RICERCA ITALIANA     

Carcinoma papillare della tiroide sdifferenziato: caratteristiche cliniche, cellulari, molecolari; sintesi e farmacologia preclinica di nuovi agenti terapeutici inibitori delle tirosinchinasi.

Università di Pisa

Abstract

Il carcinoma papillare della tiroide sdifferenziato (DPTC) presenta una crescita rapida, un comportamento clinico aggressivo, con diffusione metastatica, e perdita della capacità di captare il radioiodio, rendendo perciò inefficace questa terapia; chemio- e radioterapia hanno dimostrato scarsa efficacia, mentre nuove molecole con attività inbitoria delle tirosinchinasi (TKIs) sembrano avere effetti antitumorali promettenti a livello clinico.
Scopo del progetto di ricerca è quello di caratterizzare a livello clinico e molecolare il DPTC, di produrre nuove molecole con attività inbitoria delle tirosinchinasi (TKIs) e di testare il loro effetto in studi di farmacologia preclinica su colture primarie di DPTC.
I pazienti operati per carcinoma papillare dedifferenziato della tiroide (DPTC) nelle Unità del Prof. Berti e della Prof.ssa Pelizzo (50 pazienti circa), nei due anni di durata della ricerca, saranno inclusi nello studio. I dati clinici di ogni paziente verrano accuratamente registrati.
Campioni di tessuto di ogni paziente, verrano inviati dalla Unità del Prof. Berti alla Unità della Prof. Pelizzo per la caratterizzazione molecolare.Viceversa, alcuni campioni di tessuto (circa 10) da DPTC raccolti nella Unità della Prof Pelizzo, verrano trasportati rapidamente presso la Unità del Prof. Berti dove saranno ottenenute colture cellulari primarie.
L’unità della Prof. Pelizzo analizzerà l'espressione genetica di parecchi trasportatori di membrana dei tireociti e di enzimi coinvolti nel mantenimento delle funzioni della cellula tiroidea differenziata, quali il NIS, PDS, TPO e Tg, ed implicati nell'uptake e nell'utilizzo cellulare del glucosio, quali il GLUT 1 (trasportatore del glucosio di tipo 1) e le esochinasi I e II. Inoltre sarà determinata la frequenza delle mutazioni di BRAF e sarà correlato lo stato di BRAF con il mantenimento delle funzioni della cellula tiroidea e con i cambiamenti del suo metabolismo glucidico.
Il programma di ricerca della Unità del Prof. Berti è:
(1) determinare se gli “inibitori delle tirosin chinasi” (TKIs, prodotti dalla Unità del Prof. Bocci) inibiscano la crescita di colture cellulari primarie umane di “DPTC”;
(2) indagare se i TKIs possano inibire l’attività dell’ongene RET mutato in vitro.
Venti colture cellulari primarie verranno realizzate a partire da pazienti con DPTC (8-10 con RET/PTC). Campioni di tali colture saranno quindi inviate all'unità del Prof. Bocci per testare la tumorigenesi e l'attività antineoplastica di nuove molecole inibenti l'attività tirosinchinasica, in vivo, in topi nudi CD nu/nu. La ricerca di RET/PTC1 e RET/PTC3 verrà realizzata mediante real-time PCR. Per determinare gli effetti delle TKIs sulla proliferazione cellulare, sarà utilizzato il test MTT. Per stabilire la concentrazione inibitoria del 50% (IC50) delle TKIs (la concentrazione che determina un’inibizione della crescita del 50%), diverse concentrazioni dei TKIs verranno aggiunte nei pozzetti, e la IC50 sarà determinata usando una interpolazione lineare. Per valutare gli effetti delle TKIs sul ciclo cellulare e l’apoptosi sarà utilizzata l’analisi FACS (fluorescence activated cell sorting). L’attività inibitoria delle TKIs sulla fosforilazione delle proteine sarà valutata tramite Western Blot.
Il programma di ricerca della Unità del Prof. Bocci, sarà articolato in tre distinte fasi.
1. DESIGN E SINTESI DI NUOVI INIBITORI
Sulla base dei risultati ottenuti con i derivati a nucleo pirazolo[3,4-d]pirimidinico, nuove molecole saranno sintetizzate modificando le posizioni 2 e 4 dell'eterociclo.
2. DETERMINAZIONE IN VITRO DELL'ATTIVITÀ DELLE TIROSIN-CHINASI
La capacità dei TKIs di inibire l'attività enzimatica delle tirosin-chinasi EGFR, VEGFR e RET sarà valutata in vitro utilizzando uno specifico saggio, denominato OmniaTM Kinase Assay Kit.
3. VALUTAZIONE PRECLINICA DEI NUOVI COMPOSTI
I test di citotossicità e apoptosi saranno eseguiti su cellule primarie ottenute nell'unità di ricerca del Prof. Berti e caratterizzate dall'unità della Prof.ssa Pelizzo. Inoltre, anche la linea cellulare 8305C di carcinoma tiroideo non differenziato con componenti papillari e le cellule endoteliali HUVEC saranno testate. Per trasferire i risultati in vitro a modelli in vivo, cellule primarie DPTC tumorigeniche (ottenute nella Unità del Prof. Berti) e cellule 8305C saranno inoculate sottocute in topi nudi che saranno trattati con TKIs da soli o in combinazione con chemioterapici.
I risultati ottenuti potranno essere utilizzati: a) per la validazione di nuovi criteri di identificazione dei DPTC; b) potranno aiutare a meglio comprendere la patogenesi del DPTC, ad individuare nuovi marcatori diagnostici e prognostici, a pianificare nuove strategie terapeutiche e a stabilire la distribuzione epidemiologica di tali neoplasie; c) sviluppare nuove molecole TKIs, ed identificare quelle a maggiore attività antineoplastica che potranno essere successivamente utilizzate nell’uomo. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Piero Berti Università degli Studi di PISA

