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INIZIO_TESTO_DA_INDICIZZARE

PROGRAMMA DI RICERCA 2004

italiano - english
Unità di Ricerca
Programmi di ricerca simili:
Classificazione scientifico-disciplinare
Classificazione brevettuale
  • CHEMISTRY; METALLURGY
    • BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
      • MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES OR MICRO-ORGANISMS (immunoassay G01N33/53); COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
      • MICRO-ORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF (biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, containing micro-organisms, viruses, microbial fungi, enzymes, fermentates or substances produced by or extracted from micro-organisms or animal material A01N63/00; food compositions A21, A23; medicinal preparations A61K; chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings, absorbent pads or surgical articles A61L; fertilisers C05); PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICRO-ORGANISMS (preservation of living parts of humans or animals A01N1/02); MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA (micro-biological testing media C12Q)
Classificazione geografica
Bibliografia
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Parole Chiave
RETINOPATIA DIABETICA; PKC-BETA; PLA2; VEGF; RETINA; PERICITI; RATTI; PAZIENTI DIABETICI

MECCANISMI PATOGENETICI DELLA RETINOPATIA DIABETICA: RUOLO DELLA FOSFOLIPASI A2 E DELLA PROTEINA KINASI C BETA

Università degli Studi di Catania
Abstract
Saranno allestite colture di periciti in presenza (50mM) o in assenza (5mM) di alte concentrazioni di glucosio per differenti periodi di tempo (1-48h). Le stesse condizioni iperglicemiche potrebbero anche essere seguite includendo nel medium di coltura varie concentrazioni (2-20 microM) di prodotti finali di avanzata glicosilazione (AGEs), principalmente albumina glicata. In entrambi i modelli di cellule iperglicemiche e di periciti controllo saranno misurati i seguenti parametri:
a) rilascio di acido arachidonico;
b) espressione proteica di cPLA2 ed iPLA2;
c) espressione proteica di PKC-beta;
d) stato di fosforilazione di cPLA2 (ed eventualmente di iPLA2);
e) attività MAP chinasi (ERK e p38);
f) analisi semiquantitativa di mRNA di cPLA2 e iPLA2;
g) attivazione del promotore di cPLA2 e iPLA2.
Parallelamente si cercherà di raggiungere i seguenti obiettivi:
1)Esplorare la possibilità che, in periciti di retina, la PKCbeta e le proteine ELAV-like appartengano alla stessa cascata molecolare. In particolare, esamineremo l'ipotesi che l'innesco di questa via cellulare permetta una sintesi proteica localizzata in compartimenti specifici della cellula ed una selettiva protezione dalla degradazione dei messaggeri, quali VEGF, che sono bersaglio delle proteine ELAV-like. Infine, indagheremo se questa cascata cellulare è alterata in condizioni in grado di mimare la patologia diabetica; 2)Esplorare l'effetto del diabete >>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca
Filippo DRAGO Universita' degli Studi di CATANIA
Obiettivo del Programma di Ricerca
Il programma di ricerca si pone come obiettivi l'individuazione dei meccanismi patogenetici della retinopatia diabetica, più specificatamente capire il ruolo della Protein Kinasi C beta (PKC-beta) e dalla fosfolipasi A2 (PLA2). In particolare il programma prevede i seguenti obiettivi:
1. ESPERIMENTI IN VITRO
Saranno allestite colture di periciti in presenza (50mM) o in assenza (5mM) di alte concentrazioni di glucosio per differenti periodi di tempo (1-48h). Le stesse condizioni iperglicemiche potrebbero anche essere seguite includendo nel medium di coltura varie concentrazioni (2-20 microM) di prodotti finali di avanzata glicosilazione (AGEs), principalmente albumina glicata. In entrambi i modelli di cellule iperglicemiche e di periciti controllo saranno misurati i seguenti parametri:
a) rilascio di acido arachidonico;
b) espressione proteica di cPLA2 ed iPLA2;
c) espressione proteica di PKC-beta;
d) stato di fosforilazione di cPLA2 (ed eventualmente di iPLA2);
e) attività MAP chinasi (ERK e p38);
f) analisi semiquantitativa di mRNA di cPLA2 e iPLA2;
g) attivazione del promotore di cPLA2 e iPLA2.
Parallelamente si esplorerà la possibilità che, in periciti di retina, la PKCbeta e le proteine ELAV-like appartengano alla stessa cascata molecolare. In particolare, esamineremo l'ipotesi che l'innesco di questa via cellulare permetta una sintesi proteica localizzata in compartimenti specifici della cellula ed >>>

