RICERCA ITALIANA     

Analisi dell'espressione genica in condizioni di stress ossidativo

Università degli Studi del Sannio di Benevento

Abstract

L'omeostasi cellulare si realizza attraverso una varietà di meccanismi la cui alterazione rappresenta uno stress per la cellula. Citochine, fattori di crescita o episodi di ischemia/riperfusione inducono la produzione di specie reattive di ossigeno (ROS) che vanno ad ossidare macromolecole biologiche quali lipidi, proteine e DNA. Le cellule attivano un complesso sistema di difesa tendente a ridurre la produzione di ROS o a inattivarli, nonchè altre vie che normalmente operano nella trasduzione di segnali extracellulari. Tra queste viene attivata anche la via di NFkB. Alte quantità di ROS inducono una kinasi specifica che fosforila la molecola inibitoria IkB che viene degradata dal proteosoma. NFkB migra nel nucleo e attiva geni della proliferazione e della risposta immunitaria. Unitamente a queste vie, vengono stimolati anche geni con effetti protettivi tra cui i Peroxisome Proliferator Activated Receptors (PPAR), appartenenti alla superfamiglia dei recettori nucleari. Esistono tre isoforme di PPAR, ognuna in grado di legare molecole specifiche con uno specifico profilo di espressione genica. La isoforma gamma partecipa al differenziamento adipocitario e epiteliale. Recentemente, si è ipotizzato che una delle azioni protettive di PPAR gamma si esplichi antagonizzando la via di NFkB con meccanismi molecolari ancora non del tutto noti. Un altro gruppo di proteine protettive in condizioni di stress ossidativo è quello coinvolto nel mantenimento dell'omeostasi del ferro. Il >>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Vittorio COLANTUONI Università degli Studi del SANNIO di BENEVENTO

Obiettivo del Programma di Ricerca

Gli obiettivi di questo progetto di ricerca sono quelli di chiarire i meccanismi di regolazione dell'espressione genica in risposta allo stress ossidativo. A questo scopo verranno utilizzati diversi tipi di cellule in coltura, cellule primarie di origine neuronale e gliale nonché miocardiociti e un modello in vivo di ischemia/riperfusione.
Gli obiettivi specifici dell'Unità n.1 sono i seguenti:
1. Analizzare le interazioni e/o possibili interferenze fra la via di trasduzione di NFkB e quella dei PPARs, identificare i partners coinvolti e i meccanismi molecolari che le sottendono in cellule di origine intestinale e muscolare.
2. Riconoscere le proteine che sono qualitativamente e quantitativamente modificate nelle condizioni sperimentali, determinare eventuali loro modificazioni e complessi macromolecolari in cui sono presenti. Una volta determinata la loro sequenza primaria, si isoleranno i cDNAs e i geni corrispondenti. Dall'analisi strutturale e funzionale di questi ultimi si potrà chiarire il loro ruolo nella risposta allo stress ossidativo.
Gli obiettivi specifici dell'Unità n.2 sono i seguenti:
1. Analizzare i meccanismi molecolari di regolazione del metabolismo del ferro durante l'ipossia e la successiva riossigenazione con particolare riferimento all'attività ed espressione delle Iron Regulatory Proteins (IRP1 e IRP2), all'espressione di ferritina e dei trasportatori intracellulari di ferro (recettore della transferrina e DMT1) in >>>

Risultati parziali attesi

Unità 1
Delucidazione delle relazioni fra PPAR e NFkB e dei meccanismi responsabili della interferenza trascrizionale e/o dell'interazione fisica fra le due molecole in condizioni di stress ossidativo in diversi tipi cellulari.
Identificazione delle regioni dei due fattori che partecipano all'interazione e di possibili altri partners coinvolti.
Unità 2
Comprensione dei meccanismi di regolazione del metabolismo del ferro in differenti istotipi cellulari in condizioni di stress ossidativo indotto da ipossia e successiva riossigenazione.
Comprensione degli effetti dell'acido ossalomalico sull'attività delle proteine regolatrici del ferro (IRPs) e sulla biosintesi di ferritina durante l'ipossia e successiva riossigenazione al fine di una strategia terapeutica antiossidante
Unità 3
Delucidazione degli effetti dello stress ossidativo sulla trascrizione del gene per la ferrtina H.
Riconoscimento del ruolo che i fattori trascrizionali Sp1 e NF-Y svolgono nella risposta allo stress ossidativo.Unità 1
Identificazione delle specie proteiche che vanno incontro a modificazioni qualitative e quantitative dopo stress ossidativo, loro isolamento e determinazione della sequenza aminoacidica.
Analisi di librerie per isolare i cDNAs e i geni corrispondenti e successiva loro caratterizzazione allo scopo di studiare il loro ruolo nella risposta allo stress ossidativo.
Unità 2
Comprensione dei meccanismi di >>>

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

L'omeostasi cellulare si realizza attraverso una varietà di meccanismi che assicurano il mantenimento delle condizioni ottimali ad un determinato stato fisiologico. Alterazioni di questo delicato e fine meccanismo di regolazione rappresentano una condizione di stress che porta all'attivazione di diversi processi: dalla morte cellulare programmata, alla stimolazione di fenomeni infiammatori, alla proliferazione fino alla trasformazione neoplastica della cellula stessa.
Uno dei principali stimoli in grado di alterare l'omeostasi cellulare è lo stress ossidativo (1, 2). L'esposizione di una cellula a stimoli esogeni quali citochine, radiazioni ultraviolette, agenti chemioterapici, ipertermia, fattori di crescita o ischemia/riperfusione determina la produzione di alti livelli di specie reattive di ossigeno (ROS). I ROS si formano già in condizioni normali e in quantità costanti all'interno delle cellule come prodotti del metabolismo e come tali svolgono un ruolo importante nella trasduzione di segnali extracellulari. La loro produzione può essere anche catalizzata dal ferro (reazione di Fenton) attraverso il trasferimento degli elettroni dal Fe 2+/Fe3+ (3, 4). I ROS, d'altro canto, risultano particolarmente dannosi quando vengono prodotti ad alte concentrazioni perchè alterano il normale equilibrio redox della cellula generando uno stato di stress ossidativo (1, 2). Essi, infatti, tendono a ossidare molecole bersaglio quali lipidi, proteine e il DNA sia nucleare che >>>