunghezza d’onda delle onde elettromagnetiche in questa regione spettrale, possono raggiungere risoluzioni spaziali nanometriche. L’alto potere di penetrazione dei raggi X, permette di ottenere informazioni sul bulk del campione e non solo sulla loro superficie, mentre le tecniche di fluorescenza X consentono di determinare quantitativamente la concentrazione di elementi, anche in traccia. La combinazione di tecniche di focalizzazione del fascio e di analisi elementale, ha consentito lo sviluppo di tecniche quali la microfluorescenza che consente di avere informazioni spettroscopiche e di determinare la distribuzione spaziale di un determinato elemento con un’altissima risoluzione spaziale (inferiore ai 100 nm). Questo tipo di misure si possono effettuare sia mediante la misura diretta della fluorescenza, sia mediante la misura dell’assorbimento differenziale a due diverse energie del fascio incidente, una inferiore ed una superiore alla soglia di assorbimento tipica dell’elemento la cui distribuzione si vuole studiare.
E’ possibile anche, mediante tecniche di microspettroscopia, ottenere informazioni sullo stato di valenza e di coordinazione dell’elemento in esame. Studi di microfluorescenza e microimaging applicati a sistemi cellulari riguardano, ad es., la distribuzione intracellullare del Cu, (Yang, 2005), l’analisi di elementi essenziali in cardiomiociti (Palmer, 2006) o la relazione di metalli in traccia con infezioni batteriche (Maser, 2003). Un recente lavoro ha raggiunto un record nella risoluzione spaziale in microfluorescenza, studiando l’accumulo di Fe in neuroni associato a dopamina a 90 nm di risoluzione (Ortega, 2007).

Referenze:
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