RICERCA ITALIANA     

Aspetti molecolari di patologie conformazionali proteiche. Ruolo dei fattori ambientali sulle variazioni strutturali di proteine per la progettazione e la sintesi di agenti ad attività antiaggregante, antiossidante, antiglicante e chelante nonchè per applicazioni in diagnostica.

Università degli Studi di Catania

Abstract

Negli ultimi anni, è stato dimostrato che l’insorgere di molte malattie è legato al misfolding proteico. Queste malattie sono state dunque raggruppate insieme sotto il nome di ‘disordini conformazionali proteici’ (DCP). Questo gruppo include il morbo di Alzheimer, l’encefalopatia spongiforme trasmissibile, il morbo di Huntington, il morbo di Parkinson, il diabete tipo II, e più di 15 altre meno note patologie.
Molti fattori ambientali pH, ioni metallici, stress ossidativi possono contribuire alla destabilizzazione di una molecola nativa e, presumibilmente, incrementare la popolazione degli stati misfolded. Tuttavia, nonostante i grossi sforzi compiuti recentemente, il processo attraverso cui proteine solubili (o loro frammenti) di struttura primaria distinta subiscono parziale unfolding, ed errato refolding, fino a produrre oligomeri molto stabili e polimeri con nuove proprietà, rimane ancora oscuro. Questo è anche il motivo principale per cui, sebbene è stato dimostrato che alcune molecole possono contrastare l’insorgere delle malattie, non esistono farmaci in grado di curare queste patologie.
Questo progetto è finalizzato, attraverso un approfondimento dei meccanismi molecolari responsabili della patogenesi, allo sviluppo di nuovi composti per il trattamento delle (DCP). Modelli sperimentali chimici e biologici saranno utilizzati per saggiare l’attività e l’efficacia dei potenziali farmaci. L’analisi dei >>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Enrico RIZZARELLI Universita' degli Studi di CATANIA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il principale obiettivo del presente progetto riguarda la determinazione dei fattori che provocano le variazioni conformazionali che provocano il misfolding proteico e, di conseguenza, lo sviluppo di molecole utili per il trattamento delle malattie conformazionali sia da un punto di vista terapeutico che diagnostico.

A tale scopo, dapprima saranno Identificati possibili siti d’azione per farmaci in grado di bloccare o almeno ritardare la morte neuronale nel corso di malattie conformazionali. A tal fine, anche attraverso la combinazione di metodologie computazionali per analisi conformazionale, ottimizzazione della struttura, mappatura farmacofora, calcolo di mappe idropatiche e potenziali elettrostatici, energie di interazione, si valuteranno sia le proprietà che i meccanismi chimico-fisici che portano alla formazione di forme neurotossiche e la possibilità di intervento farmacologico per bloccare tali effetti sia a livello della loro formazione che a livello dei sistemi trasduzionali proapoptotici. L’ uso combinato di MD e softwares per la mappatura di idropaticità ed energie di interazione consente l’ analisi dei frames della MD con possibilità di discriminare tra diverse “forme” della proteina ed avere utili indicazioni su variazioni conformazionali. Si studierà la caratterizzazione delle alterazioni strutturali che portano alla formazione di aggregati amiloidei; l’identificazione delle forme che inducono >>>

Risultati parziali attesi

Scopo principale di questa attività di ricerca è la messa a punto di protocolli operativi ottimizzati per la sintesi e l’espressione di proteine e di peptici fibrillogenici da utilizzare per le successive fasi di studio e di caratterizzazione chimico-fisica. Poiché tali peptidi sono molto spesso insolubili in acqua, rendendo difficile tale caratterizzazione, particolare attenzione sarà rivolta alla funzionalizzazione di tali frammenti con PEG allo scopo di renderli meno insolubili e potere così indagare sulle loro caratteristiche conformazionali. Una notevole varietà di frammenti di alfa-sinucleina (aS), nonché l'intera sequenza proteica sarà ottenuta. Nella fase iniziale si avranno a disposizione molecole opportunamente marcate (15N, 13C, 2H) per l'analisi strutturale NMR. Parallelamente, tirosinasi (Ty) umana verrà espressa in P. pastoris. Un risultato intermedio importante di questa fase della ricerca sarà l'ottenimento del frammento NAC (56-102), eventualmente marcato con 15N per studi strutturali e topologici. È possibile che frammenti peptidici più lunghi, e cioè l'1-41 e l'1-52, necessitino di essere espressi con marcatura isotopica almeno al 15N per essere studiati all'NMR. Una volta verificata questa necessità mediante studi NMR preliminari, questi frammenti dovrebbero essere facilmente ottenibili. Un altro risultato significativo sarà la produzione di materiale opportunamente marcato con nitrossidi, adatto allo studio mediante EPR. La prima coppia di >>>

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il non corretto folding proteico è all’origine di una grande varietà di patologie. Negli ultimi anni, è stato dimostrato che l’insorgere di molte malattie deriva dal misfolding proteico e sono state dunque raggruppate insieme sotto il nome di ‘disordini conformazionali proteici’ (DCP). Questo gruppo include il morbo di Alzheimer , l’encefalopatia spongiforme trasmissibile, il morbo di Huntington, il morbo di Parkinson, diabete tipo II, amiloidosi legate alla dialisi, scolori amiotrofica laterale, e più di 15 altre meno note patologie (Kelly 1996; Soto 1999). Il punto cruciale delle DCP è un cambiamento nella struttura secondaria e/o terziaria di una proteina normale (A-beta amyloid, Prione, Huntingtin, alfa-sinucleina, beta-microglobulina, Cu Zn-superossidismutasi) o di un suo frammento polipeptidico senza alterazione della struttura primaria. In ogni caso si ha una progressiva transizione da una proteina cellulare correttamente foldata a una fibrilla amiloide insolubile ricca in beta sheet (Soto 1999). Queste sono strutture lineari, non ramificate, di circa 70-120 A di diametro e di lunghezza indeterminata, formatesi per autoassemblaggio di diversi gruppi di normali proteine solubili. La conoscenza della struttura di tali fibrille è necessaria per comprendere l’innaturale aggregazione e deposizione, portando possibilmente alla progettazione razionale di agenti terapeutici che ne prevengano la formazione o disaggreganti. Sebbene le >>>