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PROGRAMMA DI RICERCA 2004

italiano - english
Unità di Ricerca
Programmi di ricerca simili:
Classificazione scientifico-disciplinare
Classificazione brevettuale
Classificazione geografica
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Parole Chiave
METALLOPROTEINE; CITOCROMO C; CITOCROMO P450; MUTANTI; RIPIEGAMENTO PROTEICO; IMMOBILIZZAZIONE DI PROTEINE; BIOSENSORI; DINAMICA MOLECOLARE; SOL-GEL

INGEGNERIZZAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DI METALLOPROTEINE IN SOLUZIONE ED IMMOBILIZZATE SU SUPERFICI

Università degli Studi di Roma "Tor Vergata"
Abstract
Il presente progetto è finalizzato a produrre varianti di citocromi della classe c e del citocromo P450 allo scopo di ottenere (i) una migliore comprensione dei meccanismi che controllano il folding di metalloproteine attraverso lo studio di intermedi conformazionali, e (ii) una ottimizzazione del processo di immobilizzazione di questi biosistemi su superfici solide o sol-gel, mostrando i citocromi interessanti potenzialità d'impiego in area biosensoristica.
(i) Studi di folding hanno mostrato che il processo di ripiegamento delle proteine nella loro forma nativa avviene in più stadi, con formazione di pochi intermedi caratterizzati da brevissimo tempo di vita. Una valida alternativa agli studi di cinetica rapida, è lo studio all'equilibrio di mutanti stabili come modelli di specie transienti. Le metalloproteine che verranno studiate in questo progetto sono i citocromi di lievito, equino, e il P450, nelle loro varianti.
Citocromi della classe c - Studi recenti (Sinibaldi et al. (2003) Biochemistry 42, 7604-7610) hanno mostrato che la mutazione sito-specifica H26Y induce nel cyt c di lievito (iso-1-cyt c) la formazione del molten globule a pH neutro, con spiazzamento della M80 dalla sesta posizione di coordinazione del Fe-eme ad opera di una lisina. Ciò ha indotto ad ipotizzare un ruolo importante di questo residuo per la stabilizzazione della proteina nativa. Si intende dunque produrre i seguenti mutanti: H26Y/H33Y, H26Y/H39K, H33Y/H39K, H26Y/H33Y/H39K e >>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca
Roberto SANTUCCI Università degli Studi di ROMA "Tor Vergata"
Obiettivo del Programma di Ricerca
Il presente progetto è finalizzato a produrre varianti di citocromi della classe c e del citocromo P450 allo scopo di ottenere (i) una migliore comprensione dei meccanismi che controllano il folding di metalloproteine attraverso la caratterizzazione di intermedi conformazionali ottenuti mutando residui ritenuti importanti per la stabilità della forma nativa, e (ii) una ottimizzazione del processo di immobilizzazione di questi biosistemi su superfici solide (che mimano la superficie elettrodica) o sol-gel, mostrando i citocromi interessanti potenzialità d'impiego in area biosensoristica.
(i) Studi di folding hanno mostrato che il processo di ripiegamento delle proteine nella loro forma nativa avviene in più stadi, con formazione di intermedi caratterizzati da brevissimo tempo di vita (transienti); ciò rende difficoltoso lo studio di questi transienti per via cinetica. Una migliore comprensione dei meccanismi che regolano il processo di folding può essere ottenuta attraverso lo studio all'equilibrio di mutanti stabili con conformazione intermedia tra la nativa e la denaturata; in molti casi, questi sistemi rappresentano dei validi modelli di specie transienti. Le metalloproteine che verranno studiate sono i citocromi equino, di lievito, e il P450, nelle loro varianti. Le proprietà dei due citocromi della classe c sono ben note; molto meno conosciute sono le proprietà degli intermedi transienti che si formano nel processo di folding. E' stato osservato che la mutazione >>>

Risultati parziali attesi
A) Produzione di proteine
Cyt c di lievito. (UO di Roma). Ottenimento dei doppi mutanti H26Y/H33Y, H26Y/H39K, H33Y/H39K, H26Y/M80A ed del triplo mutante H26Y/H33Y/H39K.
Cyt P450 BM3. (UO di Torino). Ottenimento di mutanti random selezionati con tecniche di direct evolution . I seguenti mutanti sono già disponibili in forma attiva: variante A2 (D251G, Q307H), variante P2 derivato da A2 (N192I, P193E, D194T, D195T, D208R, D251G, I254K, Q307H, K312T, G315R, M316V, V317G), variante M3 derivato da A2 (K210R, A225Q, S226A, D251G, S270E, Q307H), variante K4 derivata da M3 (V317C). Come si può vedere, cicli successivi di evoluzione diretta determinano mutazioni superflue mantenendo solo quelle che conferiscono un'attività selezionata.

B) Studi spettroscopici e funzionali.
Mutanti di citocromo c di lievito in soluzione:
- caratterizzazione spettroscopica e di dinamica molecolare simulata
- valutazione del ruolo delle istidine nella stabilizzazione della forma nativa
- caratterizzazione di eventuali fenomeni di parziale unfolding
- ruolo delle singole istidine nella transizione alcalina
- caratterizzazione strutturale a vari pH
- caratterizzazione delle proprietà redox.
Mutanti del citocromo P450:
- caratterizzazione spettroscopica e di dinamica molecolare simulata
- effetto delle mutazioni sulla struttura
- caratterizzazione delle proprietà redox

>>>

Durata
24 mesi
Base di partenza scientifica nazionale o internazionale
Negli ultimi anni, lo studio del ripiegamento (folding) proteico che segue la biosintesi ha conosciuto un enorme sviluppo. L'interesse si è focalizzato principalmente verso proteine monomeriche delle quali si conosce la struttura tridimensionale; la mioglobina ed i citocromi della classe c ne rappresentano tipici esempi (1-4). Un significativo miglioramento nelle conoscenze del processo di ripiegamento proteico è dovuto sia al drammatico sviluppo delle tecniche di cinetica rapida, che ha permesso di osservare fenomeni che avvengono nei primi attimi seguenti la biosintesi della macromolecola (5-9), sia allo studio strutturale di intermedi di equilibrio che hanno rappresentato, in molti casi, degli ottimi modelli di specie transienti che si formano prima della stabilizzazione della conformazione nativa (la conformazione favorita termodinamicamente) (10-14).
Per la gran parte delle proteine, il processo di ripiegamento avviene attraverso più stadi, alcuni dei quali sono comuni a molte proteine, mentre altri sono prettamente specifici. Gli studi effettuati hanno permesso di ottenere una descrizione piuttosto dettagliata delle variazioni strutturali che hanno luogo in piccole proteine, come la mioglobina e il citocromo c (15-18). Sulla base di questi risultati è stata ipotizzata l'esistenza di una molteplicità di percorsi nel ripiegamento proteico, che prevedono la formazione di intermedi caratterizzati da struttura terziaria fluttuante e mislegati alla sesta posizione >>>