Obiettivo del Programma di Ricerca

I carcinomi papillari della tiroide vengono generalmente trattati con successo dall’approccio combinato di chirurgia, terapia radiometabolica e terapia TSH-soppressiva. Questo approccio terapeutico tuttavia non impedisce l’insorgenza di recidive nel 20-40% dei casi (Mazzaferri EL, 2002: Schlumberger MJ, 1998). Nei casi di recidiva tumorale si può verificare una sdifferenziazione cellulare (carcinoma papillare sdifferenziato; DPTC) che porta ad una crescita tumorale più rapida, un comportamento clinico più aggressivo, con diffusione metastatica e dalla perdita della capacità di captare il radioiodio da parte della neoplasia, rendendo inefficace questa terapia. A questo stadio avanzato anche chemio- e radioterapia hanno dimostrato scarsa efficacia ed il carcinoma sdifferenziato risulta il responsabile della maggior parte dei decessi dovuti al carcinoma tiroideo (Haugen BR,1999).
ALTERAZIONI MOLECOLARI NEL CARCINOMA TIROIDEO
Riarrangiamenti di RET/PTC sono stati riscontrati nel 30-50% dei carcinomi papillari sporadici dell’adulto, mutazioni di RAS nel 10% circa e di BRAF nel 40% circa; non è invece mai stata dimostrata alcuna associazione tra queste mutazioni (Krause DS, 2005; Braga-Brasaria M, 2003).
Nei carcinomi papillari indotti da radiazioni ed in quelli insorti in età pediatrica riarrangiamenti del gene RET/PTC sono stati invece dimostrati nel 50-80% dei casi; la mutazione di BRAF è stata dimostrata nel 10% (Krause DS, 2005; Braga-Brasaria M, 2003). Gli inibitori della BRAF chinasi impediscono la crescita tumorale delle cellule portatrici di mutazioni del gene RET/PTC o BRAF (Ouyang B, 2006) ed anche l’inibizione della cascata delle chinasi (MEK) può produrre effetti simili.
Tra le varie forme di RET/PTC, RET/PTC1 e RET/PTC3 sono le più frequentemente riscontrate nel carcinoma papillare tiroideo (Zhu Z, 2006). Le tirosinchinasi RET/PTC sono costitutivamente attive ed innescano l’attivazione delle vie di segnalazione intracellulare interagendo e fosforilando varie molecole di segnalazione, tra cui transduttore di segnale e attivatore della trascrizione 3 (STAT3) e STAT1 (Hwang ES, 2004).
Le mutazioni di BRAF sono associate ad un comportamento più aggressivo del tumore ed a tumori meno differenziati, effetti riconducibili all’azione inibitoria sulla crescita cellulare della neoplasia mediata dal blocco dell’enzima BRAF chinasi.
La perdita della differenziazione del Ca tiroideo si esprime spesso con la perdita della capacità di captazione del radioiodio. Questo effetto può essere correlato all’espressione ridotta o assente del trasportatore sodio/iodio (NIS) (Haugen BR,1999; Filetti S,1999), che può a sua volta essere indotta da un gene BRAF mutato.
NUOVE TERAPIE MOLECOLARI MIRATE NEL CARCINOMA TIROIDEO AVANZATO
L’attività clinica di vari composti (AMG706, BAY43-9006, ZD64-74 e AG-013736) è attualmente in corso di studio nell’uomo (fase 2) (Santoro M, 2006: Polverino A, 2006; Carlomagno F, 2006; Kim DW, 2006; Vidal M, 2005). Gli studi preliminari hanno dimostrato sia miglioramenti che stabilizzazioni della malattia (Boughton D, 2006; Kim S, 2006; Kloos R, 2006). Queste molecole inibiscono numerosi bersagli, tra cui tirosinchinasi RET, i recettori per VEGF-1, VEGF-2, e VEGF-3, ed hanno dimostrato alcuni effetti anti-angiogenici. BAY43-9006 ha dimostrato azione inibitoria sulla BRAF chinasi. Altri potenziali bersagli sono rappresentati da recettori chinasici di membrana (recettori per EGF, fattore di crescita piastrino-derivato, c-Met). Gli effetti clinici di queste sostanze possono essere ricondotti alla inibizione della via delle MAPK, e dell’angiogenesi e possibilmente all’inibizione di altre molecole bersaglio.

