RICERCA ITALIANA     

Individuazione di determinanti di folding e misfolding mediante mutagenesi sistematica

Università degli Studi di Firenze

Abstract

L’amiloidosi associata alla dialisi è una grave ed inevitabile complicazione dell’emodialisi a lungo termine ed è caratterizzata dall’accumulo, in alcuni tessuti dell’organismo come il muscolo scheletrico, di aggregati fibrillari, detti amiloidi, della proteina beta-2-microglobulina (b2-m). Questo progetto di ricerca si prefigge di ampliare le conoscenze attuali sul ruolo sia di determinati residui della sequenza della beta-2-microglobulina (b2-m), che delle sue diverse regioni strutturali nei processi di folding e di aggregazione. Il progetto si articolerà in più fasi, ognuna delle quali spesso prevede la collaborazione di più Unità di Ricerca (UR). Tali fasi sono:
1) Progettazione di mutazioni e preparazione di mutanti della b2-m. Verrà progettato un numero di mutazioni tale da permettere di studiare sia il processo di folding che quello di aggregazione della proteina.
2) Studio della struttura dei mutanti in soluzione mediante risonanza magnetica nucleare (NMR) standard 1D ed eteronucleare 2D e 3D. Si otterranno comparazioni strutturali tra i mutanti da analisi di pattern di attenuazione paramagnetica in presenza ed assenza di uno spin label oppure da pattern di accessibilità differenziale del solvente. Si otterranno informazioni di tipo dinamico sui profili di mobilità segmentale dei mutanti e informazioni dettagliate sulla stabilità dei diversi elementi di struttura secondaria della proteina. Verranno poi effettuate misure di real-time NMR, in grado di >>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Fabrizio Chiti Università degli Studi di FIRENZE

Obiettivo del Programma di Ricerca

L’amiloidosi associata alla dialisi è una grave ed inevitabile complicazione dell’emodialisi a lungo termine. In questa condizione patologica, aggregati proteici noti come fibrille amiloidi si accumulano in tessuti indispensabili per una corretta funzionalità dell’organismo, come il muscolo scheletrico, interferendo con le loro normali funzioni. Un principale costituente delle fibrille amiloidi associate a questa patologia è la proteina beta-2-microglobulina (b2-m). Il progetto di ricerca qui descritto si prefigge di caratterizzare a livello molecolare gli eventi di folding ed aggregazione (o misfolding) di questa proteina.
Il primo obiettivo del progetto è investigare, a livello residuo specifico, il processo di folding di b2-m, ossia il meccanismo di conversione di questa proteina dalla forma destrutturata alla forma nativa e funzionale. Ci baseremo su modelli di folding precedentemente proposti sia da Unità di Ricerca partecipanti a questo PRIN che da altri gruppi di ricerca internazionali, per investigare il processo di folding a risoluzione molecolare. Ci proponiamo infatti di identificare i residui che partecipano alla formazione ed alla stabilità sia dello stato nativo che dei vari stati parzialmente strutturati che risultano essere popolati durante il processo di folding.
Il secondo obiettivo del programma è determinare, con simile risoluzione molecolare, i residui o le regioni della sequenza che promuovono il processo di aggregazione amiloide di b2-m >>>

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Le amiloidosi sono un gruppo eterogeneo di malattie caratterizzate dall'aggregazione patologica di proteine solubili in fibrille insolubili, che si accumulano nei tessuti causando un danno irreversibile (1). Negli ultimi anni l'UR di Pavia ha caratterizzato un significativo numero di proteine amiloidogeniche isolate da fonti naturali, in particolare ha caratterizzato le diverse isoforme di b2-m presenti nei depositi amiloidi di diversi pazienti affetti da DRA. La b2-m nativa è una proteina di 99 AA in cui è presente il motivo strutturale a sette beta strands caratteristico della superfamiglia delle immunoglobuline. Fisiologicamente la b2-m rappresenta la catena leggera non polimorfica dell’MHCI. Durante il suo normale catabolismo, si dissocia dal complesso e tramite il flusso sanguigno viene trasportata ai reni dove viene per la maggior parte degradata (2). Nei pazienti emodializzati (circa 25000 in Italia) la concentrazione di b2-m aumenta da 20 a 50 volte e, secondo un meccanismo non ancora ben conosciuto, la proteina va incontro ad un processo di autoaggregazione responsabile della formazione di fibrille amiloidi, che si accumulano prevalentemente a livello del sistema muscolo scheletrico (3). Nei depositi amiloidi la b2-m è presente per la maggior parte come proteina completa, tuttavia una significativa percentuale di b2-m fibrillare (circa 30%) è costituita da una forma proteolizzata della proteina priva dei primi sei residui (DN6b2-m) (4,5). Il gruppo della >>>