RICERCA ITALIANA     

Aspetti spaziotemporali nella fisiologia e patologia cellulare dei segnali mediati dai secondi messaggeri

Università degli Studi di Padova

Abstract

Il progetto è presentato da un gruppo di ricercatori che condividono l’interesse nei meccanismi di segnale controllati da secondi messaggeri, in particolare Ca2+ e nucleotidi ciclici. Le Unità condividono molti approcci metodologici e utilizzano diversi modelli sperimentali. Gli obiettivi specifici sono coordinati e mirati ad una migliore comprensione di un problema chiave nella biologia cellulare (regolazione e bersagli dei secondi messaggeri), con potenziali applicazioni terapeutiche. Il progetto è coordinato dall’Unità I, che si occuperà in primo luogo di sviluppare nuove sonde fluorescenti per indagare l’eterogeneità subcellulare dei livelli dei secondi messaggeri in cellule vive. Saranno create nuove sonde indirizzate alla membrana mitocondriale esterna (per Ca2+ e cAMP) e al lume dei perossisomi (per il Ca2+), per acquisire una migliore comprensione dei ruoli funzionali che i microdomini di questi secondi messaggeri ricoprono nella fisiologia degli organelli. Gli esperimenti dell’Unità saranno anche focalizzati sullo studio del ruolo dell’eterogeneità dei secondi messaggeri nella fisiopatologia di due sistemi modello, miociti cardiaci e neuroni sensoriali olfattivi in coltura.

L’Unità II continuerà la collaborazione con l’Unita I nello sviluppo di nuovi hardware e software per l’analisi dei segnali fluorescenti nelle cellule vive. L’Unità ha sviluppato un prototipo funzionante di una nuova piattaforma di formazione di immagini confocali. L’Unità II >>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Tullio Pozzan Università degli Studi di PADOVA

Obiettivo del Programma di Ricerca

L’obiettivo di questo progetto è riunire cinque gruppi per studiare in modo integrato alcuni processi chiave delle vie di segnale controllate dal Ca2+ (e quindi IP3, cADPR e NAADP), cAMP e cGMP (e quindi NO).
Per quanto riguarda l’Unità I, saranno perseguiti quattro obiettivi : i) identificare il meccanismo del rapido ingresso di Ca2+ nei mitocondri nelle cellule vive, affrontando in termini quantitativi la localizzazione e la grandezza dei microdomini ad alto Ca2+ responsabili del fenomeno; ii) sviluppare nuove sonde, ingegnerizzate a livello molecolare, per studiare in cellule vive il ruolo svolto dai perossisomi nell’omeostasi cellulare del Ca2+. Fino ad ora, si ignora se, e come, questi organelli partecipino al controllo del Ca2+ cellulare; iii) determinare il meccanismo attraverso il quale diversi agenti che influiscono sulla via del Ca2+ portano all’ipertrofia in cellule cardiache in coltura; saranno indagati il ruolo delle oscillazioni e degli sparks di Ca2+ nel controllo dell’ipertrofia; iv) determinare l’esistenza e l’importanza di gradienti subcellulari di cAMP, in particolare nella regolazione della forma e delle funzioni dei mitocondri e nella fisiologia dei neuroni olfattivi. L’Unità del coordinatore utilizza strumenti e tecniche che sono ben collaudate dal gruppo da parecchi anni e trarrà vantaggio da una stretta collaborazione con l’Unità II di questo progetto per l’indagine ad alta risoluzione della distribuzione subcellulare dei secondi messaggeri. >>>

Risultati parziali attesi

I risultati da ottenere all’interno di questo progetto sono stati descritti in dettaglio sia nelle applicazioni delle singole Unità sia negli altri paragrafi del progetto. Qui ci limiteremo ad un breve riassunto dei risultati che ci aspettiamo di ottenere e delle possibili applicazioni di alcuni di loro.
Per chiarezza, il riassunto dei risultati sarà descritto separatamente per ciascuna unità, ma è chiaro che, almeno per alcuni di loro, l’interazione tra le Unità è essenziale (come descritto sopra).

Unità I
1. Entro la fine del progetto prevediamo di generare i seguenti nuovi costrutti di cDNA:
a) Quattro nuovi indicatori fluorescenti per il Ca2+ con differenti affinità per il Ca2+, basati su dei cameleons modificati e indirizzati al lato citosolico della membrana mitocondriale esterna. Non esistono, al momento, sonde di questo tipo, che saranno di valore inestimabile per studiare nelle cellule la generazione di microdomini di Ca2+ vicino agli organelli, come anche per studiare la modificazione dinamica della membrana mitocondriale esterna nelle cellule.
b) Due nuovi indicatori fluorescenti per il Ca2+ con differenti affinità per questo ione indirizzati al lume dei perossisomi.
c) Due nuovi indicatori fluorescenti per cAMP indirizzati alla membrana mitocondriale esterna.
Stiamo considerando la possibilità di brevettare questi costrutti. Utilizzando questi strumenti ci aspettiamo di ottenere nuove informazioni sulla >>>

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Mentre nel corso dell’evoluzione la dimensione delle singole cellule non è cambiata significativamente in milioni di anni, quella degli organismi è aumentata di oltre 6 ordini di grandezza e i segnali che all’inizio dovevano essere scambiati su brevi distanze, negli organismi complessi si devono trasmettere a distanze di milioni di diametri cellulari. A questo scopo si sono evolute strutture specializzate come le fibre nervose e il sistema vascolare che distribuisce i nutrienti attraverso l’organismo e che è stato impiegato anche per il trasporto di messaggi specifici in forma di peptidi, ormoni, etc. Nella cellula recettrice i messaggi extracellulari arrivano su specifiche antenne, i recettori, per la gran parte situati sulla superficie esterna della membrana plasmatica, i quali a loro volta hanno la capacità di decodificare il segnale in un messaggio semplice che sarà trasmesso nella cellula e quindi modificherà l’attività di quest’ultima.
La complessità dei segnali extracellulari contrasta con la relativa semplicità dei principi di segnalazione intracellulare, mediati soprattutto o dalla generazione di alcune piccole molecole chiamate secondi messaggeri o dal controllo diretto di cascate enzimatiche (fosforilazione).
Le cellule inoltre scambiano secondi messaggeri attraverso strutture intercellulari specializzate, le così dette “gap junction”, ampi canali che connettono due cellule e sono permeabili a ioni e molecole sino ad alcune migliaia di Dalton (Sohl >>>