SCOPO DEL PROGRAMMA DI RICERCA
Scopo del progetto di ricerca è quello di caratterizzare a livello clinico e molecolare il DPTC, di produrre nuove molecole con attività inbitoria delle tirosinchinasi (TKIs) e di testare il loro effetto in studi di farmacologia preclinica su colture primarie di DPTC.
METODI DEL PROGRAMMA DI RICERCA
I pazienti operati per carcinoma papillare dedifferenziato della tiroide (DPTC) nelle Unità del Prof. Berti e della Prof.ssa Pelizzo (50 pazienti circa), nei due anni di durata della ricerca, saranno inclusi nello studio. I dati clinici di ogni paziente verrano accuratamente registrati.
Campioni di tessuto di ogni paziente verrano inviati dall’Unità del Prof. Berti all’Unità della Prof.ssa Pelizzo per la caratterizzazione molecolare.Viceversa, alcuni campioni di tessuto (circa 10) da DPTC raccolti nell’Unità della Prof.ssa Pelizzo, verranno trasportati rapidamente presso l’Unità del Prof. Berti dove saranno ottenenute colture cellulari primarie.
L’Unità della Prof.ssa Pelizzo analizzerà l'espressione genetica di parecchi trasportatori di membrana dei tireociti e di enzimi coinvolti nel mantenimento delle funzioni della cellula tiroidea differenziata, quali il NIS, PDS, TPO e Tg, ed implicati nell'uptake e nell'utilizzo cellulare del glucosio, quali il GLUT 1 (trasportatore del glucosio di tipo 1) e le esochinasi I e II. Inoltre sarà determinata la frequenza delle mutazioni di BRAF e sarà correlato lo stato di BRAF con il mantenimento delle funzioni della cellula tiroidea e con i cambiamenti del suo metabolismo glucidico.
Il programma di ricerca dell’Unità del Prof. Berti è:
(1) determinare se gli “inibitori delle tirosin chinasi” (TKIs, prodotti dall’Unità del Prof. Bocci) inibiscano la crescita di colture cellulari primarie umane di “DPTC”;
(2) indagare se i TKIs possano inibire l’attività dell’ongene RET mutato in vitro.
Venti colture cellulari primarie verranno realizzate a partire da pazienti con DPTC (8-10 con RET/PTC). Campioni di tali colture saranno quindi inviate all'Unità del Prof. Bocci per testare la tumorigenesi e l'attività antineoplastica di nuove molecole inibenti l'attività tirosinchinasica, in vivo, in topi nudi CD nu/nu. L’analisi dei riarrangiamenti RET/PTC verrà effettuata mediante real-time PCR. Saranno valutale l’attività antiproliferativa, l’attività inibitoria sulla fosforilazione delle proteine e gli effetti delle TKIs sul ciclo cellulare e l’apoptosi.
Il programma di ricerca dell’Unità del Prof. Bocci sarà articolato in tre distinte fasi.
1. DESIGN E SINTESI DI NUOVI INIBITORI. Sulla base dei risultati ottenuti con i derivati a nucleo pirazolo[3,4-d]pirimidinico, nuove molecole saranno sintetizzate modificando le posizioni 2 e 4 dell'eterociclo.
2. DETERMINAZIONE IN VITRO DELL'ATTIVITÀ DELLE TIROSIN-CHINASI. La capacità dei TKIs di inibire l'attività enzimatica delle tirosin-chinasi EGFR, VEGFR e RET sarà valutata in vitro utilizzando uno specifico saggio, denominato OmniaTM Kinase Assay Kit.
3. VALUTAZIONE PRECLINICA DEI NUOVI COMPOSTI. I test di citotossicità e apoptosi saranno eseguiti su cellule primarie ottenute nell'Unità di ricerca del Prof. Berti e caratterizzate dall'Unità della Prof.ssa Pelizzo. Inoltre, anche la linea cellulare 8305C di carcinoma tiroideo non differenziato con componenti papillari e le cellule endoteliali HUVEC saranno testate. Per trasferire i risultati in vitro a modelli in vivo, cellule primarie DPTC tumorigeniche (ottenute nell’Unità del Prof. Berti) e cellule 8305C saranno inoculate sottocute in topi nudi che saranno trattati con TKIs da soli o in combinazione con chemioterapici.

OBIETTIVI FINALI.
I risultati ottenuti potranno essere utilizzati: a) per la validazione di nuovi criteri di identificazione dei DPTC; b) per comprendere meglio la patogenesi del DPTC, individuare nuovi marcatori diagnostici e prognostici, per pianificare nuove strategie terapeutiche e stabilire la distribuzione epidemiologica di tali neoplasie; c) per sviluppare nuove molecole TKIs, ed identificare quelle a maggiore attività antineoplastica che potranno essere successivamente utilizzate nell’uomo; d) per identificare sottogruppi di DPTC (per esempio, positivi per RET/PTC, o mutazioni BRAF) maggiormente sensibili all’effetto antineoplastico dei TKIs. <<<

