RICERCA ITALIANA     

Interattomi proteici: identificazione e caratterizzazione di network cellulari in differenti condizioni fisiopatologiche

Università degli Studi di Napoli "Federico II"

Abstract

I sistemi cellulari dipendono da complessi multiproteici nei quali singole proteine si associano in moduli funzionali. Molti prodotti genici mediano la loro funzione all’interno di reti macromolecolari con proprietà topologiche e dinamiche che riflettono fenomeni biologici. La comprensione di meccanismi biologici e di processi patogenici richiede uno studio globale della struttura, della funzione e delle dinamiche delle reti nelle quali le stesse macromolecole funzionano.
Utilizzando metodologie di biochimica, biologia molecolare e di proteomica, il nostro progetto mira a identificare, caratterizzare e descrivere gli interattori proteici di tre proteine coinvolte in diversi meccanismi fisiopatologici per generare un modello funzionale che sarà implementato da un’accurata analisi bioinformatica.
Ciascuna delle unità contribuirà al progetto in base alle proprie specifiche competenze e potenzialità tecnico-scientifiche.
L’Unità I del Prof. Salvatore e l’Unità II della Prof Orrù studieranno la funzione del putativo fattore trascrizionale AF4, coinvolto nella patogenesi di alcuni tipi di leucemia linfoblastica acuta, e dell’enzima glicolitico cervello-specifico, aldolasi C, per il quale è stata ipotizzata attività “moonlight” ed evidenziata la capacità di legare la proteina prionica. Entrambe le proteine sono coinvolte nella patogenesi di malattie neurodegenerative.
L’Unità I utilizzerà tecnologie ad hoc (sistema del doppio ibrido >>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Francesco Salvatore Università degli Studi di NAPOLI "Federico II"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Lo scopo del progetto è identificare, caratterizzare e descrivere funzionalmente, utilizzando metodologie di biochimica, biologia molecolare e di proteomica, gli interattori proteici di tre proteine coinvolte in diversi pathway fisiopatologici per generare un modello meccanicistico che sarà implementato da un’approfondita analisi bioinformatica.
Saranno utilizzati vari sistemi per l’identificazione di interazioni (sistema del doppio ibrido, co-immunoprecipitazione, GST pull-down, metodologie proteomiche e bioinformatiche) per far luce sulla funzione 1) del putativo fattore trascrizionale AF4, coinvolto nella patogenesi di leucemie e di malattie neurodegenerative; 2) dell’enzima glicolitico, cervello-specifico aldolasi C, per il quale è stata ipotizzata attività “moonlight” oltre che evidenziata capacità di legare la proteina prionica; 3) le catene leggere monoclonali amiloidogeniche, coinvolte nella patogenesi dell’amiloidosi sistemica.
Ciascuna delle unità contribuirà al progetto in base alle proprie specifiche competenze e potenzialità tecnico-scientifiche.
AF4 e l’aldolasi C sono espresse specificamente anche nelle cellule del Purkinjie del cervello. AF4 è mutata nel topo robotico, un modello di atassia cerebellare autosomica dominante. La mutazione causativa, localizzata in una regione conservata di AF4, riduce l’affinità di legame tra AF4 e la proteina Siah-1a, interattore di AF4 nel cervello. Ciò comporta un rallentamento del meccanismo degradativo >>>

Risultati parziali attesi

PROTEOMICA FUNZIONALE DI AF4. I principali risultati attesi da questo studio sono:
• identificazione dell’interattoma del frammnto C-terminale di AF4
• isolamento del complesso di regolazione della trascrizione che contiene AF4
• Identificazione dei geni target che se alterati possono provocare leucemia o neurodegenerazione
• Identificazione di interattori diretti che potrebbero dare informazioni circa la funzione e la regolazione di AF4
I nostri esperimenti potranno identificare i potenziali partner e la bioinformatica ne verificherà l’appartenenza complesso di regolazione della trascrizione di AF4. Abbiamo già identificato vari interattori di AF4 utilizzando come esca il peptide N-terminale, contenente il dominio di transattivazione. Abbiamo trovato la chinasi p-TEFb e la proteina 14-3-3 teta. Le proteine 14-3-3 sono coinvolte sia in pathways oncogenici che nella patogenesi di malattie neurodegenerative. Esse riconoscono e legano proteine fosforilate, regolandone tra l’altro il folding e la localizzazione cellulare. La funzione di AF4 è regolata dalla fosforilazione, quindi il legame con 14-3-3 potrebbe avere un ruolo chiave. Per scoprire il significato della interazione diretta ipotizzata tra AF4 e 14-3-3 teta, saranno analizzati mediante metodi bioinformatici e computazionali domini discreti di AF4 per definire il dominio di interazione con 14-3-3 teta e per identificare i siti di fosforilazione che mediano tale legame. Inoltre, lo >>>

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

I sistemi cellulari dipendono da complessi multiproteici nei quali singole proteine si associano in moduli funzionali (1,2). Molti prodotti genici mediano la loro funzione all’interno di reti di macromolecolari con proprietà topologiche e dinamiche che riflettono fenomeni biologici (3,4). Per comprendere la funzione e le dinamiche delle reti nelle quali le stesse macromolecole funzionano, sono state sviluppate una serie di metodologie ad alta efficienza per individuare le interazioni, tra queste il sistema del doppio ibrido (5,6), metodologie proteomiche, (7,8), metodi "in silico" di predizione delle interazioni (9-14). In particolare, la proteomica ha potenzialità di individuare tutte le proteine coinvolte in un determinato processo cellulare e di determinare variazioni dell'espressione proteica tra due stati cellulari diversi. Nel tentativo di fornire informazioni sulle funzioni biologiche di singole proteine, la “proteomica funzionale” analizza le proprietà spaziali e temporali delle reti molecolari e dei flussi nelle cellule viventi. Nella cellula, molti processi sono modulati non solo dall'abbondanza relativa delle proteine, ma anche dalla regolazione rapida e transiente dell'attività, dell'associazione e della localizzazione di proteine e di complessi proteici (15). La strategia più semplice per l'identificazione di proteine che interagiscono in vivo, anche in maniera transiente, con uno specifico target consiste nell'utilizzare >>>