RICERCA ITALIANA     

Mutazioni del gene RYR1 e malattie del muscolo scheletrico: dalla caratterizzazione molecolare allo studio funzionale

Università degli Studi di Napoli "Federico II"

Abstract

La contrazione muscolare è un processo altamente specializzato che dipende dall'interazione tra proteine contrattili ed è strettamente regolato dalla concentrazione intracellulare di Ca2+. Secondo il meccanismo dello scivolamento reciproco dei filamenti contrattili, gli ioni Ca2+ rilasciati dal SR si legano alla troponina localizzata all'interno dei filamenti sottili determinando la liberazione dei siti attivi dell'actina. Il rilascio di Ca2+ dal reticolo sarcoplasmatico è regolato dal meccanismo di accoppiamento eccitazione-contrazione (EC). La depolarizzazione della membrana plasmatica è in grado di attivare i recettori della diidropiridina (DHPR), specifici canali del Ca2+ voltaggio-dipendenti localizzati sui tubuli T che subiscono cambiamenti conformazionali, immediatamente trasmessi ai recettori della rianodina di tipo 1 (RyR1), canali del Ca2+ intracellulari localizzati sulle membrane del SR. L'apertura dei canali RyR1 determina il rilascio di Ca2+ dal SR verso il citoplasma e l'attivazione della contrazione muscolare.
Mutazioni nel gene RYR1, che codifica i canali RyR1, sono risultate associate a tre malattie genetiche della muscolatura scheletrica, l'ipertermia maligna (MH), la central core disease (CCD), e la multi-mini core disease (MmD).

L'obiettivo del progetto è quello di esaminare i seguenti punti:
A) Genetica dell'MH e CCD: individuazione di nuove mutazioni del gene RYR1 in pazienti con MH, CCD ed, eventualmente MmD, esaminando >>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Antonella CARSANA Università degli Studi di NAPOLI "Federico II"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Lo scopo del progetto è la caratterizzazione molecolare e funzionale delle mutazioni del gene RYR1 associate a malattie genetiche della muscolatura scheletrica, quali ipertermia maligna (MH), central core disease (CCD) e multi-mini core disease (MmD).
L' MH è una malattia genetica con trasmissione autosomica dominante, potenzialmente letale, che può determinare l'insorgere di tachicardia e ipertermia nei pazienti a rischio quando esposti ad anestetici volatili o a miorilassanti. La diagnosi clinica di MH è effettuata mediante un test di contrazione in vitro (IVCT), eseguito mediante trattamento con caffeina ed alotano di campioni di tessuto muscolare scheletrico ottenuti da prelievi bioptici. CCD è una rara miopatia congenita non progressiva di tipo autosomico dominante, caratterizzata da ipotrofia e ipotonia durante l'infanzia. La diagnosi clinica di CCD è effettuata mediante analisi istologica di campioni di tessuto muscolare scheletrico. Tali campioni presentano solitamente numerose ed evidenti lesioni centrali, caratterizzate dall'assenza di mitocondri e disorganizzazione dei sarcomeri prevalentemente a livello delle fibre di tipo I. MmD comprende una serie di miopatie congenite che, a differenza di CCD, presentano solitamente piccole lesioni della muscolatura scheletrica caratterizzate da disorganizzazione dei sarcomeri e perdita di mitocondri a carico sia delle fibre di tipo I che di tipo II.
Il gene RYR1 è un gene di grandi dimensioni (106 esoni) e >>>

Risultati parziali attesi

a) Individuazione di nuove mutazioni del gene RYR1 e definizione dell'epidemiologia molecolare in pazienti appartenenti ad una popolazione italiana.
b) Messa a punto ed esecuzione di saggi in vitro per valutare le proprietà funzionali dei canali RyR1 mutati. Risultati preliminari degli studi funzionali sui canali RyR1 con mutazioni note per i quali sono già disponibili i linfociti B immortalizzati e le cellule HEK293 transfettate. Raccolta di miotubi che esprimono i canali RyR1 mutati. Raccolta di linfociti B immortalizzati che esprimono le nuove mutazioni del gene RYR1 identificate in questa fase.
c) Raccolta di cellule muscolari satelliti che esprimono i canali di RyR1 mutati.
d) Messa a punto degli esperimenti di patch-clamp per studiare le correnti di Ca2+ di tipo L in miotubi umani.Caratterizzazione funzionale delle nuove mutazioni del gene RYR1 identificate durante le fasi 1 e 2 del progetto. In particolare, contiamo di:
a) completare la caratterizzazione funzionale (iniziata durante la fase 1) delle mutazioni dei canali RyR1 espressi in linfociti B, in cellule HEK293 e in miotubi di topo di cui alla fase 1;
b) estendere e completare la nostra analisi per caratterizzare le nuove mutazioni di RyR1 espresse in cellule HEK293 e/o miotubi murini e in linfociti B;
b) ottenere dati che dimostrano indirettamente la presenza di alterazioni metaboliche (rilascio di protoni) in seguito a trattamento con 4CmC nei linfociti B che esprimono >>>

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La contrazione muscolare è un processo altamente specializzato che dipende dall'interazione tra proteine contrattili ed è strettamente regolato dalla concentrazione intracellulare di Ca2+. Secondo il meccanismo dello scivolamento reciproco dei filamenti contrattili, gli ioni Ca2+ rilasciati dal reticolo sarcoplasmatico (SR) si legano alla troponina localizzata all'interno dei filamenti sottili determinando la liberazione dei siti attivi dell'actina. Le teste della miosina possono quindi interagire con i filamenti di actina iniziando in tal modo la contrazione muscolare (Huxley et al., 1969; 1988). Tale processo termina nel momento in cui gli ioni Ca2+ vengono rimossi dal citosol e riaccumulati all'interno del SR per azione di specifiche pompe Ca2+ (Wuytack et al., 2002). Il rilascio di Ca2+ dal SR è regolato dal meccanismo di accoppiamento eccitazione-contrazione (EC). Secondo tale meccanismo la depolarizzazione della membrana plasmatica è in grado di attivare specifici canali Ca2+ voltaggio-dipendenti localizzati sui tubuli T, i recettori della diidropiridina (DHPR). La modifica conformazionale che si verifica a livello dei DHPR in seguito alla depolarizzazione della membrana è immediatamente trasmessa ai recettori della rianodina di tipo 1 (RyR1), canali del Ca2+ intracellulari localizzati sulle membrane del SR. L'apertura dei canali RyR1 determina il rilascio di Ca2+ dal SR verso il citoplasma e l'attivazione della contrazione muscolare (Takeshima et al., 1994; 1995 >>>