Risultati parziali attesi

RISULTATI ATTESI, UNITA’ DELLA PROF.SSA PELIZZO.
RISULTATI PRELIMINARI.
Studi preliminari sono stati condotti dall’Unità della Prof.ssa Pelizzo in un numero limitato di pazienti (10) con DPTC. I tumori non in grado di captare lo iodio avevano una lieve riduzione dell’espressione di NIS, una significativa riduzione dei livelli di espressione di tireoglobulina (Tg), tireoperossidasi (TPO), e pendrina (PDS), un significativo incremento di GLUT-1, ed una più elevata frequenza di mutazioni BRAF. La mutazione BRAF600E, nei tumori della tiroide metastatici, era associata con una marcata riduzione dell’espressione di TPO e PDS, ed un considerevole incremento di GLUT-1.
RISULTATI ATTESI.
Espressione dei geni di differenziazione tiroidei.
I livelli di mRNA di NIS, Tg, TPO e PDS saranno probabilmente più bassi nei carcinomi tiroidei che nei tessuti normali. Nei DPTC verosimilmente sarà trovata solo una lieve riduzione dei livelli di NIS in paragone con i tumori primari, ma i livelli dei trascritti di Tg, TPO e PDS saranno più bassi. Ci si attende che per ogni gene tiroideo, le metastasi captanti il radioiodio avranno livelli di mRNA simili a quelli del tumore primario. Sarà ricercata una correlazione fra l’espressione di Tg, TPO e PDS.
Espressione dei geni correlati al metabolismo del glucosio.
In paragone ai tessuti normali, i tumori primari e le recidive probabilmente dimostreranno un lieve aumento dei livelli di mRNA per GLUT-1, che sarà molto più marcato nei DPTC non captanti lo iodio in paragone con i tumori primari. I pazienti con FDG-PET-CT positiva avranno probabilmente livelli di mRNA per GLUT-1 più elevati, rispetto ai pazienti negativi, ed ai normali; i pazienti con FDG-PET-CT negativa avranno probabilmente livelli di mRNA per GLUT-1 più elevati rispetto ai pazienti normali. Saranno ricercate differenze significative per l’espressione di esochinasi I e II. Sarà inoltre ricercata una correlazione fra l’espressione di GLUT-1 ed esochinasi II.
BRAF e rapporti fra mutazioni BRAF ed espressione di altri geni.
Saranno ricercate mutazioni di BRAF (nell’esone 15 V600E; mutazione puntiforme dell’esone 15 BRAF al codone 601, consistente nella transizione da A a G, nel nucleotide 1801, che porta alla sostituzione di lisina con glutammato). Ci si apetta una più elevata frequenza di mutazioni BRAF nei DPTC, rispetto ai tumori captanti lo iodio.
Saranno ricercate differenze significative nell‘espressione di NIS, TPO, PDS, GLUT-1 e Tg, fra i tumori primari o metastatici con mutazione V600E rispetto a quelli con wild-type BRAF. CONCLUSIONI ATTESE.
In conclusione, lo studio dimostrerà: 1) la perdita della capacità iodofissante nei DPTC non dipende solo dalla riduzione dell’espressione di NIS; 2) le modificazioni di altre molecole che regolano il metabolismo intracellulare potrebbero avere un ruolo nel processo di dedifferenziazione; 3) l’elevata espressione di GLUT-1 nei tumori DPTC non iodocaptanti potrebbe rappresentare la base biologica per l’utilizzo della scintigrafia FDG-PET nella valutazione di questi tumori; 4) la presenza di mutazione BRAFV600E potrebbe portare a carcinomi tiroidei con un fenotipo sdifferenziato e quindi con prognosi peggiore.

