RICERCA ITALIANA     

Analisi strutturale ad alta risoluzione di componenti flagellari in situ e purificati

Università degli Studi di Siena

Abstract

Il progetto è finalizzato ad ottenere modelli tridimensionali ad alta risoluzione di alcuni tra i principali componenti dell'assonema flagellare. Intendiamo focalizzare le nostre indagini strutturali sulle baraccia di dineina in situ (ODA; Outer Dynein Arms) i radial spokes isolati (RS) e le particelle purificate di trasporto intraflagellare (IFT). Questi complessi macromolecolari sono presenti negli assonemi di ciglia e flagelli della maggior parte degli eucarioti e sono indispensabili per garantirne la motilità (ODA, RS) o l'assemblaggio e il turnover (IFT). Queste strutture assumono quindi un ruolo funzionale fondamentale in ciglia e flagelli normali e sono implicate nella patogenesi delle malattie causate da difetti della motilità o del turnover di questi organelli cellulari. I nostri studi strutturali verranno effettuati utilizzando due tra i più efficienti metodi attualmente disponibili per la preparazione di materiale biologico destinato ad indagini ad alta risoluzione: il QuickFreeze-DeepEtching (QF/DE) e la Criomicroscopia Elettronica. Le micrografie ottenute mediante queste tecniche di preparazione saranno sottoposte a due differenti strategie di analisi di immagine: la tomografia elettronica di repliche metalliche per quanto riguarda lo studio delle dineine in situ, e analisi a particella singola per quel che concerne i RS e le particelle IFT isolati. Utilizzeremo come modelli di studio specie con caratteristiche vantaggiose per il nostro approccio >>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Pietro LUPETTI Università degli Studi di SIENA

Obiettivo del Programma di Ricerca

L'uso delle tecniche di Quick-Freeze/Deep-Etching e di Criomicroscopia Elettronica, due tra le procedure attualmente più avanzate per la preservazione e l'osservazione di cellule e complessi molecolari, combinato con l'impiego di strategie per l'analisi di immagine quali la tomografia elettronica e l'analisi su singola particella, consentirà di ottenere modelli 3D ad alta risoluzione della struttura:

1)delle braccia di dineina - il motore molecolare per il battito flagellare - osservate in situ nell'assonema degli spermatozoi di ditteri cecidomidi, i quali presentano una serie di peculiarità che li rendono particolarmente idonei alla visualizzazione di queste strutture.

2)dei radial spokes - i complessi che controllano l'attività delle braccia di dineina - isolati dagli assonemi 9+2 dei flagelli dell'alga verde Chlamydomonas, così come dei complessi che ne costituiscono i precursori e dei radial spokes modificati presenti in alcuni ceppi mutanti di Chlamydomonas.

3)delle particelle coinvolte nell'IFT (IntraFlagellar Transport), fenomeno diffuso in tutti i tipi di ciglia e flagelli degli eucarioti e richiesto per il loro assemblaggio e mantenimento; la struttura di queste particelle è al momento completamente sconosciuta.

Risultati parziali attesi

A)Morfologia molecolare del braccio esterno di dineina in situ.
Abbiamo già effettuato alcuni studi preliminari su repliche di assonemi degli spermatozoi di Monarthropalpus flavus ottenendo una prima ricostruzione tomografica 3D. I risultati preliminari sono molto incoraggianti anche se è necessario implementare il lavoro svolto. E' stata ricostruita una regione dell'assonema corrispondente a 7 file di braccia di dineina, ciascuna con circa 25 molecole allineate. Questa è un'immagine della regione ricostruita:

Un paio di filari sono molto distorti, ma ve ne sono altri piuttosto regolari. Abbiamo selezionato i filari migliori e mediato le immagini delle braccia perché equivalenti per orientazione ed esposizione al metallo. Le immagini finali sono state segmentate per evidenziare i domini principali e la connessione con il tubulo B.

Nel corso del primo anno di progetto intendiamo implementare la tomografia degli ODA secondo gli aspetti seguenti:

1) Geometrie di raccolta. esploreremo diverse geometrie per la raccolta di immagini. L'unità di Siena si è dotata di un nuovo porta-preparato che permette sia di tiltare il campione che di ruotarlo; è quindi adatto per la tomografia a doppio asse. Per questo tipo di tomografia sono necessarie due serie di immagini dell'assonema ottenute ruotando il campione di 90° tra una serie e l'altra >>>

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

A)Introduzione

Ciglia e flagelli degli eucarioti sono organelli deputati ad assolvere due funzioni: 1) la propulsione della cellula (es. spermatozoi, protozoi ciliati e flagellati) o del fluido sulla superficie cellulare (epiteli ciliati), e 2) una funzione sensoria, tipica delle ciglia specializzate presenti sulle cellule recettrici per stimoli chimici, meccanici o visivi; la membrana plasmatica di queste ciglia contiene specifici recettori e canali ionici.

B)Struttura dell'assonema di ciglia e flagelli

Ciglia e flagelli (i due termini sono analoghi) sono caratterizzati dalla presenza di una specializzazione citoscheletrica, l'assonema, la cui struttura consiste in 9 doppietti microtubulari disposti attorno ad un complesso centrale di 2 microtubuli singoli (struttura 9+2). Lungo ciascun doppietto tubulare sono disposte due file di dineine (braccia esterne ed interne) che interagiscono con il microtubulo adiacente.

Lo scivolamento reciproco dei tubuli promosso dalle dineine, ATPasi con funzione di motori molecolari, genera la forza meccanica necessaria per il movimento di tutte le ciglia 9+2. Il meccanismo della motilità richiede che le braccia di dineina non siano tutte contemporaneamente attive, perché questo risulterebbe nel blocco dello scivolamento tra doppietti. La dineina è regolata dai microtubuli centrali attraverso i radial spokes, che sono inseriti >>>