RICERCA ITALIANA     

Un approccio multidisciplinare allo studio dell'aggregazione in vivo e in vitro di proteine contenenti tratti di poliglutammina. Ruolo dei fattori molecolari ed ambientali.

Università degli Studi di Milano-Bicocca

Abstract

Lo scorretto ripiegamento (misfolding) e l’aggregazione proteica sono alla base di malattie neurodegenerative gravi e diffuse, come le malattie di Parkinson, Alzheimer, le malattie prioniche, di Huntington e le atassie, per le quali non esiste alcuna cura. Lo sviluppo di possibili terapie è ostacolato dalla scarsa comprensione dei meccanismi molecolari che causano l’esordio e la progressione di queste "malattie conformazionali". Anche se l’accumulo di proteine nei tessuti sottoforma di fibrille amiloidi è l’elemento caratterizzante di queste patologie, è sempre più chiaro che gli agenti tossici sono gli intermedi oligomerici e protofibrillari del processo di aggregazione. La caratterizzazione di queste specie molecolari è resa difficile dalla loro breve vita e dalla eterogeneità, come pure dalla complessità dei fattori che influenzano le loro proprietà strutturali e biochimiche in vivo. Questo progetto si avvale di tecnologie molecolari e biofisiche avanzate per un'investigazione pluridisciplinare sui meccanismi aggregazione proteica in vitro ed in vivo. Ci occuperemo in particolare di proteine amiloidogeniche, soggette a misfolding e ad aggregazione in quanto contengono sequenze espanse di poliglutammine (polyQ). Esse sono la causa di un ampio gruppo di malattie neurodegenerative, fra cui la malattia di Huntington e l’atassia spinocerebellare di tipo 3 sono le più diffuse. Per questa ricerca utilizzeremo la huntingtina (htt) e la atassina-3 (AT3), assieme a >>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Paolo Tortora Università degli Studi di MILANO-BICOCCA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Questo progetto si propone di studiare i meccanismi molecolari alla base di 1) aggregazione di proteine contenenti poliglutammina (polyQ) 2) loro tossicità per cellule eucariotiche. Allo scopo di decifrare il meccanismo di aggregazione è essenziale capire la natura delle interazioni protein-proteina che mediano l’aggregazione, nonchè caratterizzare le specie molecolari aggregate mature e intermedie. Quest’ultime si pensa agiscano come fattori di nucleazione inducendo cambiamenti conformazionali e promuovendo la fibrillazione. Corrispondentemente, il goal 1 consiste di due principali obiettivi: 1.1) caratterizzazione delle regioni coinvolte nell’aggregazione e 1.2) caratterizzazione strutturale dei diversi stati di aggregazione. Per affrontare il tema della tossicità delle proteine polyQ in vivo, proponiamo di usare, da un lato, il lievito come sistema modello eucariote facile da manipolare e ingegnerizzare e, dall’altro lato, colture cellulari umane che permettano di avvicinarsi il più possibile alle condizioni fisiologiche. Quindi, il goal 2 implica due obiettivi: 2.1) studi sulla tossicità in Pichia pastoris e 2.2) studi sulla tossicità in cellule di neuroblastoma umano. I punti specifici che compongono questi obiettivi sono indicati di seguito. Per ciascuno di questi problemi, intendiamo studiare l’effetto di metalli dal momento che essi sembrano avere un ruolo importante nella modulazione dell’aggregazione e tossicità delle proteine amiloidogeniche in generale. Quindi >>>

Risultati parziali attesi

RISULTATI DI RILEVANZA TEORICA

1) Identificazione delle sequenze proteiche che favoriscono o che ritardano l’aggregazione, con particolare attenzione agli effetti sulla aggregazione delle proteine polyQ.

2) Caratterizzazione della struttura delle forme di aggregazione più precoci ed intermedie del processo, e della cinetica della loro comparsa.

3) Caratterizzazione strutturale ad alta risoluzione delle fibrille amiloidi mediante AFM e STM.

4) Caratterizzazione delle superfici di interazione all'interno delle fibrille, da effettuarsi mediante MS e tecniche ad essa correlate.

5) Approfondimento della comprensione dei meccanismi di tossicità cellulare di diverse proteine polyQ. Si studieranno in cellule di E. coli, di lievito e di neuroblastoma, sia proteine naturali sia costrutti artificiali contenenti espansioni di polyQ.

6) Identificazione dei metalli che stimolano l’aggregazione ed il loro meccanismo di azione a livello molecolare e cellulare.

RISULTATI DI RILEVANZA BIOMEDICA

1) Una comprensione approfondita dei meccanismi di aggregazione potrebbe contribuire ad caratterizzare i passaggi che conducono alla comparsa delle specie più tossiche le quali, in base alle conoscenze attuali, compaiono probabilmente nelle fasi iniziali del processo. A loro volta queste conoscenze dovrebbero aprire la strada allo sviluppo di metodi di screening volti a >>>

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Molte malattie neurodegenerative sono associate a “misfolding” e aggregazione proteica, con formazione di depositi amiloidi in diverse zone del cervello. Questi depositi presentano aspetto fibrillare, colorazione e birifrangenza da rosso Congo e una tipica struttura beta. Si ritiene che tali “malattie conformazionali” abbiano meccanismi comuni a livello molecolare e, di conseguenza, caratteristiche cliniche ed istologiche simili [Chiti and Dobson (2006) Annu Rev Biochem 75, 333-366]. Sono comprese in questo gruppo la malattia di Alzheimer, di Parkinson, le malattie prioniche, la malattia di Huntington e altre malattie da polyQ. Le protofibrille, aggregati quasi sferici o tubulari con un diametro di 2.5-5.0 nm e un alto contenuto di foglietto beta, compaiono per prime nel processo che porta alla formazione delle fibrille amiloidi da proteine “misfolded”. In genere sono precursori di protofilamenti più lunghi e fibre mature. E’ probabile che le specie maggiormente tossiche siano proprio gli aggregati prefibrillari (protofibrille) piuttosto che le fibrille mature [Dobson and Stefani (2003) Mol Med 81, 678-699]. Le malattie da polyQ sono accomunate da molte caratteristiche cliniche ma ognuna di esse interessa una diversa area cerebrale. Tutte queste malattie sono causate da una proteina che, nella sua forma patologica, porta un tratto ininterrotto di polyQ la cui lunghezza eccede una soglia che tipicamente consiste di 40 residui consecutivi. E’ noto da tempo che il misfolding di >>>