RISULTATI ATTESI, UNITA’ DEL PROF. BERTI.
GLI INBITORI DELLE TIROSIN CHINASI (TKIs) INIBISCONO LA PROLIFERAZIONE DELLE CELLULE PRIMARIE DI DPTC (RISULATI PRELIMINARI).
Sono stati inizialmente testati gli effetti di due TKIs (TK3, TK24) sulla crescita cellulare in due colture cellulari primarie di DPTC ottenute da due pazienti (mediante il test MTT). Le cellule DPTC-derivate sono state incubate con concentrazioni crescenti (0, 5, 10, 30, 50 mcM) di TK3 o TK24 per 3 giorni. Sia TK3 che TK24 hanno inibito significativamente (p&lt;0.0001) la proliferazione delle cellule DPTC-derivate in modo dose-dipendente, con un’inibizione della proliferazione del 42% con TK24 50 mcM, e del 82% con TK3 50 mcM (IC50 per TK3 17 mcM).
RISULTATI ATTESI
I TKIs inibiscono la proliferazione delle cellule primarie di DPTC.
L’effetto delle TKIs sulla crescita delle cellule DPTC-derivate verrà misurato mediante test MTT. L’inibizione della proliferazione sarà valutata nel DPTC in presenza/assenza di RET/PTC, per stabilire se le TKIs possano avere effetti diversi in presenza o assenza di RET/PTC; ci aspettiamo una maggiore inibizione da parte dei TKIs nelle cellule DPTC-derivate in presenza della RET/PTC.
I TKIs favoriscono l’arresto del ciclo cellulare e l’apoptosi?
Valuteremo il contributo delle componenti citotossiche e citostatiche nell’inibizione della crescita cellulare TKIs-indotta. Per prima cosa, la contemporanea colorazione con annessina V/PI sarà utilizzata per determinare se la morte cellulare si verifica e per chiarire la natura di tale morte nelle colture trattate. L’analisi del ciclo cellulare mediante FACS dimostrerà se il trattamento con i TKIs aumenta la morte cellulare apoptotica dopo 3 giorni di trattamento. Inoltre, determineremo la distribuzione nelle diverse fasi del ciclo delle cellule DPTC trattate con i TKIs. Ci aspettiamo che il trattamento con i TKIs aumenti la percentuale di cellule in fase G0/G1 del ciclo, ed una riduzione del numero di cellule in fase S. In conclusione, i dati dimostreranno verosimilmente se i meccanismi principali dell’inibizione della crescita cellulare TKIs-indotta in vitro siano legati all’arresto del ciclo in fase G0/G1 o all’induzione dell’apoptosi.
I TKIs inibiscono l’autofosforilazione del gene RET nelle cellule di DPTC in maniera dose-dipendente?
I lisati preparati da cellule di DPTC con RET/PTC trattati con i TKIs per 90 minuti saranno analizzati mediante Western blotting con anticorpi anti-PY-RET. L’inibizione dell’autofosforilazione del gene RET sarà probabilmente osservata in maniera dose-dipendente. Per escludere che l’osservata riduzione della fosforilazione del gene RET sia causata da ridotti livelli di proteina-RET, le membrane verranno testate con anticorpi primari anti-RET. La quantità totale di RET espresso non dovrebbe cambiare dopo esposizione ad i TKIs per 90 minuti indicando che i TKIs inibiscono l’autofosforilazione di RET ma non influiscono sui livelli di espressione della proteina RET.
L’esposizione prolungata ad i TKIs induce cambiamenti nei livelli dell’oncoproteina RET?
Per valutare gli effetti di una esposizione prolungata ad i TKIs sull’espressione di RET e sui livelli di fosforilazione nelle cellule, prepareremo lisati cellulari dopo 16 ore di esposizione ad i TKIs e li analizzeremo mediante Western blotting. L’inibizione completa dell’autofosforilazione di RET sarà ricercata utilizzando concentrazioni crescenti dei TKIs. Quindi, studieremo gli effetti dei TKIs sull’espressione del gene RET per mezzo di PCR quantitativa (qPCR). Il trattamento di cellule di DPTC con i TKIs per 16 ore probabilmente non determinerà una riduzione dei livelli di trascrizione.
CONCLUSIONI ATTESE.
Dimostreremo se i TKIs inibiscono la proliferazione delle cellule primarie di DPTC e la fosforilazione del gene RET. La concentrazione dei TKIs necessaria per inibire la proliferazione delle cellule di DPTC ci permetterà di concludere se la monoterapia con i TKIs possa essere una buona opzione nella terapia dei DPTC.

RISULTATI ATTESI, UNITA’ DEL PROF. BOCCI.
Alla fine dei due anni di studio, i risultati attesi potranno essere riassunti nei seguenti punti.
Sarà effettuata la sintesi chimica di un pannello di nuovi inibitori delle tirosin-chinasi (TKIs) che verranno testati in vari modelli, in vitro ed in vivo, di carcinoma papillare sdifferenziato della tiroide; alcuni di questi verranno successivamente brevettati.
Sarà determinata, per ognuno dei nuovi composti TKIs sintetizzati, la selettività precisa per le tirosin-chinasi RET, EGFR e VEGFR-2, con particolare attenzione per le IC50. I farmaci con le concentrazioni inibitorie più basse saranno selezionati per gli studi farmacologici di tipo preclinico.
Sarà determinata la citotossicità dei nuovi composti TKIs su colture primarie tumorigeniche di carcinoma papillare sdifferenziato della tiroide (cellule DPTCP) e sulla linea continua 8305C, e la loro capacità di indurre il processo apoptotico nelle medesime linee.
Una volta determinato l’effetto farmacologico, ci aspettiamo di dimostrare il meccanismo con cui questo effetto si realizza. Per questo motivo, valuteremo se l’inibizione dell’espressione genica e della sintesi di due proteine chiave del ciclo cellulare come ciclina-D1 e CDK2 avrà avuto luogo, proseguendo poi con la verifica dell’inibizione della cascata proliferativa legata alla fosforilazione di ERK1/2. Il meccanismo apoptotico sarà studiato attraverso la quantificazione dell’inibizione di Akt e attraverso il grado di attivazione di caspasi 3.
Un ulteriore passo verso la possibilità di traslare i nostri risultati nella clinica, sarà quello di verificare un eventuale effetto sinergico dei nuovi TKIs con chemioterapici. Un effetto sinergico della combinazione tra chemioterapici ed inibitori delle tirosin-chinasi è già stata dimostrata in altri tumori. In effetti, i risultati attesi sono relativi ad un possibile effetto sinergico su linee primarie DPTCP, con una riduzione degli effetti tossici dei singoli trattamenti. Inoltre, l’eventuale sinergismo sarà verificato anche su linee cellulari endoteliali, in modo da dimostrare un possibile aumento di effetto antiangiogenico.
L’attività diretta e indiretta dei TKIs sul processo angiogenico sarà verificata sia con studi farmacologici sulle linee endoteliali sia sulle cellule tumorali, con la possibilità di dimostrare se vi sia una modulazione dell’espressione genica e della produzione di proteine pro-angiogeniche quali il VEGF ed i loro recettori (VEGFR-2).
Al fine di selezionare potenziali composti per futuri studi di fase I-II in pazienti affetti da carcinoma papillare sdifferenziato, si rende necessario lo studio in vivo su xenotrapianti di cellule tumorigeniche DPTCP e 8305C, in topi nudi. In questo modello sperimentale sarà valutato sia l’effetto del trattamento con soli TKIs, sia l’effetto della loro combinazione con irinotecano al fine di dimostrare un possibile sinergismo sia sulla regressione della massa tumorale, che sulla diminuzione della densità microvascolare, e sulla espressione dei fattori pro-angiogenici. Inoltre, particolare attenzione sarà attribuita alla tossicità determinata dal trattamento. Sarà inoltre importante la verifica sperimentale dell’inibizione della fosforilazione di RET nelle cellule e nei tumori da parte dei TKIs.

