RICERCA ITALIANA     

Transcrittomica e proteomica dello scompenso cardiaco umano per l'individuazione di nuovi meccanismi patogenetici e biomarcatori: focus sui recettori purinergici P2

Università degli Studi di Siena

Abstract

Fattori neuroumorali e citochine infiammatorie hanno un ruolo patogenetico nello scompenso di cuore (CHF) che rimane una causa maggiore di morbidità nonostante le terapie disponibili. Nuovi bersagli farmacologici sono pertanto possibili. Le purine e le pirimidine extracellulari mediano importanti effetti biologici attraverso recettori cellulari: recettori adenosinici/P1 e P2, che riconoscono ATP, ADP, UTP e UDP. I recettori P2 sono suddivisi in recettori che regolano canali ionici (P2X) e in recettori accoppiati a proteina G (P2Y). Ad oggi sono stati identificati 7 recettori P2X e 9 recettori P2Y. Dati preliminari suggeriscono che nel cuore umano sono espressi diversi sottotipi recettoriali P2X e P2Y insieme a recettori "P2-like" ancora non caratterizzati e che alcuni di questi recettori vanno incontro a modificazioni in corso di CHF. Non esistono dati sull'espressione dei diversi recettori P2X e P2Y nelle cellule mononucleate ematiche (PBMC), né in soggetti sani, né in CHF. Il presente progetto ha l'obiettivo di 1)studiare nei cuori espiantati dei pazienti CHF sottoposti a trapianto la presenza e l'espressione di tutti i recettori P2 clonati, versus controlli. Sarà valutata anche l'espressione di alcuni recettori "P2-like"; 2)determinare la presenza di recettori P2 in strutture di membrana altamente specializzate (raft lipidiche o caveole), per stabilire come la disfunzione miocardica possa alterarne la distribuzione in specifici domini e quindi il loro stato >>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Franco LAGHI PASINI Università degli Studi di SIENA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Parte dello studio sarà condotta su cellule mononucleate da sangue periferico (PBMC) di pazienti affetti da CHF(in confronto a soggetti normali), nonchè campioni di tessuto ventricolare sinistro derivante da miocardio di pazienti CHF cardiotrapiantati (in confronto a campioni di cuore di soggetti deceduti per cause non correlate a patologie cardiache). I campioni saranno forniti dall'Unità 1 Siena che provvederà alla selezione dei pazienti. Verranno arruolati 25 pazienti con CHF terminale (da cardiopatia ischemica o da cardiomiopatia dilatativa primitiva) consecutivamente valutati per l'inserimento in lista per trapianto di cuore.La ricerca si propone di:
- ANALIZZARE I CAMBIAMENTI DEL PROTEOMA CARDIACO CON SCOMPENSO. Saranno condotti studi di subproteomica in compartimenti cellulari specializzati del tessuto cardiaco per identificare modificazioni quantitative e qualitative che possano comparire durante lo sviluppo di CHF.
- DETERMINARE L'ESPRESSIONE DEI RECETTORI P2. Una mappa completa dei recettori P2X e P2Y cardiaci nel tessuto umano non è stata ancora delineata come pure sono lacunose le informazioni relative ad una loro eventuale alterata espressione durante CHF. Verrà quindi valutata l'espressione dei recettori P2 clonati, insieme a quella di alcuni recettori orfani a G-proteina correlati ai recettori P2Y. Per caratterizzare meglio quale tipo(i) cellulare sia responsabile dei cambiamenti nell'espressione del recettore P2, sarà effettuata la real-time >>>

Risultati parziali attesi

Alla fine della fase 1 i risultati attesi possono essere riassunti come segue:

a)Messa a punto da parte dell'Unità 1 di Siena delle tecniche di valutazione dell'espressione dei recettori P2 nei PBMC con la RT-PCR e con l'analisi western blot e, in un secondo tempo, per mezzo della real-time PCR. L'attenzione verrà focalizzata su quei recettori le cui modificazioni siano state dimostrate in omogenati cardiaci sulla base dei dati della Unità 2 di Milano;
b) Messa a punto da parte dell'Unità 2 di Milano dell'approccio metodologico allo studio della presenza e dell'espressione dei recettori P2 e degli oGPCR nelle caveolae isolate nei cuori umani e della tecnica per l'isolamento dei fibroblasti cardiaci da questo tessuto;
c)Messa a punto da parte dell'Unità 4 di Napoli della real-time PCR applicata allo studio dei recettori P2X e P2Y in singole cellule ottenute da cuori di topo con tecnica di microdissezione a cattura laser;
d) reclutamento di pazienti CHF in corso di valutazione per l'ingresso in lista per trapianto cardiaco; è ragionevole prevedere un numero di 4-5 pazienti arruolati nei primi quattro mesi;
e) in accordo con il punto d), 4-5 campioni di PBMC saranno conservati durante la prima fase;
f) conservazione di un certo numero di cuori espiantati da fornire alle altre Unità; sulla base del numero di trapianti cardiaci per anno a Siena (25-30), possiamo realisticamente prevedere che almeno 6-7 cuori espiantati saranno >>>

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

In questi ultimi anni, nel cuore di pazienti affetti da scompenso cardiaco (CHF) é stata identificata una ampia serie di alterazioni molecolari e cellulari (1-3). Si è così accumulata,tra l'altro, una vasta messe di dati sulle modificazioni funzionali di differenti famiglie di recettori di membrana, specialmente recettori adrenergici e recettori per l'angiotensina II(4-5). Comunque rimane ancora non chiarito l'eventuale nesso causale tra tali modificazioni ed il danno funzionale, la risposta al trattamento, la progressione di malattia ed il destino clinico dei pazienti.
Lo scompenso cardiaco è una patologia caratterizzata da una ridotta funzionalità sistolica, la cui eziopatogenesi rimane ancora parzialmente sconosciuta. Fattori neuro-ormonali (6) ed infiammatori (7-8) giocano un ruolo chiave sia nell'eziopatogenesi che nello sviluppo della disfunzione sistolica e quindi nella progressione della malattia. Le risposte biologiche che si instaurano nelle fasi iniziali della patologia agiscono dapprima come meccanismi compensatori ma possono, successivamente, compromettere definitivamente la funzionalità cardiaca. Sebbene gli agenti farmacologici attualmente impiegati, che hanno come bersaglio enzimi, recettori-canale o recettori accoppiati a proteine G, siano in grado di alleviare alcuni dei sintomi e di ridurre la mortalità, nella maggior parte dei casi non sono in grado comunque di arrestare il declino della funzionalità cardiaca, suggerendo che altri meccanismi >>>