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PROGRAMMA DI RICERCA 2004
italiano - english
Unità di Ricerca
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- 10 - Enzimi dipendenti dal piridossale 5'-fosfato. Aspetti strutturali, funzionali e biomedici.
Classificazione scientifico-disciplinare
- Area scientifico disciplinare: Scienze fisiche
- Area scientifico disciplinare: Scienze biologiche
Classificazione brevettuale
- CHEMISTRY; METALLURGY
- BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- MICRO-ORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF (biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, containing micro-organisms, viruses, microbial fungi, enzymes, fermentates or substances produced by or extracted from micro-organisms or animal material A01N63/00; food compositions A21, A23; medicinal preparations A61K; chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings, absorbent pads or surgical articles A61L; fertilisers C05); PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICRO-ORGANISMS (preservation of living parts of humans or animals A01N1/02); MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA (micro-biological testing media C12Q)
- ORGANIC CHEMISTRY (such compounds as the oxides, sulfides, or oxysulfides of carbon, cyanogen, phosgene, hydrocyanic acid or salts thereof C01; products obtained from layered base-exchange silicates by ion-exchange with organic compounds such as ammonium, phosphonium or sulfonium compounds or by intercalation of organic compounds C01B33/44; macromolecular compounds C08; dyes C09; fermentation products C12; fermentation or enzyme-using processes to synthesise a desired chemical compound or composition or to separate optical isomers from a racemic mixture C12P; production of organic compounds by electrolysis or electrophoresis C25B3/00, C25B7/00)
- ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM (metal-containing porphyrins C07D487/22)
- BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
Classificazione geografica
- Regione: Emilia Romagna
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Parole Chiave
EMOGLOBINE DI PIANTA NON SIMBIOTICHE; OSSIDO NITRICO; MUTAGENESI SITO DIRETTA; CRISTALLI DI PROTEINE; LASER FLASH PHOTOLYSIS; STOPPED FLOW; SPETTROSCOPIA RAMAN DI RISONANZA; CINETICHE DI REAZIONE; LEGAME DI OSSIGENO E MONOSSIDO DI CARBONIOAspetti strutturali e funzionali delle emoglobine non simbiotiche da Arabidopsis thaliana
Università degli Studi di ParmaAbstract
Le emoglobine (Hb) sono presenti in un'ampia varietà di organismi, dai batteri agli eucarioti unicellulari, fino alle piante e agli animali. Le emoglobine di pianta sono state classificate in simbiotiche e non simbiotiche. Le Hb non simbiotiche (nsHb) sono state scoperte di recente e si pensa siano precedenti nell'evoluzione alle più specializzate legemoglobine. Le nsHb mostrano una peculiare esacoordinazione dell'eme, risultante da due residui di istidina che legano l'atomo di Fe nel quinto e nel sesto sito di coordinazione, quest'ultimo essendo il tradizionale sito di legame per l'O2 ed altri ligandi. Nonostante la potenziale inibizione del legame con ligandi esogeni, le nsHb legano O2 ed altri ligandi con affinità molto elevate. Si conosce molto poco della funzione delle nsHb, sebbene si sia proposto il loro coinvolgimento in una o più delle seguenti vie metaboliche: i) rimozione dell'O2; ii) partecipazione in un processo di electron transfer mediante l'interazione con una flavina; iii) legame di O2, NO e CO come parte di un meccanismo sensoriale e/o di difesa; iv) legame a piccole molecole organiche e partecipazione alla sintesi di composti organici in condizioni anaerobiche.Arabidopsis thaliana possiede due nsHb, AHb1 e AHb2. Le loro proprietà biologiche suggeriscono che possano avere differenti funzioni. AHb1 viene fortemente indotta da condizioni di ipossia, il ché suggerisce che sia una proteina indotta dallo stress. E stato proposto che AHb1 funzioni come >>>
Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca
Cristiano VIAPPIANI Università degli Studi di PARMAObiettivo del Programma di Ricerca
Il ruolo fisiologico di due emoglobine non simbiotiche da Arabidopsis thaliana, AHb1 e AHb2, è ancora sconosciuto a causa di una caratterizzazione strutturale e funzionale molto limitata. Lo scopo di questo progetto è quello di determinare proprietà cinetiche e di equilibrio di entrambe le emoglobine e di loro mutanti specifici, di caratterizzare la geometria dell'eme in funzione dello stato di ossidazione e della presenza di ligandi esogeni e, se possibile, le loro strutture tridimensionali.AHb1 funziona come una diossigenasi, metabolizzando l'NO a nitrato. Intendiamo svolgere un'approfondita indagine dell'attività NO diossigenasica NADPH dipendente di AHb1 e determinare l'eventuale esistenza di una metAHb1 riduttasi nelle cellule delle piante. La caratterizzazione funzionale comprenderà anche la determinazione di costanti di affinità e di velocità di reazione per il legame di NO, O2 e CO ad AHb1(FeII) e AHb2(FeII). I residui coinvolti nell'esacoordinazione del Fe dell'eme saranno mutati in entrambe le proteine per chiarire, a livello molecolare, l'origine delle diverse affinità per l'O2 riportate preliminarmente e caratterizzare i cammini di accesso al sito di legame.
Questi dati verranno messi in correlazione con quelli strutturali, derivati dalle indagini spettroscopiche sulle risposte del circondario dell'eme al legame di ligandi e a mutazioni di amminoacidi. Intendiamo inoltre ottenere cristalli di entrambe le proteine e determinare la loro struttura >>>
Risultati parziali attesi
1. Ottimizzazione del sistema di espressione e purificazione di AHb1 and AHb2 per la produzione su larga scala2. Identificazione di una metAHb1-riduttasi specifica in estratti di piante che sovraesprimono AHb1
3. Mutagenesi sito-specifica di residui nella cavità distale e prossimale di AHb1 e AHb2
4. Determinazione delle costanti di affinità per O2, NO, CO di AHb1(FeII) e AHb2(FeII) wt e identificazione di un possibile meccanismo cooperativo.
5. Caratterizzazione di velocità di legame di ligandi (CO, O2, NO) a AHb1(FeII) e AHb2(FeII) in soluzione
6. Caratterizzazione della cinetica dell'attività diossigenasica in soluzione
7. Caratterizzazione della cinetica di rebinding di CO, NO ed O2 ad AHb1(FeII) e AHb2(FeII) wt in gel di silice mediante laser flash photolysis.
8. Cristallizzazione di AHb1 e AHb2
9. Caratterizzazione di AHb1 e AHb2 nei loro stati Fe(III) e Fe(II) mediante spettroscopia Raman Risonante (RR) in soluzione.
10. Caratterizzazione di AHb1 e AHb2 in presenza di ligandi esogeni mediante RR e spettroscopia infrarossa (complessi Fe(II)-O2, Fe(III)-NO e Fe(II)-NO).
11. Informazioni sulle interazioni polari rilevanti (in particolare, ponti H) nella tasca dell'eme dalle frequenze vibrazionali dell'unità FeCO nei complessi Fe(II)-CO di AHb1 e AHb2.
12. Caratterizzazione delle reazioni successive alla fotodissociazione dei complessi con il CO di AHb1 e AHb2 mediante Laser-induced >>>