RISULTATI ATTESI DALLA VALUTAZIONE COMPLESSIVA DEI RISULTATI.
I risultati ottenuti dalle tre Unità saranno analizzati congiuntamente al fine di portare alla luce risultati che possono scaturire solo dal confronto dei dati ottenuti dall’attività dei tre gruppi di ricerca, per esempio: a) stabilire la distribuzione epidemiologica di tali neoplasie; b) identificare sottogruppi di DPTC (per esemipo, positivi per RET/PTC, o mutazioni BRAF) maggiormente sensibili all’effetto antineoplastico dei TKIs. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

INTRODUZIONE
Il carcinoma papillare della tiroide rappresenta la neoplasia maligna endocrina più frequente e l’1% circa delle neoplasie umane. Gli istotipi papillare e follicolare insieme rappresentano il 90% circa dei carcinomi differenziati della tiroide (CDT). I CDT vengono generalmente trattati con successo dall’approccio combinato di chirurgia, terapia radiometabolica e terapia TSH-soppressiva. Questo approccio terapeutico tuttavia non impedisce l’insorgenza di recidive nel 20-40% dei casi (Mazzaferri EL, 2002: Schlumberger MJ, 1998). Nei casi di recidiva tumorale si può verificare una sdifferenziazione cellulare che porta ad una crescita tumorale più rapida, un comportamento clinico più aggressivo, con diffusione metastatica e la perdita della capacità di captare il radioiodio da parte della neoplasia, rendendo inefficace questa terapia. A questo stadio avanzato anche chemio- e radioterapia hanno dimostrato scarsa efficacia ed il carcinoma sdifferenziato risulta il responsabile della maggior parte dei decessi dovuti al carcinoma tiroideo (Haugen BR,1999).


ALTERAZIONI MOLECOLARI NEL CARCINOMA TIROIDEO SDIFFERENZIATO
La iodocaptazione è un meccanismo regolato dal TSH che coinvolge un trasporto energia-dipendente mediato dal NIS (Na/I Symporter) (Haugen BR,1999; Filetti S,1999) situato sulla superficie basilaterale del tireocita ed un trasporto passivo localizzato alla superficie apicale, dove sembra essere coinvolto il gene per la Sindrome di Pendred (PDS). A livello della superficie apicale lo iodio è organificato dalla tireoperossidasi (TPO) e coniugato ai residui tirosinici della tireoglobulina (Tg). Un calo sensibile dei livelli di NIS è stato dimostrato in tumori tiroidei in confronto con i tessuti normali, ma ciò è molto meno evidente nelle metastasi non iodofissanti rispetto ai tumori primitivi e alle metastasi iodofissanti, suggerendo che il meccanismo alla base della perdita della iodofissazione è molto più complesso del semplice controllo genetico della trascrizione del NIS (Braga-Basaria M,2003). L'espressione genica di Tg, TPO e PDS è più bassa nei tumori tiroidei che nel tessuto normale. Un calo significativo dell'espressione genica di tali molecole è stato anche identificato nelle metastasi non iodocaptanti rispetto sia ai tumori primitivi che alle metastasi iodofissanti. Queste differenze potrebbero significare che il processo di iodofissazione richiede non solo la presenza del NIS ma anche di un apparato responsabile della ritenzione dello iodio all'interno della cellula. Conferme indirette di tale ipotesi sembrano derivare da studi di terapia genica, nei quali il gene del NIS è stato introdotto in cellule neoplastiche non tiroidee per promuovere la captazione del radioiodio ed indurre citotossicità. Tali studi hanno dimostrato che, sebbene la presenza del NIS nelle cellule bersaglio fosse accompagnata da un efficace intake iodico, gli effetti terapeutici erano evidenti solamente quando venivano utilizzate alte dosi di radioiodio (superiori a quelle impiegate nell'uomo) (Braga-Basaria M,2003). Per i tumori che non captano lo 131I, la disponibilità di metodiche di imaging per la diagnosi delle metastasi è cruciale per poter impiegare la chirurgia con intento curativo (Mazzaferri EL, 2002). Molti studi hanno dimostrato l'efficacia della PET nel management postoperatorio dei carcinomi tiroidei, particolarmente nei pazienti con elevati valori circolanti di Tg e Total body scan negativo. Tale efficacia ben si accorda con gli studi molecolari che hanno dimostrato che l'elevato consumo di glucosio della cellula neoplastica si accompagna ad un aumento del suo trasporto transmembrana dovuto ad una iperespressione del GLUT-1. Tale incremento è particolarmente evidente negli istotipi più aggressivi. La sensibilità della PET nei tumori tiroidei può essere incrementata dalla somministrazione del TSH. Studi in vitro hanno dimostrato che la stimolazione con TSH di cellule FTRL-5 è seguita da un aumento della captazione del glucosio e studi in vivo hanno dimostrato che la PET risulta più accurata dopo somministrazione di TSH ricombinante umano, permettendo la rilevazione di lesioni che non erano state viste in condizioni di TSH soppressione, determinando pertanto un cambiamento della strategia chirurgica e migliorando la prognosi (Mazzaferri EL, 2002.

