RICERCA ITALIANA     

Sviluppo di biosensori elettrochimici di terza generazione basati su eme-proteine ingegnerizzate e sintetiche

Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia

Abstract

Questo progetto è dedicato allo sviluppo di interfacce biocatalitiche nano-strutturate formate da monostrati auto-assemblati di eme-proteine ancorate ad elettrodi solidi, da utilizzare per la realizzazione di biosensori di ultima (terza) generazione dedicati alla rivelazione e al dosaggio di analiti di interesse ambientale e clinico e per lo screening ad alte prestazioni di nuovi farmaci.
L’attività proposta è inserita nel settore emergente dell’elettronica bio-molecolare, nel quale le proprietà redox di molecole biologiche vengono sfruttate per la produzione di dispositivi di memoria massiva, transistor e biosensori che possono raggiungere livelli di efficienza, sensibilità e miniaturizzazione senza precedenti. I biosensori rappresentano il filone applicativo più promettente, grazie alle sconfinate opportunità offerte dal riconoscimento biomolecolare per la rivelazione di analiti in vitro e in vivo. La risposta in corrente (amperometrica) viene ottenuta dalla ossidazione/riduzione elettrocatalitica del substrato operata da enzimi immobilizzati sull’elettrodo. Le opportunità offerte dalla nano-fabbricazione di elettrodi aprono la strada per il biosensing di metaboliti in cellule viventi.
Nello specifico, l’attività proposta è centrata sull’utilizzazione di eme-proteine come componenti delle interfacce biocatalitiche in oggetto. Questa scelta è dettata dal fatto che il gruppo eme è in grado di catalizzare l’ossidazione/riduzione di una grande varietà di >>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Marco Sola Università degli Studi di MODENA e REGGIO EMILIA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il presente progetto propone lo sviluppo di eme-proteine ingegnerizzate e sintetiche per applicarle come componenti di interfacce biocatalitiche nanostrutturate in biosensori di terza generazione per la rivelazione ad alta efficienza e la determinazione quantitativa di chemicals e metaboliti di interesse ambientale (xenobiotici) e clinico.
La ricerca ha l’obiettivo di sfruttare le straordinarie potenzialità di riconoscimento molecolare e catalitiche delle eme-proteine, modulate su base razionale, per ottenere specie immobilizzate su elettrodi solidi in grado di fornire una risposta amperometrica quantitativa nei confronti di determinati bersagli molecolari. Il raggiungimento di questo obiettivo comporta l’articolazione della ricerca in una serie di direttrici che includono:
a) la comprensione delle basi molecolari di vari aspetti dei rapporti struttura-proprietà-funzione delle proteine in esame, che costituisce un prerequisito essenziale per:
b) la progettazione razionale di opportune modifiche strutturali per indurre, modulare e ottimizzare l’attività catalitica di specie ricombinanti attraverso tecniche di ingegneria genetica o guidare la sintesi nuove eme-proteine artificiali dotate di una funzione specifica;
c) ottenere l’immobilizzazione in condizioni non denaturanti di queste specie su elettrodi solidi attraverso la formazione di strutture nanometriche auto-assemblate che ottimizzino la risposta elettrochimica;
d) migliorare la >>>

Risultati parziali attesi

I principali risultati che prevediamo di conseguire sulla base delle conoscenze acquisite dai proponenti nei rispettivi settori di indagine e sulla base del potenziale umano disponibile e delle sinergie che si realizzeranno fra i gruppi di ricerca in termini di know-how scientifico e strumentazione disponibile, sono elencati di seguito.

1. Produzione di mutanti del cytP450 umano con una singola cisteina superficiale che, immobilizzati covalentemente in modo orientato su elettrodo d’oro, siano in grado di produrre correnti catalitiche nelle titolazioni con farmaci di diverse classi (antibiotici, antiinfiammatori, antidepressivi). I parametri di attività enzimatica KM e Vmax ottenuti forniranno importanti indicazioni sulla degradazione dei farmaci da parte del cytcP450.
2. Costruzione di microarrays contenenti le tre diverse isoforme di cytP450 umano immobilizzate su elettrodo d’oro per realizzare un metodo di screening ad alte prestazioni in grado di testare in modo efficace e veloce la detossificazioe dei potenziali nuovi farmaci nel fegato umano, facilitando così il processo di drug discovery nei primi stadi.
3. Produzione di mutanti del citocromo P450 BM3 da Bacillus megaterium che, immobilizzati su elettrodi d’oro, permettano di costruire un biosensore in grado di monitorare la presenza di inquinanti ambientali, con particolare riferimento ai PAH, con elevata sensibilità.
4. Produzione dei mutanti M80A e M80A/Y67H del citocromo c da >>>

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

I biosensori, intesi modernamente come dispositivi elettronici biomolecolari di rivelazione, costituiscono un’area di ricerca interdisciplinare in forte ascesa, che si posiziona all’interfaccia fra chimica, biochimica, fisica e nanotenologie [1, 2]. Un biosensore è, nella più ampia accezione del termine, uno strumento analitico che si basa su una biomolecola per il riconoscimento specifico dell’analita (tale biomolecola può essere un enzima, un recettore, un anticorpo o un antigene, un frammento di DNA) che comunica con un trasduttore di segnale che ha il compito di originare un responso misurabile proporzionale alla concentrazione dell’analita. I biosensori elettrochimici, che sfruttano il trasferimento elettronico fra la biomolecola ed un elettrodo solido per la trasduzione del segnale, costituiscono la più ampia e promettente categoria di biosensori in termini di facilità di costruzione, costi, versatilità, modulabilità e miniaturizzazione (fino a livello nanometrico) per applicazioni in vivo [1-6]. Il fattore chiave che ha segnato l’evoluzione di questi dispositivi negli ultimi anni è costituito dalla strategia utilizzata per ottenere una veloce comunicazione elettronica fra la specie biologica di riconoscimento (che opera la trasformazione ossido-riduttiva del substrato) e l’elettrodo solido. I dispositivi di prima e seconda generazione utilizzavano specie in soluzione, libere di diffondere, che agivano da “mediatori” dello scambio elettronico fra la biomolecola e >>>