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PROGRAMMA DI RICERCA 2006
italiano - english
Unità di Ricerca
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Classificazione scientifico-disciplinare
- Area scientifico disciplinare: Scienze fisiche
Classificazione brevettuale
- CHEMISTRY; METALLURGY
- BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES OR MICRO-ORGANISMS (immunoassay G01N33/53); COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
Classificazione geografica
- Regione: Lombardia
Bibliografia
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Parole Chiave
SINGOLA MOLECOLA, GREEN FLUORESCENT PROTEIN, SOTTOSTATI CONFORMAZIONALI, DINAMICA FUNZIONALE DI PROTEINE, FOLDING E UNFOLDING, ENERGIA LIBERA CONFORMAZIONALE, INCAPSULAZIONE IN GEL DI SILICE, FLUORESCENZA, DICROISMO CIRCOLARESOTTOSTATI CONFORMAZIONALI E PERCORSI DI FOLDING-UNFOLDING NELLA GREEN FLUORESCENT PROTEIN: STUDIO SPERIMENTALE E TEORICO ALLA RICERCA DI STATI DISCRETI NELLE PROTEINE
Università degli Studi di Milano-BicoccaAbstract
La composizione chimica delle proteine, numero e tipo di amminoacidi, determina la loro struttura tridimensionale. La loro dinamica è caratterizzata da rapide vibrazioni sovrapposte a lente modificazioni strutturali in un panorama energetico con un vasto numero di minimi quasi iso-energetici. Ognuno di questi minimi corrisponde a un particolare sottostato conformazionale della proteina. Fra tutte le proteine, la GFP (Green Fluorescent Protein) è un candidato ideale per lo studio di questi processi. La GFP è naturalmente fluorescente e il suo cromoforo è sensibile al suo micro-circondario. Questo programma è dedicato allo studio della molteplicità di stati conformazionali di mutanti della GFP.L’evidenza diretta dei sottostati è stata provata solo indirettamente tramite misure di insieme, ma i recenti progressi nella spettroscopia di singola molecola, rendono oggi questo risultato raggiungibile. In questo progetto studieremo la fluorescenza di singoli mutanti della GFP immobilizzati in matrici solide, e la metteremo a confronto con simulazioni numeriche. Questo programma è basato su una stretta collaborazione di tre gruppi di ricerca con provate competenze in aree scientifiche complementari: spettroscopia in fluorescenza di singola molecola con eccitazione a singolo e doppio fotone ad alta risoluzione spaziale e temporale (MIB); espressione, purificazione e incapsulamento in gel di silice di mutanti di GFP e caratterizzazione spettroscopica di insieme (PR); approcci >>>
Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca
Giancarlo Baldini Università degli Studi di MILANO-BICOCCAObiettivo del Programma di Ricerca
L’obiettivo principale del programma è la caratterizzazione degli stati nativi della proteina GFP e della loro evoluzione durante il processo di “unfolding”. Questo scopo sarà raggiunto principalmente per mezzo di spettroscopia di singola molecola su mutanti della GFP intrappolati in gel di silice, e di simulazioni numeriche della dinamica interna delle proteine, da confrontarsi con i dati sperimentali.Gli obiettivi specifici sono:
A) studio spettroscopico sperimentale a livello di singola molecola (Milano-Bicocca,MIB) dei sottostati nativi del mutante GFPmut2 in gel di silice idratati (Parma,PR). Questo mutante è particolarmente brillante e si può produrre con alta efficienza. Due delle unità (MIB,PR) hanno caratterizzato a fondo la fluorescenza di questa proteina, in termini di blinking di fluorescenza e di interconversione fra l’emissione blu e verde caratteristiche degli stati neutro e anionico del cromoforo della proteina. Proponiamo in questo progetto di assumere la velocità di interconversione Anionico/Neutro (A/N) come un parametro chiave per studiare i sottostati della proteina e la loro dinamica. Questo è basato su dati precedentemente raccolti presso le unità MIB e PR.
B) In parallelo effettueremo paragoni dei dati sperimentali con simulazioni numeriche (SISSA) su questo mutante. L’unità SISSA effettuerà una caratterizzazione teorico/topologico/simulativa delle transizioni fra sottostati nella GFPmut2. Un modello recentemente sviluppato dal >>>
Durata
24 mesiBase di partenza scientifica nazionale o internazionale
Generalità sul meccanismo di folding/unfoldingLe proteine sono polipeptidi composti tipicamente da centinaia-migliaia di ammino-acidi che si ripiegano in specifiche strutture tridimensionali. Nell’ultimo decennio c’è stato un notevole aumento di studi sulla cinetica e la termodinamica delle proteine con l’ausilio di strumenti e concetti presi a prestito dalla meccanica statistica e dalla fisica della materia condensata.
La ragione dell’interesse del mondo della biofisica per i biopolimeri è dovuta per la maggior parte alle loro proprietà uniche se comparate a quelle di etero-polimeri casuali.
La principale di queste differenze è costituita dalla capacità delle proteine di ripiegarsi (foldarsi) rapidamente nel loro stato nativo, che è la conformazione in cui la proteina funziona correttamente da un punto di vista biologico (Daura 1997). Lo stato nativo della proteina viene determinato dalla specifica sequenza di amminoacidi della proteina che è codificata geneticamente. Le proteine, tuttavia, non hanno strutture rigide e possono avere un’ampia varietà di rapide vibrazioni e di più lenti riarrangiamenti strutturali, generalmente indicati come “transizioni strutturali”. Questa situazione può essere riassunta da uno schema mono-dimensionale del complesso diagramma energetico multi dimensionale (circa 10000 coordinate configurazioni) della proteina (energy landscape), che determina la sua dinamica, come originariamente suggerito da Hans Frauenfelder >>>



