RICERCA ITALIANA     

Caratterizzazione molecolare dell'eritropoiesi:analisi post-genomica e funzionale del profilo di espressione proteica

Università degli Studi di Napoli "Federico II"

Abstract

L'eritropoiesi è un processo maturativo finemente coordinato attraverso il quale si arriva all'eritrocita maturo partendo da una cellula staminale midollare totipotente. Sebbene siano stati identificati, clonati e caratterizzati numerosi geni coinvolti nel processo eritropoietico, la gran parte dei fini meccanismi molecolari in cui esso si articola e la loro successione temporale sono poco noti. Scopo generale del nostro progetto è quello di costruire una quadro dettagliato dei principali fenomeni che sottendono ad una corretta eritropoiesi, nell'ottica, nel contempo, di analizzare patologie le cui cause o meccanismi molecolari non sono stati chiariti.
Il progetto di ricerca include la valutazione bioinformatica dei profili di espressione genica delle cellule CD34+, BFU-E e CFU-E; profili già disponibili presso l'unità del coordinatore. Tali risultati serviranno per individuare, a livello trascrizionale, i principali eventi osservabili durante l'eritropoiesi. Essi saranno confermati, a livello proteico, da analisi per elettroforesi bidimensionale. Le principali proteine identificate saranno caratterizzate mediante spettrometria di massa, mentre le loro variazioni quantizzate tramite DIGE. Sempre in questo settore della ricerca si cercherà, mediante metodologie di biochimica e di biologia cellulare e molecolare, di caratterizzare gli interattori molecolari delle proteine identificate. In particolare, si cercheranno le proteine che riconoscono la stomatina, una >>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Achille IOLASCON Università degli Studi di NAPOLI "Federico II"

Obiettivo del Programma di Ricerca

L'obiettivo finale del progetto di ricerca proposto è quello di mettere in luce le complesse interazioni molecolari che si verificano durante l'eritropoiesi normale e patologica. Per ottenere questo scopo abbiamo unito diverse unità di ricerca aventi ognuna una grande esperienza nell'ambito delle ampie funzioni dei globuli rossi. Il programma comprende inoltre lo studio delle interazioni proteina-proteina che rappresenta la naturale evoluzione dell'era genomica e la descrizione semplice ma importante dei profili di espressione a livello di mRNA ed a livello proteico mediante elettroforesi bidimensionale. L'identificazione delle interazioni proteiche ci permetterà di ottenere informazioni dinamiche che rappresentano la base per la costruzione di una mappa funzionale del processo di maturazione dei globuli rossi.

Verranno descritti diversi specifici scopi del progetto che non rappresentano dei singoli obiettivi ma rappresentano dei pezzi di uno stesso puzzle:
1. Alcuni gruppi definiranno la mappa di espressione completa delle 3 maggiori popolazioni cellulari che sono presenti durante il differenziamento eritrocitario, CD34+, BFU-E e CFU-E. Il profilo di espressione verrà ottenuto sia a livello di mRNA che a livello proteico. La mappa di trascrizione attualmente disponibile almeno in parte nei laboratori partecipanti al programma dovrà inizialmente identificare i geni la cui espressione viene fortemente modulata durante l’eritropoiesi. Particolare >>>

Risultati parziali attesi

I risultati parzieli della prima fase possono essere così riassunti:
- mappa dei profili di espressione genica dell'eritropoiesi fisiologica
- mappa proteomica bidimensionale dell'eritropoiesi fisiologica
- modulazione delle proteine del ciclo cellulare durante la eritropoiesi
- caratterizzazione degli interattori di RPS19 nell'eritropoiesi fisiologica
- Analisi dei mutanti di band 3 e conseguenza sulla fisiologia dei diversi domains.Si appronteranno:
- profili di espressione genica durante la eritropoiesi in cellule affette da CDA-II
- Caratterizzazione funzionale del costrasportatore K-Cl
- Mappa proteomica degli stomatociti
- Analisi degli interattori di RPS19 in BD
- Folding della band 3 nella sferocitosiIdentificazione dei geni candidati per la stomatocitosi
Analisi del trasporto K-Cl nei talassemici e dell'esporessione della proteina stabilizzante AHSP e FECH
Identificazione delle mappe 2D in soggetti con stomatocitosi
Uso di farmaci in grado di manipolare HDAC sull'eritropoiesi
Studi sulla interazione di ACP e S100A10 con rps19

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il sistema ematopoietico può essere visto come una serie di compartimenti funzionali.
Il primo fenotipo cellulare che può essere facilmente identificato è rappresentato dalle cellule CD34+. Queste cellule possono essere raccolte da due differenti fonti: il cordone ombelicale e il midollo osseo.
CD34+ crescono in uno specifico mezzo in colture a lungo termine. Le colture sono bloccate in specifiche fasi riconoscibili come BFU-E o CFU-E. Dopo diverso tempo in queste colture è possibile osservare la presenza di elementi cellulari più maturi fino ad osservare la presenza di reticolociti.
Diversi fattori di trascrizione e di crescita giocano un ruolo durante i differenti steps dell’eritropoiesi. Per esempio è conosciuto che GATA1 e FOG sono fattori di trascrizione up-regolati durante il processo di maturazione dei globuli rossi. Allo stesso modo è stato dimostrato che l’up-regolazione di PU.1 (un altro importante fattore di trascrizione ematopoietico) causa nei precursori delle cellule eritroidi l’ arresto del differenziamento e l’induzione dell’apoptosi. Riguardo ai fattori di crescita specifici per l’eritropoiesi, è importante sottolineare il ruolo dell’eritropoietina.
Sebbene la maggioranza degli step eritropoietici sia stata delineata,una larga parte è ancora sconosciuta. Questi dati potrebbero consentire il riconoscimento di importanti proteine durante il processo di maturazione dei globuli rossi e di >>>