Risultati parziali attesi
Nei modelli cellulari saranno misurati i seguenti parametri:
a) rilascio di acido arachidonico;
b) espressione proteica di cPLA2 ed iPLA2;
c) espressione proteica di PKC-beta;
d) stato di fosforilazione di cPLA2 (e di iPLA2);
e) attività MAP chinasi;
f) analisi semiquantitativa di mRNA di cPLA2 e iPLA2;
g) attivazione del promotore di cPLA2 e iPLA2.
L'ossidazione e gli indici apoptotici (MDA, idroperossidi, espressione di Bax), insieme ai dati di immunoprecipitazione e di Western blotting, saranno anche misurati nei tessuti retinici ottenuti da ratti controllo e diabetici, trattati o no con uno specifico inibitore della PKC e forniti dall'unità di ricerca di Catania (prof. Drago).
Verrà inoltre indagato il coivolgimento della via PKCbeta/ELAV-like/VEGF in un modello cellulare neuronale: i periciti di retina
(forniti dall'Unità di Catania del Prof. Alberghina).
Ci aspettiamo che il trattamento con 100nM PMA induca nei periciti di retina la traslocazione della PKCbeta dal compartimento citosolico a quello sia di membrana che citoscheletrico. La chinasi C beta attivata potrebbe localizzare con le proteine ELAV-like in modo particolare nel citoscheletro e fosforilare le ELAV-like in serina e/o in treonina. Esperimenti preliminari condotti dal nostro gruppo su cellule umane di neuroblastoma sembrano infatti indicare che, dopo trattamento con PMA, un'altra PKC, la alfa, e le proteine ELAV-like neuronali >>>

Durata
24 mesi
Base di partenza scientifica nazionale o internazionale
L' iperglicemia associata al diabete mellito sembra essere un fattore determinante nello sviluppo delle complicazioni del diabete. Infatti, l'incidenza e la progressione della retinopatia diabetica sono state strettamente correlate con i livelli di emoglobina glicosilata da numerosi studi epidemiologici. Gli aspetti immediati della retinopatia sono stati così attribuiti agli effetti avversi dell'iperglicemia nei tessuti microvascolari. Elevati livelli di glucosio contribuiscono ad incrementare il flusso attraverso la via dei polioli, la produzione di Advanced Glycation Endproducts (AGE), e la generazione di Reactive Oxygen Species (ROS). D'altra parte, questi processi sembrano essere collegati ad un aumento di diacilglicerolo, un attivatore fisiologico della via della Protein-Kinasi C (PKC). Per esempio, un'esposizione cronica dei periciti della retina ad un AGE (methyglyoxal-modified bovine serum albumin) conduce ad un rilevante incremento di diacilglicerolo cellulare. Anche l'induzione di stress ossidativo può attivare la PKC e, quindi, varie vie sono probabilmente coinvolte. La PKC è una famiglia di enzimi che funzionano come componenti-segnale per una varietà di fattori di crescita, ormoni, neurotrasmettitori e citochine. Tra le differenti isoforme di PKC, l'isoforma beta (PKC-beta) è l'isoenzima predominante attivato nei tessuti vascolari durante l'iperglicemia. Il coinvolgimento della PKC-beta nelle complicazioni vascolari del diabete ha focalizzato l'interesse su >>>