RICERCA ITALIANA     

Caratterizzazione di enzimi dotati di attività N-glicosilasica [proteine inattivanti i ribosomi (RIP)] come tools per applicazioni in campo bio-medico ed agrario.

Seconda Università degli Studi di Napoli

Abstract

Le proteine che inattivano i ribosomi (ribosome-inactivating proteins, RIP) delle piante sono enzimi che staccano adenina dall'rRNA (rRNA N-glicosilasi, EC 3.2.2.22) arrestando così la sintesi proteica, ed anche dal DNA ed altri polinucleotidi, fra cui le "code" di poli(ADPriboso) della poli(ADPriboso) polimerasi (PARP) (attività polinucleotide adenina glicosilasica). Le RIP sono proteine o di tipo 1, costituite da una sola catena con attività enzimatica, o di tipo 2, costituite da una catena enzimatica A legata ad una catena B con proprietà lectiniche. La catena B si lega a residui di galattoso sulla superficie delle cellule, permettendo l'entrata in esse della catena A. Fra le RIP tipo 2 vi sono delle potenti tossine (la ricina e tossine simili) ma anche altre lectine, che però non sono tossiche, pur avendo struttura e proprietà enzimatiche simili.
Le RIP hanno attività antivirale e antifungina ed attualmente sono usate a scopo sperimentale (i) per la produzione di piante transgeniche resistenti a parassiti e (ii) come componente tossica di immunotossine per la terapia dei tumori e di disordini immunitari.
Le RIP sono largamente diffuse tra le Angiosperme. Risultati preliminari ottenuti soprattutto nei nostri laboratori indicano che le RIP: (i) sono presenti anche in piante eduli; (ii) possono depurinare i nuclei in cellule intere; (iii) possono interferire con i sistemi di riparazione del DNA, deadenilando strutture regolatrici ["code" di >>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Augusto PARENTE Seconda Università degli Studi di NAPOLI

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il programma di ricerca qui proposto, benché sia in linea con gli studi sulle proteine che inattivano i ribosomi (RIP) portati avanti in questi anni da parte di tutte le unità partecipanti al progetto, è diretto all'accertamento di alcuni aspetti decisamente innovativi.
Gli obiettivi principali del progetto sono:
1. Identificazione, caratterizzazione e clonaggio di RIP presenti in piante (anche eduli). La conoscenza della concentrazione e delle proprietà di queste proteine sarà molto utile per valutarne i possibili effetti negativi (ad es. sono potenzialmente allergeni assai potenti), ma anche per determinare il livello di sicurezza di piante transgeniche contenenti geni RIP al fine di indurre resistenza contro patologie virali e fungine;
2. La caratterizzazione dei bersagli enzimatici delle RIP intra-cellulari appena identificati (poli(ADPriboso)) o possibilmente identificati nel corso di questo progetto dovrebbe consentirci di chiarire i meccanismi di tossicità delle RIP per le cellule, meccanismi sino ad ora non completamente compresi. La comprensione delle modalità di danno intra-cellulare sarà assai utile in vista dell'uso delle RIP come componente tossica delle immunotossine a scopi terapeutici, in modo particolare se si ricercano effetti sinergici con altri farmaci;
3. La messa a punto di un efficiente sistema di espressione eucariotico in lievito metilotrofico Pichia pastoris;
4. La valutazione di immunotossine ricombinanti contro >>>

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Le proteine che inattivano i ribosomi (ribosome-inactivating proteins, RIPs) di origine vegetale sono enzimi classificabili o come tipo 1, proteine a catena singola, o come tipo 2, composte da una catena A con attività enzimatica e da una catena B con le proprietà di una lectina che lega carboidrati contenti galattoso (rassegna in Barbieri et al., 1993; Van Damme et al., 2001).
Le proteine che inattivano i ribosomi hanno numerosi effetti su sistemi cellulari e su organismi: (i) le RIP di tipo 2 si legano a residui di galattoso sulla superficie cellulare, entrando quindi nelle cellule, dove la catena A si separa ed esercita la sua attività enzimatica; questa proprietà conferisce una elevata tossicità solo ad alcune RIP di tipo 2 (ricina e tossine simili); (ii) tutte le RIP saggiate hanno attività antivirale contro virus degli animali o delle piante (rassegna in Wang and Tumer, 2000); (iii) l'espressione di una RIP da Phytolacca heterotepala in piante di tabacco porta ad un aumento della resistenza a funghi (Corrado et al. 2005); (iv) le RIP di tipo 1 hanno proprietà abortive (review in Barbieri et al., 1993); (v) le RIP di entrambi i tipi sono in grado di trasformare cellule a dosi subletali (Barbieri et al., 2003) e (vi) almeno alcune di esse sono potenti allergeni (Stirpe, osservazioni non pubblicate).
RIP sono presenti in molti tessuti vegetali ed in alcuni batteri, ad es. Shighella (Paton and Paton, 1998). Vi sono indicazioni che esse possano >>>