ONCOGENI
Nel carcinoma tiroideo sia papillare che follicolare sono state descritte diverse anomalie molecolari che sembrano esserne alla base dell’insorgenza. nell’80% dei casi di carcinoma papillare sono state riscontrate mutazioni dei geni che codificano molecole di segnalazione della via per proteinchinasi-mitogen-attivato MAPK (Fagin JA, 2004). Riarrangiamenti di RET/PTC sono stati riscontrati nel 30-40% dei carcinomi papillari sporadici dell’adulto, mutazioni di RAS nel 10% circa e di BRAF nel 40% circa; non è invece mai stata dimostrata alcuna associazione tra queste mutazioni (Krause DS, 2005; Braga-Brasaria M, 2003).
Nei carcinomi papillari indotti da radiazioni ed in quelli insorti in età pediatrica riarrangiamenti del gene RET/PTC sono stati invece dimostrati nel 50-80% dei casi; la mutazione di BRAF è stata dimostrata nel 10% (Krause DS, 2005; Braga-Brasaria M, 2003). Gli inibitori della BRAF chinasi impediscono la crescita tumorale delle cellule portatrici di mutazioni del gene RET/PTC o BRAF (Ouyang B, 2006) ed anche l’inibizione della cascata delle chinasi (MEK) può produrre effetti simili. In aggiunta all’attivazione della via MAPK, queste mutazioni e molti recettori delle tirosinchinasi possono portare all’attivazione della fosfatidilinositol-3-chinasi (PI3K) (Bounacer A, 2004; Shinohara M, 2007).
Tra le varie forme di RET/PTC, il RET/PTC1 e RET/PTC3 sono i più frequentemente ricontrati nel carcinoma papillare tiroideo (Zhu Z, 2006). Le tirosinchinasi RET/PTC sono costituzionalmente attive ed innescano l’attivazione delle vie di segnalazione intracellulare interagendo e fosforilando varie molecole di segnalazione, tra cui transduttore di segnale e attivatore della trascrizione 3 (STAT3) e STAT1 (Hwang ES, 2004).
Molti studi hanno dimostrato che i carcinomi papillari con mutazione del BRAF sono più aggressivi ed un recente studio suggerisce che BRAFV600E potrebbe essere considerato marcatore prognostico sfavorevole.
L’iperespressione dei recettori tirosino-chinasici, inclusi recettori per fattori di crescita per i fibroblasti (FGF) e l’epidermide (EGF), per gli epatociti (c-Met), per endotelio vascolare (VEGF), insulina ed insulin growth factor 1, è stata descritta in cellule tiroidee tumorali e risultano frequentemente iperespressi anche i ligandi per questi stessi recettori. Anche l’angiogenesi sembra giocare un ruolo centrale nella progressione di questi tumori ipervascolarizzati e l’iperespressione di marcatori di neoangiogenesi può avere un significato prognostico (Bunone G, 1999; De La Torre NG, 2006). In modelli sperimentali, i trattamenti mirati all’inibizione della neovascolarizzazione del tumore riescono ad impedire la crescita del carcinoma tiroideo (Schoenberger J, 2004; Younes MN, 2006).

