RICERCA ITALIANA     

METABOLISMO E SISTEMI MOLECOLARI PER LA BIOTRASFORMAZIONE DI MOLECOLE AROMATICHE

Università degli Studi di Napoli "Federico II"

Abstract

Il presente progetto di ricerca è finalizzato all’incremento delle conoscenze sui microrganismi capaci di degradare sostanze aromatiche, dei sistemi enzimatici coinvolti e della loro regolazione genica, con attenzione alla potenziale applicabilità delle conoscenze per lo sviluppo di biosistemi sintetici da impiegare in processi di biorisanamento e di biotrasformazione.
I pathway per il catabolismo aerobico delle molecole aromatiche sono generalmente divisi in due segmenti: il cosiddetto upper pathway, che, utilizzando sistemi ossigenasici, porta ad intermedi aromatici ossidati, ed un lower pathway che a partire da reazioni di apertura dell’anello aromatico di molecole diossidrilate, le modifica fino a intermedi del ciclo dell’acido citrico. È evidente quindi l’enorme potenzialità applicativa di questi sistemi purché siano disponibili dettagliate informazioni molecolari sui sistemi enzimatici coinvolti e sulla loro regolazione genica. Le possibilità di impiego dei microrganismi potranno essere ampliate e migliorate: (i) caratterizzando nuovi microrganismi e nuovi sistemi enzimatici per disporre di un ampio spettro sia di sistemi dotati di differenti capacità metaboliche che di enzimi a differente specificità; (ii) studiando la regolazione trascrizionale ed i determinanti molecolari delle attività enzimatiche di sistemi già noti e di quelli che saranno disponibili nel corso del progetto. Inoltre, allo scopo di valutare l’importanza delle conoscenze acquisite ai fini >>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Alberto Di Donato Università degli Studi di NAPOLI "Federico II"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il progetto di ricerca ha come obiettivo lo studio dei processi metabolici per la degradazione delle sostanze aromatiche. Al fine di acquisire un ampio spettro di informazioni sui microrganismi dotati di questa capacità lo studio perseguirà i seguenti obiettivi: (1) l’individuazione di nuove specie batteriche e di sistemi enzimatici, e l’analisi di genomi già sequenziati; (2) lo studio, sia strutturale che funzionale, di sistemi enzimatici già disponibili ai proponenti, o che verranno isolati nel corso del progetto; (3) l’approfondimento dei meccanismi di regolazione trascrizionale di sistemi batterici già caratterizzati dai proponenti anche allo scopo di verificare se la combinazione razionale di differenti vie metaboliche o di differenti sistemi degradativi consente lo sviluppo di nuovi sistemi di trasformazione di molecole aromatiche; (4) l’individuazione di ospiti batterici mesofili e psicrofili per il design razionale di nuovi biocatalizzatori; (5) l’utilizzo delle conoscenze acquisite attraverso i precedenti obiettivi al fine di verificarne l’applicabilità ai processi di a) biorisanamento di reflui industriali; b) utilizzo delle capacità enzimatiche di monossigenasi per la messa a punto di protocolli di biosintesi di antiossidanti e di molecole multifunzionalizzate per l’industria farmacologica e la chimica fine.
Di seguito sono riportate in dettaglio le articolazioni di ciascun obiettivo.

1) Individuazione di nuove specie batteriche e di sistemi >>>

Risultati parziali attesi

Il progetto di ricerca si articola in 5 obiettivi fondamentali per i quali sono attesi i seguenti risultati:

1) INDIVIDUAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DI NUOVE ATTIVITÀ OSSIGENASICHE BATTERICHE.
A) Isolamento e caratterizzazione di microrganismi capaci di crescere utilizzando almeno due fra i composti aromatici policiclici prescelti (antracene, fenantrene, naftalene). Determinazione delle curve di crescita in un range di temperature comprese tra 4 e 37ºC, in un intervallo di salinità compreso tra 0 e 0.5 M di NaCl e determinazione dei substrati aromatici ed alifatici che possono essere utilizzati come unica fonte di carbonio e di energia.
B) Analisi bioinformatica ed individuazione delle orfs codificanti per monoossigenasi multicomponente. Compilazione di alberi filogenetici per stabilire le relazioni evolutive con le BMM note fino ad ora il che permetterà di ipotizzare la specificità di substrato delle nuove ossigenasi individuate. Identificazione delle sequenze codificanti contenute all’interno di queste regioni e predizioni di specificità di substrato. Ipotesi dei ceppi batterici più promettenti. Isolamento e caratterizzazione dei ceppi per la loro capacità di crescere su substrati aromatici.
C) Identificazione di geni codificanti sistemi ossigenasici. Sequenziamento dei geni individuati. Clonaggio di un numero limitato di geni di interesse in E.coli e/o P. putida. Messa a punto delle condizioni ottimali per l’overespressione dei prodotti >>>

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Lo studio di microrganismi batterici in grado di trasformare composti aromatici risulta di particolare interesse in quanto tali molecole sono ubiquitariamente presenti in ambienti inquinati. Gli idrocarburi aromatici, che costituiscono importanti componenti del petrolio e dei suoi derivati, tendono ad accumularsi negli ecosistemi a causa della loro intrinseca stabilità chimica e sono altamente inquinanti e deleteri per la salute dell’uomo in quanto tossici, mutageni e cancerogeni.
Nei batteri dotati della capacità di trasformare molecole aromatiche i pathway catabolici per la loro degradazione possono essere suddivisi in due segmenti: il primo, l’upper pathway, consiste in una serie di successive e specifiche reazioni di ossidrilazione dell’anello aromatico che portano alla formazione di catecoli. Nel secondo stadio, il lower pathway, le molecole diossidrilate sono convertite in intermedi del ciclo di Krebs e convertite in acqua e anidride carbonica. L’upper pathway è uno snodo fondamentale di tutto il pathway metabolico poiché determina quali molecole possono essere degradate in base alla specificità degli enzimi che lo costituiscono. Pertanto particolare attenzione è stata rivolta allo studio delle monossigenasi batteriche multicomponente (BMM) che generalmente costituiscono i primi enzimi dell’upper pathway.
Le BMM: aspetti funzionali
Le BMM sono una famiglia ampia ed eterogenea di enzimi che condividono la capacità di ossidrilare idrocarburi >>>