RICERCA ITALIANA     

Meccanismi molecolari di regolazione delle ATPasi di tipo P: autoinibizione e interazione con molecole regolative di due ATPasi di pianta

Università degli Studi di Milano

Abstract

Questo progetto si prefigge di indagare a livello funzionale e strutturale il meccanismo di autoinibizione di due ATPasi di tipo P di pianta - la Ca-ATPasi e la H-ATPasi della membrana plasmatica - e la loro regolazione in seguito all’interazione con molecole regolative. Queste due pompe sono caratterizzate da un esteso dominio terminale citosolico che contiene un dominio autoinibitorio, la cui azione può essere soppressa dall’interazione con proteine regolative (rispettivamente calmodulina e proteine 14-3-3).
L’analisi verrà condotta utilizzando specifiche isoforme di Ca-ATPasi (ACA8) e di H-ATPasi (AHA1) di Arabidopsis thaliana, espresse in Saccharomyces cerevisiae. Oltre all’analisi funzionale dell’interazione fra pompe e molecole regolatrici, si affronterà in questo progetto anche l’analisi strutturale tramite NMR e cristallografia. I laboratori dei proponenti hanno una consolidata esperienza nelle metodologie biochimiche e biologico-molecolari necessarie allo sviluppo del progetto; nella UR2 sono presenti competenze avanzate nell’analisi della struttura di proteine in soluzione mediante spettroscopia NMR; per l’analisi cristallografica ci si avvarrà della collaborazione, già avviata, con il laboratorio del Prof. Martino Bolognesi (Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie, Università di Milano).
In particolare verranno sviluppati i seguenti punti:
1. REGOLAZIONE DELLA Ca-ATPasi E DELLA H-ATPasi DA FOSFOLIPIDI:
1a – regolazione >>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Maria Ida De Michelis Università degli Studi di MILANO

Obiettivo del Programma di Ricerca

L’obiettivo principale di questo progetto è comprendere il meccanismo attraverso cui l’esteso dominio C- o N-terminale (C-te, N-te) di alcune ATPasi di tipo P esercita un’azione autoinibitoria sull’attività dell’enzima e come questa azione venga inibita in seguito all’interazione con molecole regolative. In particolare verranno analizzate una isoforma di Ca-ATPasi (ACA8) e una di H-ATPasi (AHA1) della membrana plasmatica di Arabidposis thaliana, i cui domini terminali legano rispettivamente calmodulina e proteine 14-3-3.
Uno degli obiettivi più ambiziosi è saggiare l’ipotesi che, nonostante la diversa localizzazione, struttura e selettività per proteine regolative, i domini regolativi terminali di diverse ATPasi di tipo P abbiano un simile meccanismo di autoinibizione. A questo scopo produrremo e analizzeremo dei mutanti di ACA8 in cui N-te sia spostato al C-te della proteina e delle chimere in cui N-te di ACA8 sia fuso ad AHA1 costitutivamente attiva perché priva del suo C-te o, viceversa, il C-te di AHA1 sia fuso a ACA8 priva del suo N-te e pertanto costitutivamente attiva. Se le chimere risulteranno autoinibite, costituiranno una forte evidenza a favore dell’ipotesi che esista un comune meccanismo di autoinibizione, con implicazioni di grande interesse non solo in biologia vegetale poiché le ATPasi di tipo P sono presenti in tutti gli organismi.
Le due ATPasi di tipo P prese in considerazione sono implicate in una varietà di funzioni essenziali nella cellula >>>

Risultati parziali attesi

I principali risultati attesi dallo sviluppo di questo progetto di ricerca per quanto riguarda la H-ATPasi e la sua regolazione da parte delle proteine 14-3-3, sono:
- la definizione del ruolo del dominio C-terminale (C-te) delle proteine 14-3-3, e in particolare degli aminoacidi acidi che esso contiene in tutte le isoforme, nella interazione con la H-ATPasi;
- la definizione del ruolo dei residui aminoacidici presenti nella sequenza di modo III della H-ATPasi nell’interazione con 14-3-3;
- la determinazione della struttura in soluzione del C-te della H-ATPasi e delle sue variazioni in seguito ad interazione con 14-3-3;
- la definizione del ruolo dell’acido fosfatidico, di cui è stata riportata la capacità di legare 14-3-3, nella regolazione della H-ATPasi.

Per quanto riguarda la Ca-ATPasi nel biennio del progetto ci aspettiamo di:
- caratterizzare l’effetto sull’attività enzimatica dei fosfolipidi acidi, identificando il/i sito/siti cui essi si legano;
- determinare la struttura in soluzione del suo dominio N-terminale (N-te) e le sue variazioni in seguito ad interazione con calcio-calmodulina;
- ottenere una prima struttura cristallografica della proteina, utilizzando il WT o un mutante deleto di N-te;
- determinare se il dominio autoinibitorio N-te è in grado di effettuare la sua azione anche se spostato al C-te della proteina.

Il risultato di questo ultimo punto è strettamente attinente >>>

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Le ATPasi tipo P sono una superfamiglia di pompe di membrana che utilizzano l’energia d’idrolisi dell’ATP per il trasporto di soluti, prevalentemente ioni, contro il loro gradiente elettrochimico (1,2). La somiglianza complessiva fra singoli membri è bassa, ma essi contengono otto sequenze caratteristiche altamente conservate nella testa catalitica. I membri meglio conosciuti di questa superfamiglia sono le Ca-ATPasi, la Na/K-ATPasi e la H-ATPasi eucariotiche, che appartengono a famiglie strettamente correlate. In queste proteine, l’unità principale della molecola, che può essere accompagnata da subunità regolative come nella Na/K-ATPasi, è un polipeptide che attraversa la membrana 10 volte con due estesi loop citosolici che formano la testa catalitica (1,2). La prima struttura tridimensionale ad alta risoluzione risolta è quella della Ca-ATPasi del reticolo sarcoplasmico (SERCA), che è stata cristallizzata in diversi stati conformazionali (3,4). Tuttavia, le informazioni derivanti da strutture parziali o a bassa risoluzione di altre ATPasi tipo P suggeriscono che ci sia un arrangiamento comune dei domini; questo è stato confermato dalle strutture ad alta risoluzione della Na/K-ATPasi e della H-ATPasi della membrana plasmatica (PM) delle cellule vegetali (5,6).
I domini N- e C-terminali (N-te, C-te) delle ATPasi tipo P sono entrambi citosolici e di lunghezza variabile. Domini terminali estesi possono contenere siti regolativi che esercitano un’azione autoinibitoria >>>