RICERCA ITALIANA     

Caratterizzazione molecolare di cromosomi double minutes/homogeneously staining regions nei tumori solidi.

Università degli Studi di Bari

Abstract

== NOTA BENE ==

Al progetto di ricerca presentato afferisce una singola unità operativa, per le motivazioni di seguito esposte.

La disponibilità di denaro destinata ai finanziamenti per la ricerca in Italia è purtroppo davvero limitata. Ciò comporta la necessità, da parte di un giovane ricercatore, di doversi avvalere del supporto economico del gruppo di appartenenza per diversi anni.
Il gruppo del Prof. Rocchi ha recentemente orientato la sua attività di ricerca verso lo studio delle implicazioni evolutive sull’organizzazione genomica. Questo tema risulta relativamente distante dagli obiettivi della mia attività di ricerca che, al contrario, è incentrata sull’indagine genetica/citogenetica nel campo dei tumori solidi ed ematologici, come si può comprendere dall’analisi della mia produzione scientifica.
Pertanto, il progetto qui presentato rappresenterebbe una richiesta di fondi finalizzata all’inizio di una attività di ricerca indipendente, in grado di coinvolgere altri gruppi negli anni futuri.
L’assenza di altre Unità Operative fa sì che il modello A, relativo al suddetto progetto, si riferisca al lavoro sperimentale descritto nel modello B.
Quindi utilizzerò il modello A per descrivere le strategie sperimentali che saranno descritte in dettaglio nel modello B.

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I cromosomi double minutes (dmin), ad anello, giganti e le regioni omogeneamente colorate (hsr) rappresentano i >>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Clelia Tiziana Storlazzi Università degli Studi di BARI

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il nostro progetto mira ad investigare la struttura genomica, il profilo di espressione genica e i possibili meccanismi di formazione dei cromosomi dmin/strutture hsr.
Per questo scopo, abbiamo preliminarmente selezionato sedici linee cellulari di tumori solidi (due carcinomi del colon, otto neuroblastomi e sei microcitomi polmonari), che mostrano amplificazioni degli oncogeni MYC (8q24) o MYCN (2p24) sotto forma di dmin e/o hsr nelle loro cellule.

Il nostro progetto si propone di raggiungere i seguenti tre obiettivi:

I) Caratterizzazione molecolare della struttura degli ampliconi e loro organizzazione all’interno di strutture hsr/dmin;

Utilizzando un approccio combinato di oligo array-CGH, ibridazione in situ fluorescente (FISH) e Real-Time PCR Quantitativa, intendiamo determinare la localizzazione dei punti di rottura degli ampliconi presenti nei dmin/strutture hsr.
I risultati del procedimento di mappatura riveleranno l’eventuale presenza di “regioni calde” per le rotture del DNA a doppio filamento (DSB) all’interno delle bande 8q24 e 2p24, in modo da spiegare la ragione per cui queste due bande cromosomiche risultino così soggette ad amplificazione nei tumori solidi. Difatti, regioni che individuino punti di rottura ricorrenti potrebbero rivelare la presenza di siti fragili o altri domini genomici o cromatinici che possano andare incontro a rottura cromosomica più frequentemente di altri siti nel genoma umano >>>

Risultati parziali attesi

Come precedentemente esposto, si sa molto poco riguardo i possibili meccanismi alla base delle amplificazioni genomiche nei tumori, così come sull’impatto dell’incremento nel numero di copie sul pattern di espressione di oncogeni.
Per fornire nuovi dati sui meccanismi di amplificazione e sui profili di espressione genica nei tumori in studio, intendiamo:

1) caratterizzare in dettaglio la struttura di dmin/hsr, focalizzandoci sull’architettura dell’amplicone “ancestrale” e sull’arrangiamento reciproco degli ampliconi;
2) determinare la localizzazione delle regioni hsr, in modo da rivelare una possibile diversa propensione sito-specifica ad amplificare nel genoma umano;
3) investigare il possibile stato di attivazione di putativi oncogeni che mappino all’interno delle regioni amplificate identificate.

Per questo studio pilota abbiamo deciso di utilizzare linee cellulari di tumori solidi come materiali di partenza, anzichè tumori primari, per poter usufruire della maggiore disponibilità di materiale necessaria per la preparazione di metafasi (per scopi di citogenetica molecolare) e per l’estrazione di DNA e RNA (per studi molecolari).

Risultati attesi:

1) Basandoci sui risultati ottenuti dal nostro gruppo nei pazienti affetti da leucemia, abbiamo ipotizzato che i dmin fossero formati conseguentemente ad amplificazione di una molecola di DNA “episomica”, generata in seguito ad escissione dalla sua >>>

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Nota: lo “stato dell’arte” sotto riportato è identico a quello riportato nel modello B relativo al suddetto progetto, dal momento che ad esso afferisce un’unica unità operativa.


La presenza di anomalie cromosomiche è un tema comune nel processo di carcinogenesi. Un’ampia proporzione di tumori mostra infatti aberrazioni cromosomiche numeriche e/o strutturali. Queste ultime includono amplificazioni di DNA, spesso accompagnate dall’overespressione di taluni oncogeni. L’amplificazione può realizzarsi attraverso la formazione di double minutes (dmin) extracromosomici e regioni hsr intracromosomiche, presenti più frequentemente nei tumori solidi rispetto a quelli ematologici. L’amplificazione di alcuni oncogeni è associata a specifici tipi di tumori (Myllykangas, et al 2007) e può essere indicatrice di prognosi sfavorevole (Albertson 2006).
Nonostante la non trascurabile presenza di regioni hsr e dmin nei tumori umani, il meccanismo molecolare alla base della loro genesi rimane pressochè sconosciuto.
È ormai noto come il processo di amplificazione genica venga innescato da una rottura del DNA a doppio filamento (DSB) (Coquelle, et al 1997, Paulson, et al 1998) in cellule difettive di opportuni meccanismi di controllo del ciclo cellulare. L’attenzione di alcuni studi si è focalizzata su errori nella replicazione del DNA, conseguentemente al collassamento di forche replicative (Schimke, et al 1986), disfunzioni telomeriche o l’attivazione di siti >>>