NUOVE TERAPIE MOLECOLARI MIRATE NEL CARCINOMA TIROIDEO AVANZATO
Gli oncogeni attivati sono bersagli per lo sviluppo di nuovi agenti antitumorali specifici. Un numero crescente di farmaci che hanno come bersaglio gli oncogeni attivati hanno già determinato benefici clinici sui pazienti, dimostrando così il potenziale terapeutico d'inibizione degli oncogeni nei tumori umani. Inoltre, altri farmaci che agiscono a differenti livelli sugli oncogeni attivati o iperespressi sono stati recentemente approvati, come gli inibitori del recettore per il fattore di crescita epidermico (EGFR) e gli inibitori del recettore per il fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) e VEGF recettore-2 (VEGFR-2), che possono prevenire l'angiogenesi tumorale (Ferrara and Kerbel, 2005). Tutti questi esempi dimostrano che i pazienti affetti da tumore possono trarre benefici significativi dagli sviluppi delle terapie mirate, specialmente nel caso in cui un oncogene attivato sia riconosciuto come causa basilare di un preciso tumore maligno. Tuttavia, tutte queste nuove piccole molecole hanno dimostrato una maggiore attività quando somministrate in combinazione con farmaci chemioterapici (Kerbel, 2006).
Uno dei bersagli più promettenti per lo sviluppo di una terapia selettiva per i pazienti affetti da carcinoma papillare della tiroide (PTC) è l'oncogene attivato RET (Kim et al.,2006a ). La famiglia di oncogeni RET/PTC deriva da numerosi riarrangiamenti, che coinvolgono il gene RET del cromosoma 10q, e sono specifici per i carcinomi papillari in cui sono presenti fino al 77% (Cheung et al., 2001). La ricerca di nuove opzioni terapeutiche, perciò, diventa sempre più importante, specialmente per i pazienti con malattia metastatica. Dal momento che le mutazioni germinali e somatiche di RET sono note per essere la causa dello sviluppo del PTC, il RET attivato è l'obbiettivo delle nuove strategie per il trattamento di questa patologia. Tuttavia, recenti evidenze sperimentali dimostrano un'attivazione autocrina di EGFR e VEGFR in cellule di PTC (cellule TPC1) (Hoffmann et al., 2007), suggerendo un razionale per l'uso degli inibitori tirosin-chinasici con meccanismo d'azione dualistico come ZD6474 (Carlomagno et al.,2002a ) e SU11248 (Kim et al., 2006a). Inoltre, questi composti possono efficacemente agire anche attraverso l'inibizione dell'angiogenesi tumorale, un processo chiave della crescita neoplastica nei tumori tiroidei (Mitchell and Parangi, 2005).
Ad oggi, sono stati individuati e sviluppati diversi inibitori della attività tirosin chinasica di RET, che agiscono sostituendosi all'ATP nel legame con il dominio catalitico intracellulare della proteina. La specificità di azione di questi composti è variabile in quanto, oltre a RET, sono i grado di inibire con diverso grado di efficacia anche altre proteine ad attività tirosin chinasica. I derivati più attivi sono rappresentati da piccole molecole di sintesi, caratterizzate da strutture chimiche diverse e appartenenti alla classe delle chinazoline, come ZD6474 (Carlomagno et al., 2002a), degli indolin-2-oni, come RPI-1(Lanzi et al., 2003) e SU5416 (Mologni et al., 2006) e delle pirazolo[3,4-d]pirimidine, come PP1 (Carlomagno et al., 2002b) e PP2 (Carlomagno et al., 2003). Queste ultime, in particolare, bloccano l'attività di RET mostrando una efficacia superiore agli altri inibitori descritti dalla letteratura. Inoltre, sono in grado di inibire potentemente l'attività di Src, una tirosin-chinasi citoplasmatica effettrice di RET. Questa duplice attività offre l'indubbio vantaggio di intervenire contemporaneamente su più vie di trasduzione del segnale e rappresentano pertanto i composti di elezione per una possibile terapia del PTC.
L'anilinoquinazolina ZD6474 è una piccola molecola che inibisce la tirosin-chinasi del recettore per il VEGF e l'EGF, ed è attualmente impiegata in vari trials di fase I e II (Herbst et al., 2007). Inoltre è stato dimostrato che ZD6474 inibisce RET e che blocca efficientemente la crescita invasiva delle cellule tumorali (Carlomagno et al., 2002a). Queste nuove piccole molecole sono altamente efficaci in combinazione con i chemioterapici, tra cui spicca il CPT-11, molto promettente in differenti carcinomi tiroidei come l'anaplastico e il midollare. I trattamenti combinati sono risultati particolarmente attivi con anticorpi anti EGFR (cetuximab) e piccole molecole che inibiscono la tirosin chinasi (PTK787) (Kim et al., 2006b; Kim et al., 2006c; Strock et al., 2006).

ATTIVITA‘ CLINICA DI NUOVE TERAPIE MOLECOLARI MIRATE NEL CARCINOMA TIROIDEO AVANZATO
L’attività clinica di vari composti (AMG706, BAY43-9006, ZD64-74 e AG-013736) è attualmente in corso di studio nell’uomo (fase 2) (Santoro M, 2006: Polverino A, 2006; Carlomagno F, 2006; Kim DW, 2006; Vidal M, 2005). Gli studi preliminari hanno dimostrato sia miglioramenti che stabilizzazioni della malattia (Boughton D, 2006; Kim S, 2006; Kloos R, 2006). Queste molecole inibiscono numerosi bersagli, tra cui tirosinchinasi RET, i recettori per VEGF-1, VEGF-2, e VEGF-3, ed hanno dimostrato alcuni effetti anti-angiogenici. BAY43-9006 ha dimostrato azione inibitoria sulla BRAF chinasi. Altri potenziali bersagli sono rappresentati da recettori chinasici di membrana (recettori per EGF, fattore di crescita piastrino-derivato, c-Met). Gli effetti clinici di queste sostanze possono essere ricondotti alla inibizione della via delle MAPK, e dell’angiogenesi e possibilmente all’inibizione di altre molecole bersaglio.

SCOPO DELLO STUDIO
Il PTC sdifferenziato disseminato è una malattia terminale senza un efficace trattamento sistemico o antiblastico (Venkataraman et al., 1999). Perciò, nuove prospettive terapeutiche sono necessarie per migliorare il decorso clinico dei pazienti. I TKIs sono “inibitori delle tirosin-chinasi” di RET, EGFR e VEGFR-2, recentemente brevettati (figura 1; La Motta et al., 2007) e utilizzati con successo in vitro per inibire la proliferazione di cellule tumorali umane di carcinoma papillare sdifferenziato (nostri risultati preliminari). Scopo dello studio è quello di sviluppare nuove molecole TKIs, e di testare in vitro ed in vivo (nell’animale) la loro attività antitumorale. <<<