RICERCA ITALIANA     

Basi funzionali e aspetti strutturali del dominio extracellulare del beta-distroglicano, una proteina "natively unfolded", coinvolta in patologie neuromuscolari.

Università degli Studi di Roma "Tor Vergata"

Abstract

Il distroglicano e' una molecola di adesione costituita da due subunita', alfa e beta, che collega il citoscheletro alla matrice extracellulare. L' interazione ad alta affinita' tra le due subunita' del distroglicano è di tipo non covalente ed è da considerarsi un fattore primario che influenza la stabilita' dell' intero complesso del distroglicano. L' importanza a livello biomedico del distroglicano emerge in diverse forme di distrofia muscolare nelle quali è stato osservato che il mancato "targeting" del distroglicano a livello del sarcolemma rappresenta un fattore principale che porta all' instabilita' ed ad un progressivo indebolimento delle fibre muscolari.
La caratteristica principale del dominio extracellulare del beta-distroglicano è quella di essere una proteina che appartiene alla famiglia delle cosiddette "natively unfolded". Questa classe di proteine pur non possedendo una classica conformazione secondaria e terziaria conservano una alta selettivita' di legame.
L' obiettivo principale del progetto di ricerca e' la caratterizzazione biochimica e biofisica di un dominio proteico "natively unfolded" finalizzata all' identificazione delle regioni di sequenza che sono coinvolte nelle sue attivita' funzionali
Sulla base della caratterizzazione strutturale del dominio extracellulare del beta-DG gia' ottenuta mediante spettroscopia NMR, verrà intrapreso uno studio strutturale mediante NMR di tale dominio nel suo complesso con l'alfa-DG. Inoltre >>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Maurizio PACI Università degli Studi di ROMA "Tor Vergata"

Obiettivo del Programma di Ricerca

_Obiettivi
L' obiettivo principale di questo progetto di ricerca è di acquisire informazioni sulla struttura e la funzione di un peptide appartenente alla classe delle proteine "natively unfolded", il dominio extracellulare del beta-distroglicano (DG). A questo scopo verra' impiegata una combinazione di tecniche biochimiche (espressione ricombinante e mutagenesi), di biologia strutturale (NMR), e di biologia cellulare (trasfezione ed analisi in immunofluorescenza di cellule e mioblasti in coltura). Visto il coinvolgimento del DG in numerosi processi biologici e patologici, verranno analizzati anche campioni biologici prelevati da pazienti affetti da patologie sia muscolari che metaboliche, con l' obiettivo di studiare il ruolo del dominio "natively unfolded" del beta-DG nella stabilita' dell' intero complesso del DG e nella eventuale genesi patologica.
_Strategia e Metodologie
Sulla base dell'assegnazione gia' effettuata delle risonanze del "backbone" del beta-DG(654-750) [1], verrà eseguita una serie di spettri per l' assegnazione delle risonanze del beta-DG(654-750) nella forma legata con un peptide sintetico che rappresenta l' epitopo di legame dell'alfa-DG [2-3]. Successivamente si procedera' allo studio della struttura del complesso mediante la raccolta dei NOE e la simulazione di dinamica molecolare (Unita' 1, Universita' di Tor Vergata). Per la produzione quantitativa delle proteine ricombinanti, marcate con 15N e 13C, si utilizzeranno tecniche >>>

Risultati parziali attesi

Primo anno
1) identificazione degli aminoacidi della subunita' beta-DG "natively unfolded" cruciali per l' interazione tra le subunità alfa- e beta-DG.
2) caratterizzazione del complesso del DG in pazienti umani affetti da malattie neuromuscolari e metaboliche.

Secondo anno
1) identificazione dei polimorfismi a singolo nucleotide nel gene del DG estratto da pazienti genotipizzati.
2) determinazione della struttura tridimensionale del complesso tra beta-DG(654-750) e alfa-DG(550-585).Secondo anno
a) Caratterizzazione della interazione tra a-DG e b-DG
b) Struttura in soluzione del complesso tra le due proteine
c) Identificazione delle caratteristiche sequenziali e strutturali di b-DG nel quadro dello studio delle proteine "natively unfolded" in parallelo a studi di mutagenesi sito specifica.
d) L' identificazione della regione di binding di b-DG con a-DG rappresenta un notevole progresso nella conoscenza delle interfacce molecolari tra le subunita' DG e sara' un passaggio cruciale per ottenere risultati utili per una futura progettazione razionale di terapie efficienti o per le distrofie muscolari o anche per prevenire le infezioni che sono DG

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

_PURIFICAZIONE E CLONAGGIO DEL DG
Il distroglicano (DG) e' stato identificato, e successivamente anche clonato, da microsomi del muscolo scheletrico di coniglio, nei laboratori di Kevin Campbell ad Iowa City (USA) nel 1992 [4]. Il DG (895 aminoacidi) è costituito da due subunita', alfa-DG e beta-DG, ed e' un componente importante del complesso di glicoproteine associate alla distrofina (DGC), che comprende i sarcoglicani, il sarcospan, le sintrofine e le distrobrevine [4,5]. E' interessante ricordare che nel 1987 Smalheiser e Schwartz avevano gia' identificato nel cervello di pecora una proteina di circa 120 kDa (cranina), in grado di legarsi alla laminina, che effettivamente corrisponde all' alfa-DG [6].
_LE SUBUNITA' DEL DG
Il DG e' codificato da un singolo gene [4] ed e' altamente conservato nei vertebrati superiori. Recentemente, ortologhi del DG sono stati identificati anche negli invertebrati [7,8]. Il DG viene prodotto come un'unica catena polipeptidica che viene poi tagliata nelle due subunita' alfa- e beta-DG, a livello del reticolo endoplasmatico [9].
L' alfa-DG e' una proteina periferica di membrana fortemente glicosilata che lega diverse molecole quali la laminina, l' agrina, il perlecano, la neurexina e il biglicano [5].
Il DG viene espresso in un' ampia varieta' di tessuti diversi dal muscolo: nell' epitelio e nel sistema nervoso centrale e periferico [10]. La massa mlecolare prevista per l' alfa-DG in base alla sua >>>